15 Jurnal Mikrobiologi

Umum (1979), 114, 15-25. Dicetak irz Inggris

Penerapan Agarose Gel Elektroforesis ke Karakterisasi Plasmid DNA di resistan

terhadap obat Enterobacteria
Dengan GERALDINE A. WILLSHAW, HR SMITH
DAN

ES ANDERSON * enterik Laboratorium Referensi, Layanan Laboratorium Kesehatan Masyarakat, Colindale

Avenue, London NW9 5HT
(Diterima 2 1 November 1978; direvisi 16 Februari 1979)
Sebuah metode gel elektroforesis sederhana telah dijelaskan untuk mendeteksi DNA plasmid pada bakteri (Meyers
et al, 1976).. Kami diselidiki lebih lanjut masalah yang dihadapi dalam menggunakan metode ini untuk analisis
plasmid di strain enterobacterial liar. Migrasi sirkuler terbuka dan DNA plasmid linier diperiksa, karena bentuk ini
kadang-kadang menyebabkan kesulitan dalam penafsiran isi plasmid strain uncharacterized. Elektroforesis pada
konsentrasi agarosa yang berbeda dipekerjakan untuk menyelesaikan jelas plasmid DNA dari fragmen DNA
kromosom pada persiapan mentah. Disosiasi beberapa plasmid terjadi pada Salmonella typhimurium, dan ini
terdeteksi dengan elektroforesis. Teknik ini diterapkan untuk mempelajari obat-resistan S. typhimurium fag tipe 208
dari beberapa negara Timur Tengah. Budaya membawa plasmid resistensi obat dari F, saya kelompok kompatibilitas,
dan setidaknya dua plasmid lain yang terdeteksi dan diidentifikasi dengan elektroforesis gel. Studi didukung dan
memperpanjang temuan genetik dan memberikan informasi tentang distribusi plasmid tertentu.
Studi epidemiologis PENDAHULUAN bakteri patogen memerlukan teknik
untuk identifikasi dan karakterisasi strain yang berbeda. Sifat penting, karena resistensi misalnya obat, sering
disandikan oleh plasmid dan ini dapat dipelajari oleh beberapa metode yang berbeda. Analisis genetik, seperti
kompatibilitas pengelompokan, telah banyak digunakan untuk mengklasifikasikan plasmid bakteri. Persamaan atau
perbedaan antara plasmid diidentifikasi dalam strain yang berbeda juga dapat dideteksi dengan karakterisasi
molekuler termasuk studi reassociation DNA.
Baru-baru ini, teknik elektroforesis gel agarosa telah diterapkan untuk mempelajari kovalen ditutup melingkar
(CCC) DNA plasmid (Meyers et al., 1976). Metode ini cepat, relatif murah dan secara teknis sederhana dan cocok
untuk pemeriksaan sejumlah besar kultur bakteri. Isi plasmid dari beberapa spesies bakteri telah diperiksa dengan
metode ini (Meyers et al, 1976;. Crosa et al, 1977.). Namun, ada keterbatasan dalam penerapan teknik ini dalam
studi epidemiologi yang penting untuk menentukan dengan pasti jumlah dan ukuran dari plasmid di strain liar yang
berbeda. Strain tersebut sering membawa sampai lima atau enam plasmid dari berbagai jenis dan ukuran. Kami telah
menyelidiki kondisi untuk elektroforesis gel dalam upaya untuk memperluas penggunaannya dalam analisis strain
liar. Secara khusus, kami telah mempelajari gangguan fragmen DNA kromosom dan bentuk beberapa DNA plasmid
dalam deteksi dan identifikasi plasmid.
Kami telah memeriksa beberapa strain yang resistan terhadap obat Salmonella typhimurium yang berasal di
beberapa negara Timur Tengah. Budaya semua membawa plasmid perlawanan dari F1me
*
Hadir alamat: 10 Rosecroft Avenue, London NW3 7QB. 0022-1287 / 79 / 0000-8469 $ 02.00 @ 1979
SGM
2 Download dari www.microbiologyresearch.org oleh
MIC
114
IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18
16
GA WILLSHAW, HR SMITH DAN ES ANDERSON

tabel 1. plasmid Standard

10-6 x
plasmid

*
Obat atau perlawanan lainnya? Penanda molekuler
berat $ Referensi ColEl colicin El NTPl6 AK 4,7 Fredericq (1 956)
5.7 Anderson et / a. (1977) NTP7 Assu 9,4 Smith et al. (1974) NTP14 A,
colicin El, EcoRI 11,4 Smith et al. (1976)
pembatasan dan modifikasi enzim NTP106 K 14,5 Laboratorium ini RP1 R 1
- 19K- AKT ACSSu 37-8 Datta et al. (1971)
54-2 Meynell & Cooke (1969) * 7 Plasmid dengan awalan NTP adalah
non-autotransferring.
Simbol untuk resistensi obat: A, ampisilin; C, kloramfenikol; K, kanamisin; S, streptomisin; Su, sulfonamid Molekuler;
Berat T, tetrasiklin.
ditentukan oleh mikroskop elektron di laboratorium ini.

