Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Molekul 2013, 18, 8230-8242; doi:10.3390/molekul18078230

C
HAIkamu aku
PENA SACe C S
ES

tahi lalat
ISSN 1420-3049
www.mdpi.com/journal/molecules
Tinjauan

Penerapan Efek Isotop Kinetik Keadaan Transien terhadap

Penyelesaian Mekanisme Reaksi yang Dikatalisis Enzim
Harvey F. Fisher

Departemen Biokimia dan Biologi Molekuler, Fakultas Kedokteran Universitas Kansas,

3901 Rainbow Blvd, Kansas City, KS 66160, AS; Email: hfisher@kumc.edu

Diterima: 12 Mei 2013; dalam bentuk revisi: 19 Juni 2013 / Diterima: 1 Juli 2013 /
Diterbitkan: 12 Juli 2013

Abstrak: Sebagian besar pemahaman kita tentang mekanisme reaksi yang dikatalisis enzim didasarkan
pada studi kinetik keadaan tunak. Secara eksperimental, pendekatan ini hanya bergantung pada
pengukuran tingkat penampilan produk bebas (d[P]/dT), entitas yang kompleks secara mekanis dan
matematis. Terlepas dari ambiguitas parameter yang diamati ini, keberhasilan metode ini sebagian
disebabkan oleh teori aljabar turunan ketat yang rumit yang menjadi dasarnya. Kinetika keadaan-
transien, di sisi lain, meskipun kemampuannya untuk mengamati pembentukan langkah-langkah
antara secara real time, telah memberikan kontribusi yang relatif kecil untuk subjek karena, dalam
beberapa ukuran, kurangnya dasar matematika yang solid. Di sini kita membahas keadaan saat ini dari
teori keadaan sementara yang ada dan kesulitan dalam penerapannya yang realistis pada data
eksperimen. Kami menggambarkan teori analitik dasar dari efek isotop kinetik keadaan sementara
dalam bentuk tiga aturan dasar baru. Aturan-aturan ini cukup untuk mendefinisikan mekanisme yang
diperluas, menemukan langkah peka-isotop dan mengidentifikasi langkah-langkah yang hilang dari
data eksperimen. Kami mendemonstrasikan penerapan aturan ini untuk menyelesaikan program waktu
komponen dari reaksi fenilalanin dehidrogenase, memperluas reaksi yang diketahui sebelumnya
dengan satu langkah transfer prehidrida baru dan dua langkah transfer pasca hidrida baru. Kami
menyimpulkan dengan penilaian arah masa depan di bidang ini.

Kata kunci: mekanisme enzim; efek isotop; langkah sensitif isotop; aliran berhenti; aliran
memuaskan

1. Perkenalan

Efek isotop kinetik keadaan-transien (tKIEs) perlu dipertimbangkan dalam konteks teori umum
kinetika keadaan-transien, subjek yang pertama-tama akan kita bahas. Setidaknya 98% dari kami
Molekul 2013, 18 8231

pengetahuan saat ini tentang mekanisme katalisis enzimatik didasarkan pada studi kinetik keadaan tunak.
Secara eksperimental, pendekatan ini terbatas pada pengukuran ketergantungan konsentrasi reaktan pada
laju pembentukan produk bebas. Kecepatan pergantian kondisi tunak seperti itu tidak tergantung pada waktu
dan sifat sinyal yang diukur. Pengukuran tunggal semacam itu hanya memberikan nilai tingkat perputaran di
bawah serangkaian kondisi tertentu. Parameter seperti itu adalah fungsi kompleks yang nilainya melibatkan
kontribusi dari setiap langkah mekanisme reaksi. Satu set
pengukuran tersebut hanya menghasilkan dua parameter: a KM dan Vmaks. Namun, terlepas dari keterbatasan
parah dari kurangnya fenomena dan relevansi mekanistik langsung, pendekatan kondisi mapan,
menggunakan ketergantungan pH, penghambatan produk, efek isotop partisi isotop, dan percobaan
pulse-chase, sebenarnya mampu mengidentifikasi sifat dan lokasi mekanistik kompleks internal dan
bahkan dalam beberapa kasus untuk mengkarakterisasi sifat keadaan transisi dari intervensi mereka.
Langkah! Selanjutnya, pendekatan ini secara luas berlaku untuk hampir semua enzim. Paradoks yang
tampak ini mudah diselesaikan dengan dasar berikut: interpretasi hasil eksperimen kondisi mapan
bertumpu pada paradigma aljabar yang diturunkan secara ketat dari WW Cleland dan pengembangan
lebih lanjut oleh Cleland sendiri dan banyak siswa dan pengikutnya [1]. Ini digunakan secara luas dan
secara umum diterima sebagai pendekatan otoritatif untuk kinetika enzim.
Kinetika keadaan transien, di sisi lain, memiliki keuntungan memutuskan memberikan pengamatan rinci
langsung dari permulaan kenaikan amplitudo dan transformasi selanjutnya dari banyak zat antara reaksi yang
terlihat secara optik dan melakukannya secara real time. Berbeda dengan pendekatan kondisi mapan, yang hasilnya
tidak tergantung pada sinyal yang digunakan, hasil transien sangat bergantung pada sinyal yang digunakan dan
dapat memberikan berbagai program waktu yang sangat berbeda, properti yang sangat menyederhanakan kendala
yang diperlukan untuk resolusi matematis. Namun, studi keadaan sementara sejauh ini hanya berkontribusi
sebagian kecil dari pemahaman kita tentang katalisis enzimatik, biasanya memberikan hasilAD hoc
eksperimen diarahkan pada beberapa titik mekanistik yang sangat spesifik. Lalu, mengapa, dengan rangkaian fenomena

