JurnalAnalisis Farmasi dan Biomedis

24(2001)1005–1010
www.elsevier.com/locate/jpba

Validasi metode HPLC untuk kuantifikasi

ambroxolhydrochloride dan benzoicacidinasyrupas
bentuk farmasistresstestforstabilityevaluasi
MaaritHeinanenSebuah
,KarangBarbasb,*
Sebuah
Laboratorium Kimia Analitik, Universitas Helsinki, Helsinki, Finlandia
b FacultaddeCCExperimentalesyTecnicas,Uni6ersidadS.Pablo-CEU,UrbanizacionMonteprıncipe,Ctra.BoadilladelMonte,

km5.328668Madrid,Spanyol

Diterima16Mei2000;diterimadalamformulir yang direvisi24Oktober2000;diterima27Oktober2000

 Abstrak

Dideskripsikan untuk ambroxol, trans-4-(2-amino-3,5-dibromobenzylamino)sikloheksanolhidroklorida, dan

pemisahan asam benzoat oleh HPLC dengan deteksi UV pada 247nminasyrupapresentasi farmasi.Optimal
kondisi adalah: KolomSymetriShieldRPC8,5mm250x4.6mm,danmetanol/(H 3PO 4 8.5mM/trietilamina
pH=2.8)40:60v/v.Validasi dilakukan dengan menggunakan standar dan sediaan farmasi yang mengandung
senyawa yang dijelaskan di atas.Hasil dari kedua standar dan tanpa sampel menunjukkan parameter validasi yang sesuai.
zat kelas farmasi diuji oleh faktor-faktor yang dapat mempengaruhi stabilitas kimia. Reaksi ini
campuran dianalisis untuk menilai kemampuan metode pemisahan produk degradasi.
produk tidak mengganggu penentuan zat yang diuji oleh pengujian.©2001ElsevierScienceB.V.
Seluruh hak cipta.

Kata kunci: Ambroxol; Asam benzoat; HPLC; Sirup; Farmasi

 
1. Perkenalan metil-(2-amino-3,5-dibromobenzil)amina hidro-
klorida.Ambroxol merangsang transportasi
Ambroxol,trans-4-(2-amino-3,5-dibromoben- sekresi kental dalam organ pernapasan
zylamino)sikloheksanolhidroklorida,isacom- dan mengurangi kemandekan sekresi.
pound dengan aktivitas mukolitik yang kuat, untukBenzoicacidisanantimicrobialpreservativefre-
itu
digunakan sebagai ekspektoran dan bronkosekretolitik
sering termasuk dalam bentuk farmasi cair.
interapeutik[1,2].Secara farmakologis Gambar 1 menunjukkan struktur kimia ambroxol
metabolit aktif dari bromheksin, N-sikloheksil-N- dan asam benzoat dengan pkSebuah
. mereka
Ambroxolhydrochloride dapat ditemukan di
  *Penulis yang sesuai.Faks:+34-91-3510475. sediaan maceutical seperti tetes, butiran,
Alamat email:cbarbas@ceu.es(C.Barbas). suntikan, sirup, dan tablet. Beberapa berbeda

0731-7085/01/$-seefrontmatter©2001ElsevierScienceB.V.Allrightsreserved.
PII: S0731-7085(00)00533-1