Kelompok kompatibilitas (Threlfall et al, 1976;.. Anderson et al, 1977) dan plasmid lainnya coding untuk resistensi
obat. Plasmid hadir dalam strain ini telah terdeteksi pada gel dan jumlah dan ukuran dari plasmid hadir dalam
budaya dari negara-negara yang berbeda telah dibandingkan. Sebuah account awal investigasi ini telah diterbitkan
(Willshaw et al., 1977).
METODE strain bakteri dan plasmid. Tabel 1 daftar plasmid standar yang
digunakan dalam penelitian ini, penanda mereka relevan genetik, termasuk resistensi obat, dan berat molekul mereka seperti yang
ditentukan oleh mikroskop elektron. Ukuran plasmid digunakan dalam penentuan berat molekul tercantum dalam legenda angka.
Untuk persiapan DNA plasmid, plasmid yang bersangkutan biasanya diperkenalkan ke strain pembawa standar. Ini adalah
Escherichia coli K12 F- (= K12) atau turunan asam-tahan nalidiksat nya, dan garis S. typhimurium fag tipe 36, yang telah
kehilangan plasmid MPlO (Smith et al., 1973). Penerima regangan untuk percobaan transformasi adalah E. coli K12 C600.
Asal-usul dan sifat dari S. strain typhi- murium liar dari yang plasmid DNA disiapkan diberikan dalam Tabel 2.
Isolasi DNA sebagian purifiedplasmid. Plasmid pembawa strain E. coli K12, S. typhimurium tipe 36 atau liar S. typhimurium
ditumbuhkan dalam 50 sampai 200 ml kaldu nutrisi. Bakteri biasanya segaris dengan campuran Brij 58 dan natrium deoksikolat
(Clewell & Helinski, 1969); lisis dengan natrium dodesil sulfat (Guerry et ul., 1973) kadang-kadang digunakan untuk budaya S.
typhimurium. Prosedur Meyers et al. (1976) merupakan dasar untuk pemurnian parsial berikutnya DNA plasmid.
Persiapan DNA plusmid murni. Berlabel radioaktif plasmid DNA untuk mikroskopi elektron disiapkan seperti yang dijelaskan
oleh Willshaw et al. (1978). Jumlah besar DNA plasmid murni untuk elektroforesis diperoleh dari lysates dibersihkan dari strain
plasmid pembawa; plasmid DNA diendapkan dengan poli- etilena glikol 6000 dan dimurnikan dengan cesium klorida-etidium
bromida dye-apung kepadatan gradien sentrifugasi (Humphreys et al., 1975). 15 Agarose x 0,4 cm) gel yang elektroforesis
biasanya terkandung dari plasmid 0-75 DNA. % (W / v) Elektroforesis agarose (BDH adalah elektroforesis dilakukan di kelas
vertikal). gel slab (16 x Beberapa persiapan DNA plasmid dianalisis di beberapa konsentrasi agarosa, seperti yang ditunjukkan
dalam teks. The elektro penyangga phoresis, pH 8-8,2, terdapat 89 mM Tris-, 2,5 mM-EDTA dan 89 asam mwboric (Greene et
al., (w / v) 1974).
mentah sukrosa etanol-diendapkan dan 0,25

yo
(w / v) bromophenol DNA (2-100 pl) biru atau dalam murni 0,03 plasmid M-Tris / HCl DNA pH adalah 8,0 dicampur
mengandung dengan a 0-05 solusi M-NaCl 60 dan%
0,005 M-EDTA. Sampel dimuat ke gel yang terkandung 6 sampai 10% (b / v) sukrosa. Elektroforesis adalah pada tegangan
konstan 140 V, gradien tegangan 8- 7 V cm-l, untuk 2,5 sampai 4 jam pada suhu kamar. Gel direndam selama 30 menit dalam
larutan etidium bromida (0,5 pg ml-l, dalam air) dan dilihat di bawah sinar ultraviolet panjang gelombang panjang dan pendek
(Chromatovue kabinet, Ultra Violet Produk). pita DNA difoto pada jenis Polaroid 52 Film Tanah atau Kodak Tri-X, dengan
menggunakan kapak 7 filter merah.
mikroskop elektron ofplasmid DNA. Teknik untuk pemeriksaan pla SMID DNA telah dijelaskan
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18
17
(c) 1 .O% agarosa
1234
Gambar. 1. Pemisahan plasmid dan DNA kromosom pada konsentrasi agarosa yang berbeda. Sebagian persiapan dimurnikan
persiapan dijalankan yang di trek dikenakan 1 untuk ke 4 elektroforesis pada konsentrasi agarosa selama 3,5 sampai 4 jam di (a)
ruang 0,75 suhu. %, (6) 0.65 yo The dan
sama (c) standar kromosom 1,0%. Trek: plasmid DNA 1, NTPlO6 fragmen.
molekul (mol bobot berat 1 4 (semua 5 ~ lo6);.. x lo6) 2, NTP14 4,7, 5,7, (11,4 ~ 20,2, 31,7, lo6); 64,0. Singkatan 3, NTP7: (9 4
~ 1G6.); chr, 4,
sebelumnya (Grindley et al., 1973). Panjang kontur plasmid DNA ditentukan dan berat molekul dihitung dengan asumsi bahwa
13:00 setara dengan berat molekul 2,07 x lo6 (Lang, 1970). Transformasi E. coli K12. Persiapan sebagian dimurnikan
mengandung plasmid DNA didialisis selama sekitar 36 jam terhadap dua perubahan dari 75 m-kalsium klorida. Transformasi
cac1, sel -treated dari E. coli K12 C600 dilakukan dengan metode Cosloy & Oishi (1973) yang dimodifikasi oleh Humphreys et
al. (1979).

