UPDATE

DIAGNOSIS LABORATORIS
LEPTOSPIROSIS

Farida Dwi Handayani

Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Vektor dan Reservoir Penyakit

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan
Kementerian Kesehatan R.I.
Jl. Hasanudin 123 Salatiga SEM 40 500x
Vijayachari et al., Epidemiol. Infect. (2004
 Zoonosis penting di Indonesia.

IS
• Case Fatality Rate 13,3% (Subdit Zoonosis-P2TVZ,
Kementerian Kesehatan, 2019)

S
RO • Persentase tikus positif Leptospira pathogenic
ditemukan di kabupaten wilayah RIKHUS
VERKTORA (B2P2VRP, 2018)
• Misdiagnosis – under-diagnosis – under-reported
SPI

Menginfeksi Mamalia dan Menyebabkan

TO

kerugian ekonomi pada ternak:

- Aborsi
- Kelahiran mati
LEP

- Kemandulan
- Produksi susu menurun
- Morbidity dan kematian pada ternak, tetapi
umumnya gejala subklinis
- Uveitis pada kuda
Farida Handayani_b2p2vrp_2020
Lepto atau bukan Lepto??
• Gejala mirip dengan penyakit demam akut lain (dengue, malaria, flu-like
syndrome)
• Subklinis di hewan ternak
• Tikus bersifat cosmopolitan

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 Tantangan diagnosis laboratoris leptospirosis
(Musso&Scola, 2013)
• Di banyak negara berkembang, termasuk sebagian besar
daerah endemis leptospirosis, kemampuan laboratorium
untuk mendeteksi mikroorganisme patogen seringkali
tidak memadai.
• Kadang-kadang, kebutuhan dasar dan peralatan tidak
memadai, seperti listrik, cold chain, dan personel
laboratorium terlatih.
• Karena kemudahan penggunaannya, bahkan di pusat
kesehatan primer, tes cepat sering digunakan dalam
praktik rutin di banyak klinis. Namun, tes diagnostik
cepat ini mungkin tidak mencapai sensitivitas optimal
sampai setidaknya satu minggu setelah timbulnya
demam.
• Biosafety dan biosecurity*
 Nonspecific laboratory findings
1. Blood analysis
1.1. Leukocytosis
Diagnosis 1.2. Thrombocytopenia in >50%18
1.3. Elevated
1.3.1. Erythrocyte sedimentation rate
1.3.2. Creatinine (usually <20e80 mg/L)
1.3.3. Urea (usually <1000 mg/L)
1.3.4. Aminotransferases (rarely > 200 IU/L)
1.3.5. Bilirubin (may rise to 800 mg/L)
1.3.6. Alkaline phosphatase
2. Urine analysis
2.1. Proteinuria, pyuria, microscopic hematuria, hyaline,
and granular casts
3. Cerebrospinal fluid analysis
3.1. Normal or slightly elevated cerebrospinal fluid pressure
3.2. Initially a predominance of polymorphs or lymphocytes
(total cell counts generally <500 106/L) and lymphocytes p
Pleocytosis can persist for weeks
3.3. Elevated protein (50e100 g/L) 3.4. Glucose is usually normal
3.5. Xanthochromia may occur
Pemilihan sampel pemeriksaan
Darah? Serum? urin?

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
Pemilihan sampel pemeriksaan
Whole blood untuk
kultur dan PCR

Serum untuk
serologi dan PCR

Urine untuk kultur

dan PCR

Ginjal untuk kultur

Farida Handayani_b2p2vrp_2020 dan PCR
Tahapan Leptospirosis dan Pemilihan Koleksi Sampel
(Natarajaseenivasan, 2010)

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 PHENOTYPIC&
CLASSIFICATION&
Do main : Bac te ria

Leptospira spp. Phylum

Clas s
Orde r
Family
: S piro c hae te s
: S piro c hae te s
: S piro c hae tale s
: Le pto s pirac e ae
Ge nus : Le p to s p ira
• Domain : Bacteria
• L.#interrogans! L.#bifle a!
Phylum : Spirochaetes
• Class : Spirochaetes SEROVARS&
&(³&
300)&
#L.#interrogans&
serovar&
SEROVARS&
&(45)&
serovar&
L.#bifle a& Patoc&
&

•
Icterohaemorrhagiae &
&

Order : Spirochaetales strain&

RGA!
Strain&
Patoc&
1!