M.Heinanen,C.Barbas/J.Pharm.Biomed.Anal.24(2001)1005–10101006

metode telah digunakan untuk penentuan individu2. Percobaan

minationofambroxolhydrochlorideinpharma-
solusi ceuticalsand tablettermasukTLC[3,4], 2.1. Analisis instrumentasi dan kromatografi
spektrofotometri [2], HPLC [5], oowinjeksi
[6,7]danelektroforesis kapiler[8].Selengkapnya ABeckman(PaloAlto,USA)HPLCsystem
plexmethodstelah dilaporkan untuk ambroxol dilengkapi dengan126pompa,injektor otomatis
determinasi dalam cairan biologis[1,2,8,9]. (507e),a168DiodeArraydetectorandaEmas
Tak satu pun dari mereka menggabungkan analisis asam tunggal
Pemroses data sistem digunakan.
dan senyawa dasar dan hanya satu dari mereka[8]memilikiha
analisis grafis dilakukan pada 5mmSim-
telah diterapkan pada sirup, yang memiliki masalah kolom metryShieldRP8(Waters)(25×0.46cm)
karena adanya eksipien, stabilisator dan keepinaBioradcolumnovenat35 °C.
zat makanan. Selanjutnya, kapiler Eluenthadafllaju aliran1ml/mindan
elektroforesis bukan teknik rutin fase gerak yang memberikan hasil terbaik adalah
kontrol kualitas farmasi dan validasi penuh metanol/(H 3PO4 8.5mM/trietilaminepH=
parameter tidak disajikan dalam makalah ini. 2.8) 40:60v/v.Deteksi dilakukan pada 247
Karena sifat asam-basa perangkat lunak nmandpeak diidentifikasi dengan waktu retensi
pound di sini dianalisis, pemisahan sangat ditentukan-
dibandingkan dengan standar dan dikonfirmasi dengan
pendentofpH, sehingga efek dari variabel ini memiliki
karakteristikspektramenggunakanfotodiodearray
telah dipelajari.Dua jenis alat tulis yang berbeda detektor.
fase-fase yang diuji serta strategi yang berbeda
untuk menghindari tailinginpeaks:changesinpHofmobile
fase atau penambahan pengubah. 2.2.Reagen
Setelah mengoptimalkan pemisahan, metode
divalidasi untuk standar dan sirupofaphar- Semua pelarut adalahHPLCkualitas kelaspur-
sediaan maceuticalmengandungsub- dikejar dari Scharlau (Barcelona, ​Spanyol). Jenderal
sikap dengan menentukan linearitas, presisi, dan reagen berasal dari Merck (Darmstadt, Jerman)
akurasi. Secara bersamaan, metode ini bisa dan standarofambroxolhydrochloride,ben-
digunakan untuk pengujian stabilitas, standar danzoicacid,
sampel sirup yang mengandung bahan aktif ini
ditundukkan pada kondisi degradasi yang dihentikan pound, ambroxolcinfa15mg, dan semua
bahwa tidak ada gangguan yang muncul. komponen tempat bower yang disediakan oleh Lab-
oratoriosCINFAS.A.(Pamplona,Spanyol).

2.3.Metode

Fase gerak terdiri dari buffer berair–

metanol pada proporsi 60:40. Penyangga
di i k d 8 5 3MH
PO4 d Di ik l h

Gbr.1.Struktur kimia kedua analit:(a)ambroxol
hidroklorida;(b)asam benzoat.
disiapkan dengan 8.5mMH
3PO 4 danpDisesuaikan oleh
menambahkan trietilamina. NilaipH yang diuji adalah
rentang kerja yang direkomendasikan untuk
kolom (dari 2,5 hingga 7,5) dan diukur
semua contoh sebelum judul metanol.
Untuk optimasi, solusi contoh adalah:
siap melarutkan analit di dalam ponsel
faseuntukmemberikankonsentrasi0.3mg/mlam-
broxolhydrochlorideand0.2mg/mlbenzoicacid.
Volume injeksi adalah50mluntukmenghasilkanmemadai
Respons UV untuk mendeteksi produk degradasi
saat ada.