HASIL DAN PEMBAHASAN Pemisahan plasmid dan kromosom DNA sebagian plasmid DNA dimurnikan
diperoleh presipitasi etanol lysates dibersihkan fenol-diperlakukan mengandung molekul DNA plasmid yang
bermigrasi pada gel agarosa umumnya sebagai band tunggal pada tingkat berbanding terbalik dengan berat molekul
mereka (Meyers et al. , 1976). Persiapan juga berisi jumlah DNA kromosom terfragmentasi tidak dihapus dalam
penyusunan lisat dibersihkan dari strain plasmid pembawa bervariasi, dan ini banded sebagai daerah difus yang luas
(lihat Gambar. 1). Kecerahan dan ukuran wilayah ini mungkin mengaburkan pita DNA plasmid pada rentang
signifikan dari ukuran molekul dan karena itu mengganggu deteksi plasmid di strain uncharacterized. Kami
memeriksa pemisahan plasmid dan DNA kromosom band menggunakan plasmid dari molekul berat 9 x lo6 untuk 15
x lo6 yang sebagian dimurnikan dari E. coli K12. Mereka menjadi sasaran elektroforesis pada gel konsentrasi
agarosa yang berbeda untuk mengubah mobilitas plasmid relatif terhadap fragmen DNA kromosom linear. Telah
terbukti bahwa pemisahan linear dan CCC bentuk DNA plasmid yang sama sangat tergantung pada kekuatan gel
(Johnson & Grossman, 1977). (14,5 Gambar x lo6) 1 (a) pada acara 0,75

yo
migrasiagarosa. dari NTP14 NTP7 muncul (mol. wt 9,4 kapak Band lo6), berjalan NTP14 dalam (1 1,4 x lo6 yang)
kromosom dan NTP106
DNA 1 dan wilayah 3). Pada (track 0,65% 2) agarose dan NTP106 (Gbr. 1 dan b), mobilitas NTP14 yang hanya
CCC terpisah molekul DNA dari daerah ini meningkat (trek
2-2
(a) 0-75% agarose
1234
download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18

Gel elektroforesis DNA plasmid

(b) 0,65% agarose
1234
64
20
chr
 5,7 4,7
64
20
Chr
5,7 4,7
18
GA WILLSHAW, HR SMITH DAN ES ANDERSON
t

t
logaritmik dikenal plasmid Gambar. agarosa 100, 2. ukuran Penentuan, Sa (25,9 plot sebagian x 123, (a),
144. taking (b) menunjukkan 0.65y0 1Oa) yang dimurnikan dari sebagai molekul mobilitas molekul 10. agarose ukuran
dari dari dari (O), bobot berat 2 E. lainnya 0 taking coli. 2 sebagai plasmid ~ 106 dari K12. suatu fungsi plasmid plasmid
(a) mobilitas (semua 0,75% sebagai x DNA dari lo8): 10. relatif agarose, dengan ukuran 5 4-7,5.7,20.2,31.7,37.8,64.0,77-6,
agarosa 7 mobilitas lo8 ~ mengambil gel untuk elektroforesis DNA mobilitas plasmid dari The para dari..
plasmid plasmid lain sebagai 10, (semua dan x l. Oyo 108): 3-1, 3,7, 4,7, 5,7, 9,4, 20,2, 31,7, 37,8, 48,0, 64,0, 77,6.

relatif terhadap fragmen DNA kromosom, yang diperpanjang selama posisi sponding corre- untuk 12 x los ke 17 x
lo6. Plasmid NTP7 oleh karena itu jelas diselesaikan menjelang kromosom (track (track 1). Dengan elektroforesis 3)
pada saat 1% agarose, NTP106 baik bermigrasi NTP106 dalam dan NTP14 kromosom dapat dipisahkan wilayah
dari fragmen kromosom (Gambar. 1
c,

trek 1 dan 2), sedangkan pada gel ini NTP7 bermigrasi tepat di belakang wilayah kromosom (track 3). terbentuk
Analisis 0,75 dari plasmid% gel agarose DNA. persiapan Kondisi ini dari memberikan liar dan handal strain
perkiraan lain dari itu molekul awalnya ukuran per-
atas berbagai (3 x lo6 80 x lo6) yang berat molekul dan mobilitas relatif yang berhubungan secara linier (Gambar.
2a). Dalam rentang ini, ukuran plasmid ditentukan oleh phoresis elektro berada dalam 10% dari nilai yang diperoleh
dengan mikroskop elektron. Untuk plasmid yang lebih besar, hingga 144 x lo6, hubungan linear tidak lagi berlaku
dan resolusi plasmid 1.0 atau 0,65
spesies yo
gel itu jika berkurang. Persiapan kehadiran plasmid dari dalam plasmid atau dekat DNA itu kromosom kemudian
wilayah run itu pada
tersangka. Dengan 1% agarose, mobilitas plasmid adalah fungsi linear dari ukuran molekul dari 3 x lo6 sekitar 50 x
lo6 (Gbr. 2b) dan kondisi ini tidak digunakan untuk penentuan ukuran plasmid besar. Berat molekul lebih dari 80 x
106 dapat ditentukan pada 0,65% gel, tetapi pada konsentrasi agarosa ini mobilitas plasmid kecil dari 10 x lo6
kurang dari yang diperkirakan dari hubungan linear antara berat molekul dan relatif mobilitas (Gbr. 2 6).
Baru-baru ini sebuah prosedur isolasi telah digambarkan yang secara khusus disesuaikan dengan persiapan
plasmid besar hingga 300 ~ lo6 (Hansen & Olsen, 1978). Dalam teknik ini, langkah lebih lanjut diperkenalkan untuk
melepaskan DNA plasmid dari kromosom dilipat dan untuk mengurangi kontaminasi DNA plasmid dengan fragmen
kromosom. Namun, denaturasi alkali yang terlibat menurunkan yield beberapa plasmid dan ini dapat membatasi
penerapan metode dalam analisis strain liar.
Deteksi melingkar terbuka dan plasmid DNA linear Telah terbukti bahwa terbuka melingkar (OC) DNA umumnya
bermigrasi lebih lambat dari bentuk melingkar kovalen ditutup (AAJI & Borst, 1972; Johnson & Grossman, 1977).
Mobilitas yang relatif CCC dan linear bentuk DNA plasmid tergantung pada konsentrasi gel,
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18
Gel elektroforesis DNA plasmid 19
123456
chr