SEROGROUPS&
(25)&

• Family : Leptospiraceae x x serovar&

L.#interrogans&
Icterohaemorrhagiae&
SEROGROUPS& (38)&
L.#bifle a#serovar&Patoc&
strain&
RGA&
belongs&
to& Strain&Patoc& 1&
in&the&

• Semaranga& serogroup!
serogroup&
Genus : Leptospira Icterohaemorrhagiae&

serovar is the basic taxon – strains more than 10 % dissimilarity of surface

antigenic make up defined by MAT considered as different serovars

Serovar adalah basic taxon – strains dengan lebih dari 10% perbedaan permukaan antigen
melalui Microscopic Agglutination Test (MAT) digolongkan ke dalam serovar yang berbeda.

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 DIAGNOSIS-
LEPTOSPIROSIS
Di B2P2VRP

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 •Isolasi
Bakteriologi •Inokulasi pada hewan coba

•Mikroskopi langsung,
Mikroskopi •Pewarnaan Perak (silver staining)

•MAT •Lepto lateralflow

Imunologi •ELISA

Biologi • Polymerase chain reaction (PCR)

Molekuler • Real-time PCR (qPCR)

Artifisial
Intelligence Machine learning Clinical Decision Support System

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 ISOLATION
gi
ol o
e r i
kt
Ba
Disadvantages Advantages

Definite proof of
infection
Fastidious organis
m Circulating serova
Slow growth rate rs-
Antigen in MAT
Contamination of
medium Vaccine
development

PATIENT FROM No. ATTEMPTED No. POSITIVE PERCENTAGE

REFERRAL HOSPITAL 76 8 10
RURAL HEALTH CARE
132 44 33
CENTRE

(Natarajaseenivasan, 2010)
 Leptospira spp. (patogen / non-patogen?)

DFM (1000 x) DFM (200 x)

opi
osk
kr
Mi

SEM (40 500 x)

Fontana’s staining (400 x)
Vijayachari et al., Epidemiol. Infect. (2004)
 Methods used for Identification of Isolates

Species Genomo-species
Serogroup/
Genus (Pathogenic/Non Molecular
Serovar
-Pathogenic)
DNA DNA
hybridization’
Agglutination
with ‘group sera’ RFLP, PFGE, REA,
Growth at 8- RAPD, FAFLP
azaguanine
Cross
Agglutination REP PCR –Rep
Morphology &
absorption test PCR, Eric PCR,
Movement
Box PCR
Monoclonal
Growth at 13oC
antibodies MLST, PCR-
Sequencing

(Natarajaseenivasan, 2010)
 Microscopic Agglutination Test (MAT)
gi
ol o
un
Im
Advantages Disadvantages

Panel of Represen
tativ
Serovars to be us e
ed
serovar /serogrou
p Complex and Tim
specific test e
consuming Test
sero-epidemiolog
ic Required Paired se
studies ra and
no IgM/IgG class

(Natarajaseenivasan, 2010)
Neg-C 1 in 20 1 in 40 1 in 80 1 in 160
 Microscopic Agglutination Test
(MAT)
MAT hingga kini masih digunakan sebagai gold standard pemeriksaan
leptospirosis. Keuntungan utama MAT adalah spesifitasnya tinggi. Kekurangannya
adalah membutuhkan fasilitas khusus untuk kultur dan pemeliharaan panel
Leptospira hidup, dimana bakteri ini sangat mudah terkontaminasi antar serovar
maupun bakteri lain yang dapat menyebabkan ketidaktepatan dalam pembacaan
hasil. Oleh karena itu selain keterampilan teknis pekerja laboratorium,
pemeliharaan kultur Leptospira adalah time consuming, terutama bila panel
kulturnya berjumlah banyak.

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 Microscopic Agglutination Test
(MAT)

Kekurangan lain yang sering terjadi dan jelas adalah ketika titer antibodi belum
cukup terdeteksi atau bila serovar infeksi tersebut tidak ada dalam panel serovar.
Diketahui hingga kini ada lebih dari 300 serovar di dunia, yang terbagi ke dalam
25 serogrup. Jadi harus diketahui lebih dahulu jenis serovar apa saja yang
bersirkulasi di wilayah tersebut, untuk menentukan jenis dan jumlah serovar
dalam pelaksanaan MAT di laboratorium.