M.Heinanen,C.Barbas/J.Pharm.Biomed.Anal.24(2001)1005–10101007

2.4.Validasi

Setelah kondisi kromatografi ditetapkan

dilakukan, validasi metode dilakukan mengikuti
ingICHspesifikasi[10,11].Standar dan
sampellinier diverifikasi dengan analisis dalam rangkap tiga
kategori lima titik dalam kisaran 0,15–0,45
mg/mlforambroxolhydrochloridedan0,10–0,30
mg/ml untuk asam benzoat yang sesuai dengan
50–150% dari nilai sampel yang diharapkan.
Pemulihan dievaluasi dengan sama
metode dengan membandingkan konsentrasi yangGbr.2.Kromatogram
dihitung standar:(a)benzoat
konsentrasi dan konsentrasi yang terukur. acid2.45minandambroxolhydrochloridet=12.56 menit, dan
Pengulangan instrumental dan menengah plasebo;(b)Kondisi:SymmetryShieldRP8column,aceto-
presisiditentukan dengan pengolahan dua- nitril/(H 3PO 4 8.5mM/tryethylaminepH=2.8)40:60v/v,
laju aliran 1ml/min dan deteksi UV pada 247nm.
riesofinjections dari standar yang sama, benar
berespons ke titik tengah dalam rentang linieritas, pada 2
3. Hasil dan Pembahasan
hari yang berbeda. Reatabilitas dan presisi menengah
sion dari metode yang diterapkan pada produk akhirAda adalah
banyak cara yang mungkin untuk menekan
ditentukan dengan memproses dua seri 10sam- interaksi residu silanol dalam silika-gel
mohon, disiapkan seperti yang dijelaskan di bawahpermukaan
ini, pada 2 dengan
berbedabasacanalit, yang sering menyebabkan
hari dan dengan standar yang sesuai untuk untuk pemisahan yang lebih rendah karena tailing dari
kuantifikasi. puncak.Reduksi ionisasi asamSiOH
Perlakuan sampel: 2.9081gofsamplewere situsdenganmenggunakanmobilephasesoflowpH
tertimbang volumetrik askof25mland (pHB4) atau, sebaliknya, penurunan ionisasi
diselesaikan menjadi volume dengan fase gerak. sampel dasar dengan meningkatkan pHofthe
plesdifiltermelalui membran nilon mobilephaseadalahmetode termudah.Otherap-
0.45mm dari ukuran pori sebelum melewati injeksiin proachestakeadvantageoftheadditionof
botol. 'silanolblocker' [13], egtriethylaminetothe
fase gerak dan ini terbukti menarik
2.5.Percepatan degradasi untuk mengizinkan tambroxolelution dalam pekerjaan ini.
Pengoptimalan dimulai dengan fase gerak
ofphosphatebuffer8.5mMpH6.5/ACN60:40
Pengujian stabilitas[12]dilakukan untuk memastikan bahwa
(v/v),pH6.5dicapai dengan trietilamina.Ini
produk obat tidak terdegradasi sampai terjual habis
nilai dipilih karena dianggap
tanggal telah kedaluwarsa.Metode analitis
mengkompromikan senyawa asam dan basa.
digunakan untuk pengujian stabilitas harus dapat dipisahkan
Namun, dalam kondisi ini ditumpangkan
menilai produk degradasi dari yang aktif
kromatogram menunjukkan bahwa placebointer-
zat. fered dengan standar benzoicacidascanbe
Kondisi degradasi meliputi hal-hal berikut: terlihat pada Gambar.2.Pengoptimalan dilanjutkan oleh
media asam dengan buffer fosfat0.2M,pH= mengubah jumlah facetonitriloandthepH
1.0;air;media dasar dengan Na 2HPO 4 0.4M penyangga serta penambahan tetrahidrofuran.
pH = 8,9 dan media pengoksidasi dengan 2HAI
0,3%
2.Di H Senyawa terakhir ini dapat mempengaruhi selektivitas
semua kasus1%(w/v)daristandaratausampel adalah ester yang muncul di plasebo. Namun demikian,
dipanaskan dalamautoklafuntuk1hat120°C.Pengenceran tidak satu pun dari perubahan ini yang cukup baik untuk didapatkan
dilakukan untuk mencapai konsentrasi yang samaresolusi
seperti yang memadai antara perbedaan
penilaian. komponen.