oc
ccc
oc
lin

ccc
Gambar. (5,7 x 3. 1Oe) Elektroforesis dan ColEl (4,7 dari kovalen x los) ditutup melingkar dimurnikan dari dan plasmid
pembawa terbuka baris plasmid melingkar DNA. E. coli DNA K12 dari oleh NTP16 fugation centri- dari lysates dibersihkan
polietilen glikol-diendapkan di gradien klorida cesium yang mengandung ethidium bromide (Humphreys et al., 1975). Fraksi
gradien mengandung CCC atau OC plasmid DNA menjadi sasaran molekul untuk berada elektroforesis didialisis terhadap pada
0,75 0,01% M-Tris / HCl agarosa untuk pH 3,5 8,0 h yang mengandung pada suhu kamar; 1 m ~ -EDTA. sebagian Sampel
dimurnikan persiapan DNA plasmid dijalankan pada gel yang sama. Trek 1 sampai 3 acara NTP16: 1, DNA sebagian DNA;
fragmen.
5, dimurnikan OC DNA; DNA; 6, 2, CCC OC DNA. DNA; Singkatan: 3, CCC DNA. Trek lin, linear 4 sampai plasmid 6 acara
ColEl DNA; : 4, chr, sebagian kromosom pur5ed

listrik kekuatan medan dan DNA ukuran (Johnson & Grossman, 1977). Selama elektroforesis persiapan DNA baru
dibuat dari strain yang membawa plasmid tunggal kurang dari 10 x lo6 dalam ukuran, kita sering mengamati sebuah
band bergerak lambat di samping spesies bergerak cepat dominan yang mungkin CCC plasmid DNA. Analisis
plasmid di strain liar E. coli dan S. typhimurium juga menunjukkan banyak band bergerak maju dari wilayah DNA
kromosom. Dalam situasi ini, itu penting untuk menentukan jumlah plasmid independen, dan apakah plasmid
tertentu hadir di OC atau linier konfigurasi, serta bentuk CCC. Oleh karena itu kami menyelidiki migrasi bentuk
molekul yang berbeda dari beberapa plasmid standar di bawah kondisi yang paling umum digunakan untuk
pemeriksaan strain liar.
Plasmid DNA dari ColEl (mol. Wt 4.7 x lo6) dan NTP16 (5,7 ~ lo6) dimurnikan pada cesium klorida-etidium
gradien kepadatan bromida dan sampel yang mengandung CCC atau OC molekul plasmid menjadi sasaran
elektroforesis. Olahan dari CCC DNA (Gambar. 3, trek 3 dan 6) menunjukkan sebuah band terang, yang
berhubungan dengan band bergerak lebih cepat di trek 1 dan 4 yang berisi persiapan sebagian dimurnikan dari ColEl
atau NTP16. Sampel OC DNA (trek 2 dan 5) yang terdapat didominasi molekul yang bermigrasi pada posisi yang
sama sebagai band lambat di trek 1 dan 4. Dalam persiapan ColEl (trek 5 dan 6), band samar antara bentuk OC dan
CCC terkandung linear molekul plasmid (lihat di bawah). Dengan demikian, bentuk OC plasmid dalam kisaran
ukuran 4 x lo6 sampai 6 x lo6 bermigrasi menjelang fragmen DNA kromosom selama elektroforesis dari sebagian
dimurnikan
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07 : 41: 18
20 GA WILLSHAW, HR SMITH DAN ES ANDERSON

oc lin ccc
Gambar. 4. Mobilitas plasmid DNA linear pada 0,75% agarose. Kedua ColE1 (. 4 7 ~ lo6) dan RP1 (. 3 7 8 ~ lo6) memiliki satu
situs untuk pembelahan oleh EcoRI endonuklease (Lovett et al, 1974;. Jacob & Grinter, 1975). Persiapan DNA murni atau
sebagian dimurnikan dari plasmid tersebut didialisis terhadap 0,01 M-Tris / HCl pH 8,0 yang mengandung 1 m ~ -EDTA. Sampel
dicerna dengan EcoRI (Miles Laboratories) dengan metode Greene et al. (1974). Enzim-diperlakukan DNA menjadi sasaran
elektro phoresis pada 0,75 yo agarose bersama-sama dengan sampel persiapan plasmid tercerna. Trek: 1, Control - fag h DNA
diobati dengan EcoRI; 2, RP1 sebagian dimurnikan ditambah EcoRI; 3, sebagian dimurnikan RP1, diobati; 4, murni ColE1
ditambah EcoRI; 5, tidak diobati murni ColEl; 6, sebagian dimurnikan ColEl ditambah EcoRI; 7 dan 8, sebagian dimurnikan
ColE1, tidak diobati. Singkatan: lin, DNA plasmid linier.