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
Proses Deteksi Antibodi Leptospira dengan MAT

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 Lepto lateralflow - evaluation

Disadvantages Advantages
Easy to perform
and read with in
15
min
Not a confirmatory
10 l of blood are
test 5
l of serum
Kits are imported Not require any
and costly special expertise o
r
equipment

Index 0-7 Days (%) 8-30 Days (%)

Sensitivity 52.9 83.8
Specificity 93.6 92.9
PPV 92.5 96.9
NPV 57.1 68.4 (Natarajaseenivasan, 2010)
PEER Health project
B2P2VRP

Lateral Flow Immunoassay (LFI)

untuk deteksi Leptospira pada sampel pasien
• Cepat (10 min) dan pemeriksaan dini
• Murah
• Stabil pada suhu ruang RDT BERBASIS
• Mudah digunakan ANTIGEN

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 Polymerase chain reaction (PCR)- evaluation
l ogi
Bio kuler
ole
M
Disadvantages Advantages

Sensitive and pati

ents
can be diagnosed
early
Sophisticated Lab
orato
needed and expen ry Early stage of the
dis
sive itself can be diag ease
nosed
Expertise needed Specific if applied
with
standard protocols
(Natarajaseenivasan, 2010)
Index Value 95% CI
Sensitivity 96.87 75.2, 92.2
Specificity 92.5 87.8, 93.5
Predictive Value Positive 80.2 69.6, 88.0
Predictive Value Negative 94.7 90.4, 92.2
Percent Agreement 90.63
Kappa 0.763676
Molecular – Leptospirosis di
B2P2VRP

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
 Sequencing

Farida_b2p2vrp_2020
 Pathogenic primers Leptospira
Primer of General Bacteria Sequence of Primer
16S rRNA 5’- GAA CTG AGA CAC GGT CCA T -3’

Type of Primers Sequence of Primer

No. Leptospira pathogenic

1. lipL32 5’- ATC TCC GTT GCA CTC TTT GC -3’

2. lipL32 5’- CGC TGA AAT GGG AGT TCG TAT GAT T -3’
3. secY 5’- CTG AAT CGC TGT ATA AAA GT -3’
4. nsecY 5’- ATG CCG ATC ATT TTT GCT TC -3’
5. lipL41 5’- TAG GAA ATT GCG CAG CTA CA -3’
6. rrs2 (16S rRNA) 5’- CAT GCA AGT CAA GCG GAG TA -3’
7. adk 5’- GGG CTG GAA AAG GTA CAC AA -3’
8. icdA 5’- GGG ACG AGA TGA CCA GGA T -3’

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
Menentukan metode uji untuk sampel darah
Picardeau-2013

Farida Handayani_b2p2vrp_2020
Point penting :
deteksi antigen (DNA)
Kualitas Pemilihan
DNA /
Primer
Polymerase Proses
Chain Reaction ekstraksi

(PCR)
Optimasi
protokol
1. PEMILIHAN SAMPEL 2. PEMILIHAN METODE PCR 3. PROSES PCR

• Jenis (darah; serum; a. Konvensional PCR

urine; sputum; ginjal) b. Real-time PCR SBYR green
• Waktu pengambilan c. Real-time PCR Taqman/probe
sampel (post onset)
Hasil
PCR valid
 Kesimpulan
1. Deteksi laboratoris leptospirosis membutuhkan kemampuan,
keterampilan dan pemahaman tentang karakteristik bakteri Leptospira,
pemilihan dan penanganan sampel, serta analisa hasil yang tepat.
2. Antigenic-based Rapid Diagnostic Test (RDT) atau tes cepat berbasis
antigen leptospirosis menjadi harapan untuk membantu diagnosa dini
dan cepat di Puskesmas dan fasilitas pelayan kesehatan.
3. Artificial Intellegent – machine learning berpotensi dapat digunakan
sebagai alat bantu bagi klinisi atau medis dan paramedis dalam
deteksi leptospirosis.
4. Perlu adanya jejaring laboratorium pemeriksa leptospirosis untuk
kesepakatan uji diagnostic (metode, SOP dan protokol), sharing
informasi, transfer knowledge, serta external quality assurance (EQAS).
Buku:
Terimakasih Team B2P2VRP Salatiga - Litbangkes
 Terimakasih
• Prof. dr. Muhammad Hussein Gasem, PhD
• dr. Lisa Novipuspitasari, Sp.PD
• Dr.Eng Adi Wibowo S.Si, M.Kom
• Faizah Fulyani, S.Si, M.Sc. Ph.D
 Acknowledgements
• PEER Health grant, project #115. Sub-Grant Number PGA 2000004733
(collaboration with Dr. David Aucoin, UNR, US)
• Dr. Paluru Vijayachari, ICMR- Regional Medical Research Centre - WHO
Collaborating Centre for Diagnosis, Research, Reference and Training in Leptospirosis,
Port Blair
• Dr. David P. AuCoin, University of Nevada Reno, School of Medicine, Department
Microbiology&Immunology
• Dr. Marga Goris & Dr. A. Ahmed, OIE and National Collaborating Centre for
Reference and Research on Leptospirosis Academic Medical Center, Department of
Medical Microbiology University of Amsterdam, The Netherlands

31
Thank you