M.Heinanen,C.Barbas/J.Pharm.Biomed.Anal.24(2001)1005–10101008

Subyek lain untuk mempertimbangkansol organikFase diam dengan hidrofobisitas lebih rendah
vent bekerja difase mobil.Kehadiran andsilanolactivity(SymmetryShieldRP8) adalah
metanol dalam campuran memiliki pengaruh yangdipilih kuat untuk mengurangi petunjuk interaksi sekunder-
dalam pemisahan kedua penyangga dan ke dalam faktor-faktor puncak dan kapasitas yang lebih tinggi
zat terlarut dasar.Konten metanol dalam ponsel untuk senyawa dasar.
fase juga berpengaruh pada karakteristik retensi DorseyandCooper[15]menunjukkan gulungan
ticsofbasicssolutes,[13]. Jadi, langkah selanjutnya adalah
fase diam dalam kromatografi fase terbalik
ubah asetonitrilotometanolandanalysethe phy,sebagaifungsikepadatanrantaidanitu
standar dan placebo lagi dengan jenis yang berbeda kekuatan pendorong utama dalam perhatian
fase gerak, perubahan pH Hofthephosphate perubahan dari mekanisme piktoanentropik
bufferdanjumlahMeOH.Terbaik nism.SymmetryShieldwitha15.0% beban karbon
hasil, Gbr.3, diperoleh dengan berikut ini: dan C8 diharapkan memiliki densitas yang lebih tinggi
fase gerak: H 3PO 4 8.5mMpH2.8 (dengan chainsthanNovaPakwitha7,3% karbon dan
trietilamina)/MeOH=60:40. C18.
Urutan elusi dari ambroxolhydrochloridedan Kondisi akhir untuk metode mana
asam benzoat diubah denganpHinthemobile divalidasi adalah: kolom SymmetryShieldRP8,
fase.Abasiccomound,asambroxolhydro- dan metanol/(H 3PO4 8.5mM/trietilamina
klorida, lebih tertahan dalam RHPLCinits pH=2.8)40:60v/v.
bentuk molekuler atau terionisasi, yaitu dengan lebih tinggi
Hasil validasi muncul diTabel1.Keduanya
nilai pHdalamfase gerak.Kebalikannya dardsandsamplesshowalinearitas yang baik untuk
terjadi dengan asam benzoat dan itulah penyebabnya dua analit dengan koefisien korelasi lebih dari
theelutionorderchangesobservedbetweenpH=
0 999 RSDk i i b ki 0 6d 0 7
6.5dan2.8.
Meskipun pengujian pengembangan awal adalah
dilakukan dengan kolom yang dijelaskan sebagai memiliki
hidrofobisitas menengah dan silanolaktivitas,
sebagaiNovaPakC18,SymmetryShieldRP8column
ditolak karena itu salah satu yang terendah
hidrofobisitas dan silanolaktivitas, andithad
terbukti memiliki perilaku yang lebih baik dengan yang dapat diubah
senyawaasseeinpekerjaan sebelumnyasinthelabo-
rasional[14].
Gbr.3.Kromatogram standar:(a)am-
broxolhydrochloride7minandbenzoicacid14,45 menit, dan
plasebo;(b)Kondisi:SymmetryShieldRP8kolom,
metanol/(H 3PO 4 8.5mM/tryethylaminepH=2.8)40:60v/v, berespon dengan waktu retensi asam benzoat,
laju aliran 1ml/min dan deteksi UV pada 247nm.
M.Heinanen,C.Barbas/J.Pharm.Biomed.Anal.24(2001)1005–10101009
Tabel 1
Ringkasanparameter validasi metode Sebuah
 