persiapan dalam kondisi kami. Dalam posisi ini, band ini bisa sesuai dengan bentuk CCC dari plasmid dengan berat
molekul 8 x lo6 untuk 11 x lo6. Sejak plasmid dari 4 x lo6 6x lo6 yang umum di strain liar (Smith et al, 1974;..
Crosa et al, 1977; lihat di bawah) kehadiran OC plasmid DNA kemungkinan akan menyulitkan interpretasi hasil.
Dalam teknik in vitro untuk konversi CCC untuk molekul OC, seperti pengobatan dengan pronase, natrium
dodesil sulfat (SDS) atau DNAase, memiliki aplikasi terbatas untuk persiapan DNA yang mengandung beberapa
plasmid. Elektroforesis di hadapan konsentrasi yang berbeda dari ethidium bromide telah diusulkan sebagai metode
untuk diferensiasi CCC, linear dan OC DNA (Johnson & Grossman, 1977). Sebagai tingkat bromida etidium
meningkat, migrasi relatif dari perubahan konfigurasi DNA. Efek ini tergantung pada ukuran molekul plasmid
dipelajari, sehingga teknik ini akan sulit untuk diterapkan ke strain liar. Pendekatan yang paling berguna kami
menemukan di identifikasi plasmid hadir di lebih dari satu bentuk dalam strain liar adalah untuk menghubungkan
hilangnya sifat, seperti resistensi obat atau pembatasan fag, dengan hilangnya lebih dari salah satu band yang
diamati.
Berbeda dengan pengamatan kami pada plasmid kecil, molekul OC tidak biasanya terdeteksi selama elektroforesis
plasmid yang lebih besar dari 20 x lo6, bahkan penyimpanan setelah lama, berulang-ulang pembekuan dan pencairan
dari persiapan atau pengobatan dengan SDS atau pronase. Beberapa plasmid, terutama I-seperti faktor R dalam
berbagai ukuran 50 x lo6 60 x lo6, memberikan hasil yang rendah dari CCC DNA. DNA plasmid ini mudah
mengalami konversi dari CCC ke bentuk OC (Clewell & Helinski, 1969; Humphreys et al, 1972.). Molekul-molekul
besar OC
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18
Gel elektroforesis DNA plasmid 21
123456
standar tuan rumah dimurnikan Gambar. molekul 5. berada Pemisahan dari plasmid dikenakan bobot strain dari ke dari
molekul (semua plasmid elektroforesis E. coli x lo6) DNA K12 bobot 5,7, dan di 20,2, pada S. (semua S. typhimurium. 0,85
25,9, typhimurium x lo6) % 31,7, agarosa 4,7, 64,0; DNA 25,9, 36. selama 3, Sampel 37.8,48.0, dari 4 R1-19K- h di ruang
plasmid dari 77,6; suhu di. E. persiapan R1-19K- 2, coli standar K12; adalah 4, Trek: dari plasmid sebagian
mentransfer setiap 1,
faktor S. typhimurium
terisolasi di - melacak S. typhimurium 6 juga mengandung setelah referensi kehilangan R1-19K- resistensi plasmid dari
penanda molekuler; berat badan 5 dan 25,9 6, x R1-19K- lo6.
di

mungkin tidak mudah masuk 0,75% agarose, sehingga di daerah fluoresensi cerah yang sering Posisi diamati di atas
0,75 asal% agarose dari gel.
DNA plasmid linier relatif terhadap CCC dan OC bentuk tergantung pada
ukuran molekul plasmid dan diilustrasikan pada Gambar. 4 untuk ColEl (4,7 x los) dan RP1 (37,8 x lo6). Molekul
linier ColEl (trek 4 dan 6) banded antara CCC dan OC plasmid DNA (track 5, 7 dan 8), pengamatan mirip dengan
Johnson & Grossman (1977) untuk molekul hingga 11 x lo6 dalam ukuran. Namun, bentuk linear dari RP1 (track 2)
banded depan CCC DNA (track 3), dalam posisi yang sama pada gel sebagai fragmen DNA khrom somal.
Elektroforesis DNA plasmid diisolasi dari host bakteri berbeda Sifat molekul beberapa plasmid resistensi
tergantung pada host bakteri yang pelabuhan mereka. Faktor F-seperti R, seperti R1, R6 dan R100, terisolasi
terutama dalam bentuk CCC tunggal dari E. coli K12. Dalam Proteus mirabilis, DNA plasmid ini terdiri dari tiga
spesies molekul yang berbeda ukuran. Ini sesuai dengan faktor R yang lengkap, yang berdisosiasi untuk memberikan
wilayah transfer factor dari molekul dan daerah, disebut r-determinan, mengandung beberapa atau semua gen
resistensi obat (untuk review, lihat Rownd et al., 1975) . Plasmid R100, dan faktor R lainnya coding untuk ketahanan
terhadap kloramfenikol, streptomisin dan sulfonamid, juga memisahkan menjadi tiga spesies DNA di S.
typhimurium, tetapi biasanya ada sebagai spesies molekul tunggal dalam E. coli K12 (Sheehy et al, 1973.;
Humphreys et al, 1974;. Humphreys, 1977).
Disosiasi DNA plasmid di S. typhimurium dapat ditunjukkan dengan gel agarosa
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18
22
GA WILLSHAW, HR SMITH DAN ES ANDERSON

Tabel 2 . Sifat strain Salmonella typhimurium

Resistance plasmid dilakukan
Flme Flme non Saring non lain tidak ada. Jenis asal fag
Resistance jenis mentransfer auto mentransfer auto mentransfer
auto
14M6407 Inggris 1974 * 208 15M1708 Iran, 1975 208 15M3557 Iran, 1975 208 14M398 16M5937 Israel, Turki, 1974 1976
Untypablet 208 ACKSSuT - ACKSSuT - ACKSSuT ACKSSuT ACKSSuT -
ACKSSuT
7A
'aku
ACSSuT A, SSU ACSSuT A, SSU
- ACSSuT AK, AK, Ssu SSU ACSSuT AK, Ssu See * t
Tabel 1 untuk definisi dari simbol resistensi obat.
Strain ini diisolasi dari pasien yang terinfeksi di Iran (Anderson et / a., 1977). Strain untypable membawa kecil-plakat fag
beriklim yang mengubah ketik 208 ke strain untypable (Anderson et a /., 1977).

Tabel 3. Plasmid hadir dalam strain Salmonella typhimurium liar

asli S. typhimurium galur 14M6407 Inggris 15M1708 Iran 15M3557 Iran 14M398 Israel 16M5937 Turki

-
x berat molekul plasmid r ----
A. 7
FIME A AK SSU
7-
lain
83
4,3-5,7- -
90 bintang 4,5 - 5,8 3,2 3,9
90 - 5,7 5,7 3-2 -
81-5,9 5,8 3-0 4,2
Lihat Tabel 1 untuk definisi dari simbol resistensi obat.

elektroforesis. Budaya E. coli K12 atau S. typhimurium fag tipe 36 yang membawa F ,, disiapkan plasmid Rl-19K-
dan dikenakan (Tabel elektroforesis 1) segaris pada dengan 0,85
SDS; % Agarosa sebagian gel dimurnikan (Gbr. 5). plasmid DNA DNA R1-19K- adalah
dari E. coli K12 menghasilkan band plasmid tunggal sesuai dengan berat molekul 57 x lo6 (track 3). Ketika strain
tuan rumah adalah S. typhimurium, tiga band DNA plasmid yang terlihat, dengan ukuran molekul 57 x lo6, 41 x lo6
dan 16 x lo6 (trek 5 dan 6; track 6 juga berisi plasmid standar berat molekul 26 x lo6 ). Spesies terbesar hadir di S.
typhimurium adalah molekul R1-19K- lengkap, seperti yang diamati dalam E. coli K12. Band dari berat molekul 41
x lo6 diwakili faktor transfer R1-19K-; ini diisolasi sebagai plasmid yang terpisah di S. typhimurium setelah
kehilangan penanda resistensi obat dari faktor R dan bermigrasi sebagai band tunggal 41 x lo6 (track 4). Perlawanan
wilayah penentu somal DNA dari R1-19K-, fragmen dengan pada 0,85
berat molekul yo agarose (trek dari 16 5 x dan lo6, 6). adalah Dalam jelas pemeriksaan diselesaikan dari isi plasmid
khrom strain uncharacterized dengan elektroforesis gel, kemampuan beberapa plasmid ada di beberapa spesies
dengan ukuran yang berbeda di beberapa host dapat mempersulit interpretasi hasil.
Penerapan elektroforesis gel agarosa untuk studi salmonella yang resistan terhadap obat Sejumlah besar S. strain
typhimurium yang resistan terhadap obat asal Timur didominasi Tengah telah dipelajari baru-baru ini di
laboratorium ini (Threlfall et al, 1976;. Anderson et al, 1977). . Mayoritas budaya milik fag tipe 208 dan mereka
mungkin mewakili
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18
23
78
38
20
5,7
3,7
Gambar. untuk dan asal. membawa plasmid elektroforesis SSU 6. Plasmid Identifikasi E. resistance di coli DNA galur K12 untuk
14M6407: plasmid garis 3,5 dari itu plasmid h berasal sebagian dari 0,75
dengan di% mengerucut strain transfer dari atau transformasi S. yang typhimurium liar percobaan S. typhimurium. jenis fag
strain 208 Sampel dan Tengah berasal dari sasaran plasmid Timur
dengan kurang sponds plasmid S. dua typhimurium; dari plasmid AK hanya. plasmid 10 spesies x; Trek lo6 terbuka 7, hanya. E.
melingkar 8, Cozi 6 terlalu E. DNA untuk K12 Cozi bentuk kecil 9-1, yang liar samar agarose tersebut. S. Sebuah band
typhimurium; plasmid; Trek hanya 3, depan E. 1 2, untuk Cozi E. 3 dari menunjukkan K12 Cozi yang transconjugant kromosom
K12 transconjugant kecil non-autotransferring DNA dengan SSU mengandung resistensi wilayah corre- Sebuah
acara kecil non-autotransferring plasmid regangan 14M398: 6, liar K12 transconjugant transforman tahan dengan SSU terhadap
ampisilin plasmid saja; dan kanamisin, 9, E. coli K12 dan transforman yang mengandung
sampel mengalami elektroforesis untuk demonstrasi plasmid dari untuk deteksi pada gel dari plasmid FIME hadir dalam strain.
The parations referensi plasmid molekul ukuran standar adalah plasmid menunjukkan plasmid ini DNA pada yang berada tokoh.
menjalankan ditentukan di trek 4 secara terpisah dan 5; dan molekul ditunjukkan ukuran dalam beberapa Tabel 3. iniPra