Linearitas dan rentang bahan baku
produk akhir linieritas dan rentang
Produk akhir presisiRSD (%)
Instrumental
metode
akurasi bahan baku
produk akhir akurasi
  Sebuah
a,cegat;b,kemiringan;CL,batas keyakinan.
Gbr.4.Kromatogram:(a)asam benzoat;dan(b)plasebo
(kondisi afterstressinthemedianetral).Kondisi:
SymmetryShieldRP8column,methanol/(H 3PO 4 8.5mM/
tryethylaminepH=2.8)40:60v/v,fllowrateof1ml/minand
Deteksi UV pada 247nm.
tions. Namun demikian, daerah puncak di
plasebo hanya 1,2% dari puncak asam benzoat.
Gbr.4 termasuk kromatogram kedua
zat.
Kesimpulan, metode yang dipelajari tidak cocok
pemisahan, kuantifikasi dan pengujian stabilitasst
M.Heinanen,C.Barbas/J.Pharm.Biomed.Anal.24(2001)1005–10101010
[6]T.Perez-Ruiz,C.Martinez-Lozano,A.Sanz,MTSan
Miguel,Talanta43(1996)1029–1034.
[7]P.Benli,M.Tuncel,Pharmazie3(1998)203.
[8]T.Perez-Ruiz,C.Martinez-Lozano,A.Sanz,E.Bravo,J.
Chromat.BBiomed.Sci.Appl.692(1997)199–205.
[9]MHBotterblom,TJJanssen,PJGuelen,TBVree,J.
Chromat.421(1987)211–215.
[10]ICH,ICHPedomanTripartitTerharmonisasiLangkah4,
0.999;RSDkemiringanberkisarantara0.6dan0.7
untuk dua senyawa dalam standar dan sampel
menunjukkan kecocokan poin individu
garis regresi. Ambroxolhydrochloride, yang
memiliki nilai eksperimen yang lebih kecil daripada yang ditabulasi
(P=95%)tidak menunjukkan bias yang signifikan.On
Di sisi lain, benzoicacidhasaneksperimental
tvaluesuperiortothetabulatedsatu(2.160for
n−2=13danP=95%). Ini disajikan secara statistik
bias signifikan yang tidak banyak mempengaruhi
konsentrasi yang ekstrim, ini terutama disebabkan oleh
kecocokan titik yang baik dalam garis regresi
konsentrasi terkecil kesalahannya hanya 1,7%.
Pemulihan adalah100%90.93forambroxoland
100% 91,38untuk asam benzoat dalam bahan baku dan
101%91.42dan100%91.76di farmasi
ticalform.MaximumRSDinprecisionwas0.9
untuk presisi menengah dari ambroxol.
Kaitannya dengan percepatan degradasi,
hasil menunjukkan bahwa, ketika masing-masing diuji
zat dikomposkan dengan tes stres,
produk penguraian tidak mengganggu
penentuan zat utama, ex-
ceptforasmallpeakintheplaceboinneutral
media(tr =13.8danarea0.12631).Kali ini cor-
(tr =13.9danarea10.29446)dalam kondisi yang sama
a9C.L.b9C.L.rRange
0.795.511179170.99970.15–0,45mg/mlAmbroxol
24971752935Benzoicacid0.1–0.3mg/ml0.9995
2991126927Ambroxol50–150%0,9992
1791117989520.998850–150% Asam benzoat
Ketepatan MenengahPengulangan
Hari2Hari1+2Hari1
0.430.46Ambroxol0.44
0.440.800.30 Asam benzoat
0.860.900.80Ambroxol
0.710.59 Asam benzoat 0,54
RSD(%)Pemulihan Rata-rata(%)
0.93100Ambroxol
1.38 Asam benzoat100
1.43Ambroxol101
1.76100 Asam benzoat
dari ambroxolandbenzoicacidinthepharmaceuti-
persiapan.
Ucapan Terima Kasih
Studi saat ini telah diwujudkan dengan kolaborasi
orasi CINFAS.A.
Referensi
[1]M.Nobilis,J.Pastera,D.Svoboda,J.Kvetina,J.Chro-
mat.581(1992)251–255.
[2]G.Indrayanto,R.Handajani,J.Pharm.Biomed.Anal.
11(1993)781–784.
[3]G.Musumarra,G.Scarlata,G.Cirma,G.Romano,S.
Palazzo,S.Clementi,G.Giulietti,J.Chromat.350(1985)
151–168.
[4]G.Musumarra,G.Scarlata,G.Romano,G.Cappelo,S.
Clementi,G.Giulietti,J.Anal.Toxicol.11(1987)154.
[5]V.Brizzi,U.Pasetti,J.Pharm.Biomed.Anal.8(1990)
107–109.
[12]WolfgangGrimm,D-Biberach/Rib,in:W.Grimm,K.
Krummer(Eds.),Pengujian stabilitas di EC,Jepangdan
AS,ScientificandRegulatoryRequirements191,
Asosiasi Internasional untukTeknologi Farmasi,
PaperbackAPVed., Stuttgart, 1993.
[13]D.Sykora,E.Tesarova,M.Popl,J.Chromat.A758
(1997)37–51.
[14]C.Barbas,A.Garcıa,L.Saavedra,M.Castro,J.Chro-
 p g J
(1996). mat.A870(2000)97-103.
[11]ICH,ICHPedomanTripartitTerharmonisasiLangkah3, [15]JGDorsey,WTCooper,Anal.Chem.66(1994)857A–
(1996). 867A.