clonedistribusi geografis yang luas. Kebanyakan strain membawa plasmid resistensi milik F, saya kelompok
kompatibilitas yang berisi baik autotransferring dan anggota non-autotransferring. Studi molekuler dari plasmid FPE
menunjukkan bahwa mereka memiliki berat molekul, ditentukan oleh mikroskop elektron, antara 88 x lo6 dan 103 x
log dan menunjukkan tingkat tinggi homologi DNA (Willshaw et al., 1978). Selain F, saya plasmid, strain
typhimurium S. ini membawa A atau non-autotransferring plasmid resistensi AK dan SSU.
Sifat lima strain typhimurium S. liar dari berbagai negara ditunjukkan pada Tabel 2. Sebagian dimurnikan
persiapan DNA plasmid dari strain tersebut diperiksa dengan elektroforesis kelompok gel. F, saya; perkiraan Semua
lima strain molekul masing-masing bobot dilakukan hanya ditentukan satu besar oleh plasmid, elektroforesis yang
milik pada
0-75%untuk
agarosa adalah antara 81 x lo6 dan 92 x lo6 (Tabel 3). Selain F, saya, setidaknya dua spesies DNA plasmid lain yang
hadir di masing-masing strain; ukuran plasmid ini ditunjukkan pada Tabel 3. Escherichia coli derivatif K12
kemudian diperiksa untuk mengidentifikasi pita DNA yang sesuai dengan A, AK dan Ssu plasmid tercantum dalam
Tabel
2.A, AK atau SSU plasmid dimobilisasi ke dalam E. coli K12 dengan TA saya-seperti faktor R di salib triparental
(Anderson, 1965). Plasmid hadir dalam garis penerima diperiksa dengan elektroforesis dan dibandingkan dengan
mereka yang terdeteksi dalam lima strain liar. Dengan semua lima strain, E. Cozi K12 derivatif yang mengandung
lebih dari satu jenis plasmid kecil diperoleh, dan identitas plasmid yang berbeda tidak dapat ditentukan dengan pasti.
Sebagian dimurnikan plasmid persiapan DNA dari strain tersebut digunakan
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh IP: 180.254.71.40 Pada: Thu, 1 Juni 2017 07:41:18

Gel elektroforesis DNA plasmid

123456789
24
GA WILLSHAW, HR SMITH dAN ES ANDERSON untuk mengubah E. coli K12 C600 memilih
untuk ketahanan terhadap ampisilin, kanamisin atau mycin strepto-. Transforman dianalisis dengan elektroforesis,
dan biasanya hanya satu plasmid yang dikodekan untuk resistensi obat hadir di masing-masing strain. Elektroforesis
persiapan dari dua strain dan E. coli derivatif K12 ditunjukkan pada Gambar. 6 dan isi plasmid dari semua lima
strain S. typhimurium diringkas dalam Tabel 3. Empat dari strain plasmid dilakukan yang kode tanpa fungsi yang
diketahui dan setidaknya dua ukuran. Ini 'samar' plasmid berada, dalam beberapa kasus, dimobilisasi ke dalam E.
coli K12 bersama-sama dengan A, AK atau SSU plasmid tetapi tidak biasanya hadir dalam transforman dipilih untuk
resistensi obat.
Kesamaan dalam isi plasmid dari strain dari berbagai negara mendukung pandangan bahwa klon tunggal S.
typhimurium fag tipe 208 telah didistribusikan secara luas (Anderson et al., 1977). Namun, agarosa elektroforesis
gel telah menunjukkan perbedaan jumlah dan ukuran plasmid kecil ini, dan perubahan ini mungkin telah terjadi
selama penyebaran ketegangan. Penyelidikan ini menekankan nilai elektroforesis gel, dalam hubungannya dengan
studi genetik, untuk identifikasi isi plasmid dari enterobacteria. Teknik-teknik menambah berbagai metode sekarang
tersedia untuk studi epidemiologi infeksi yang disebabkan oleh organisme ini.
PUSTAKA AAJI, C. & Borst, P. (1972). Gel elektroforesis
DNA. Biochimica et Biophysica acta 269, 192- 200. ANDERSON, ES (1965). Sebuah tes skrining cepat untuk transfer faktor di
Salmonella typhimurium peka terhadap obat. Alam, London 208, 1016-1017. ANDERSON, klonal McConnell, distribusi ES, M.
THRELFALL, M. perlawanan & SMITH, EJ, plasmid pembawa H. CARR, RJM, (1977).
Salmonella typhimurium, terutama di Timur Tengah. Journal of Hygiene 79, 425-448. CLEWELL, DB & HELINSKI, DR
(1969). Super melingkar kompleks melingkar DNA-protein di Escheri- chia coli: pemurnian dan diinduksi konversi ke bentuk
melingkar terbuka. Prosiding National Academy of Sciences dari Amerika Serikat COSLOY, Amerika S. 62, D. & 1 159-1 Oishi,
166.
M. (1973). Sifat dari proses transformasi dalam Escherichia coli K12. Molekul dan Umum Genetika 124,
1-10. Crosa, lkj & H., PERARANDA, Olarte, J., M. MATA, E. (1977). LJ, Characteri-
LUTTROPP,
sation dari R-plasmid berhubungan dengan resistensi ampisilin di Shigella dysenteriae tipe 1 yang diisolasi dari epidemi. Agen
antimikroba dan terapi kemo 11, 553-558. Datta, RB & N., RICHMOND, Hedges, RMW, H. (1971). SHAW, Properties EJ,
Sykes,
dari faktor R dari Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology 108,
1244-1249. FREDERICQ, P. (1956). Recherches sur la frkquence des Souches transductrices des proprietes colicino- gen.
Comptes rendus des dances de la Socipte' de biologie 150, 1036-1039. GREENE, PJ, BETLACH, MC, BOYER, HW &
GOODMAN, HM (1974). The EcoRI restriction endonuclease. Methods in Molecular Biology 7,
GRINDLEY, NDF, HUMPHREYS, G. 0. & ANDER-
SON,
General method for the isolation of plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology 116, 1 064- 1 066. HANSEN, JB &
OLSEN, RH (1978). Isolation of large bacterial plasmids and characterization of the P2 incompatibility group plasmids pMGl
and pMG5. Journal of Bacteriology 135,227-238. HUMPHREYS, G. 0. (1977). The molecular nature of R factors in different
bacterial hosts. In Topics in Infectious Diseases, vol. 2, pp. 277-293. Edited by J. Drews & G. Hogenauer. Wien: Springer-Ver-
lag. HUMPHREYS, SON,
ESG (1972). O., GRINDLEY, DNA-protein ND complexes F. & ANDER-
of A-mediated physics acta transfer 287, 355-360.
sistem. Biochimica et bio-
HUMPHREYS, GO, WILLSHAW, GA &ANDERSON,
ES (1974). Molecular nature of R factors in different bacterial hosts. Proceedings of the Society for General Microbiology 1, 67.
HUMPHREYS, GO, WILLSHAW, GA & ANDERSON,
ES (1975). A simple method for the preparation of large quantities of pure plasmid DNA. Bio- chimicu et biophysica acta 383,
457-463. HUMPHREYS, GO, WESTON, A., BROWN, MGM & SAUNDERS, JR (1979). Plasmid transformation of
Escherichiu coli. In Proceedings Meeting on Transformation and Transfection of 4th European , pp. 254-279. Edited by SW
Glover & LO Butler. Oxford: Cotswold Press. JACOB, AE & GRINTER, NJ (1975). Plasmid RP4 as a vector replicon in genetic
engineering. JOHNSON, Nature, P. London H. & 255, GROSSMAN, 504-506.
LI (1977). Electro- phoresis of DNA in agarose gels. Optimizing separations of conformational isomers of double- and
single-stranded DNAs. Biochemistry 16, 87-111.
42 17-4224. LANG, D. (1 970). Molecular weights of coliphages ES (1973). Molecular studies of R factor compatibility
groups. Journal of Bacteriology 115, 387-398.
and coliphage DNA. 111. Contour length and molecular weight of DNA from bacteriophages T4, T5 and T7, and from bovine
papilloma virus. GUERRY, P,, LEBLANC, DJ & FALKOW, S. (1973).
Journal of Molecular Biology 54, 557-565.
Downloaded from www.microbiologyresearch.org by IP: 180.254.71.40 On: Thu, 01 Jun 2017 07:41:18
 Gel electrophoresis of plasmid DNA 25 Lonrr, MA, GUINEY, DG & HELINSKI, DR and (1974). ColE2: Relaxation unique
circular ceedings of DNA the National of complexes the site Academy relaxed of the of nick complexes. of plasmids Sciences in
the ColEl of open Pro- the United States of America MEYERS, FALKOW, phoretic JA, method S. (1976). SANCHEZ, for
Simple the 71, identilication D., agarose 3854-3857.
ELWELL, gel and LP electro- char- &
acterization of plasmid deoxyribonucleic acid. MEYNELL, Journal of E. Bacteriology & COOKE, M. 127, (1969). 1529-1537.
Repressor-minus and operator constitutive derepressed mutants of F-like R factors: their effect on chromosomal ROWND,
transfer Structure nucleic acid R., by and HfrC. in PERLMAN, Proteus replication Genetical mirabilis. D. of & Research R
GOTO, In factor Microbiology- 14, N. deoxyribo- 309-3 (1975). 13.
1974, pp. 76-94. Edited by D. Schlessinger. Washington, biology. SHEEHY, 111, DC : American Society for Micro- RR (1973).
J., PERRY, Molecular A., ALLISON, nature DP of & R Cmnss factor deoxyribonucleic acid isolated from Salmonella
typhimurium minicells. Journal of Bacteriology
S N. m D. , F., HR, GRINDLEY, HUMPHRFJYS, JN & G. ANDERSON, O., GRINDLEY,
ES (1973). Molecular studies of anfi+ plasmid from
strains of Salmonella typhimurium. Molecular and General Genetics 126, 143-1 5 1. SMITH, E. sation SHR, HL~MPHREYS,
GO & ANDERSON,
(1974). of some Genetic non-transferring and molecular plasmids. characteri- Mole- SMITH, cular H. and R., General
HUMPHREYS, Genetics G. 129, O., 229-242.
WILLSHAW, GA & plasmids ANDERSON, coding E. for S. the (1976). restriction Characterisation endonuclease of
EcoRI. Molecular and General Genetics 143, 319- 325. THRELFALL, EJ, Cm, JM & ANDERSON, ES (1976). Compatibility
relations of resistance plasmids Eastern origin. in Salmonella Proceedings typhimurium of the Society of Middle for General
Microbiology 3, 88. WILLSHAW, SCOTLAND, cation of G. agarose S. A,, M. SMITH, & gel GROSS, H. electrophoresis R., R.
ANDERSON, J. (1977). for Appli- E. the S.,
characterisation of plasmid DNA in drug- resistant and enterotoxigenic enterobacteria. WILLSHAW, Proceedings biology 4, G.
151-152.
A., of the Society for General Micro- S m , HR &ANDERSON, ES (1978). Molecular studies of FIme resistance 114,
1328-1335.
plasmids, particularly in epidemic Salmonella typhimurium. Molecular and General Genetics 159, 111-116.
Downloaded from www.microbiologyresearch.org by IP: 180.254.71.40 On: Thu, 01 Jun 2017 07:41:18