pengamatan yang jelas lebih unggul ini, pendekatan keadaan sementara memberikan kontribusi yang begitu kecil terhadap

masalah? Sampai saat ini, pendekatan keadaan sementara tidak memiliki dasar matematika yang diturunkan secara ketat dan

dapat diterapkan secara eksperimental untuk menganalisis sejumlah besar data fenomenologis yang diberikannya.

Solusi dari mekanisme reaksi n-langkah memiliki dua persyaratan yang cukup berbeda: (1) hasil eksperimen
yang cukup untuk memberikan ekspresi persamaan diferensial independen ditambah persamaan konservasi
dan (2) algoritme matematika analitik yang mampu mengatur hasil eksperimen secara tepat ke dalam masing-
masing persamaan ini. Dalam pendekatan kondisi tunak dan kondisi transien, persyaratan 1 dapat dipenuhi
dengan mengumpulkan hasil dari berbagai metode eksperimen. Dalam keadaan tunak, di mana setiap suku
dX/dt diset ke nol, pendekatan Cleland dapat menyelesaikan himpunan aljabar yang dihasilkan
persamaan dengan relatif mudah. Dalam pendekatan keadaan-transien, namun di mana dxn/dt adalah fungsi bergantung
waktu berhingga. Seperti yang dibahas di bawah ini, seperti algoritma analitik yang berlaku untuk realistis

integrasi reaksi enzim dari persamaan diferensial telah terbukti secara matematis tidak mungkin. Sebagai
akibat dari kurangnya kemampuan integratif ini, ahli kinetik keadaan-transien terpaksa menggunakan
beberapa bentuk rutin penyesuaian empiris kuadrat-terkecil sebagai gantinya. Prosedur-prosedur seperti itu
diliputi oleh sejumlah masalah, yang dipaksakan oleh sifatnya. Penulis berpendapat bahwa kurangnya
algoritma analitik yang valid dan dapat diterapkan secara substansial membatasi penggunaan pendekatan
yang kaya fenomena ini, dan di sini kami menjelaskan algoritma baru yang menghindari persyaratan integrasi
diferensial yang tidak dapat dicapai.
Molekul 2013, 18 8232

2. Teori Dasar Kinetika Keadaan Transien

Persamaan umum untuk waktu couCrse dari komponen yang diberikan (CSaya) dari setiap reaksi dari n langkah adalah:

(1)

di mana adalah konstanta tidak tergantung waktu yang berhubungan dengan konsentrasi reaktan dari langkah ke-i pada
waktu t, adalah waktu paruh fenomenologis untuk langkah itu dan C adalah konsentrasi reaktan pada t = 0.

Solusi untuk reaksi dua langkah reversibel:

(2)

diperoleh dengan mengintegrasikan diferensial dari Persamaan 1 untuk komponen A, B dan C adalah:

(3)

(4)

di mana dan , bisa jadi terlihat

dari Persamaan (1) bahwa nilai mewakili kemiringan reaksi antara yang terkait pada setiap titik waktu
tertentu sementara suku pra-eksponensial memberikan amplitudo yang sesuai. Persamaan (3) dan (4)
menunjukkan kompleksitas matematis dari fungsi bahkan untuk reaksi dua langkah sederhana yang
tidak nyata. Sayangnya, asumsi yang jelas salah bahwa yang diberikan mewakili konstanta laju untuk
satu langkah masih mencakup bahkan literatur saat ini.
Persamaan (3–4) yang diturunkan secara ketat untuk kasus reversibel dua langkah umumnya
merupakan keseluruhan presentasi formal dalam tulisan-tulisan otoritatif tentang subjek
tersebut. Perlakuan terbatas pada subjek ini dapat meninggalkan kesan bahwa skema reaksi
yang lebih kompleks juga dapat dikembangkan dengan integrasi dan solusi simultan dari
persamaan diferensialnya. Sayangnya, asumsi ini tidak benar karena dua alasan: (1) telah
dibuktikan secara matematis bahwa integral tertutup yang diperlukan untuk setiap mekanisme
yang lebih kompleks daripada persamaan (2) tidak ada [2]. Fakta ini dengan sendirinya
menghalangi perkembangan matematika lebih lanjut di sepanjang garis ini. (2) Bernasconi
telah menunjukkan bahwa dua eksponensial yang nilainya berbeda kurang dari faktor enam
hampir tidak dapat dibedakan [3]. Dengan demikian,

3. Pendekatan Relaksasi

Mengingat ketidakmungkinan matematis integrasi persamaan diferensial untuk reaksi multilangkah yang
realistis dalam keadaan transien, dikombinasikan dengan kompleksitas fungsi eksponensial yang tidak dapat
diselesaikan bahkan untuk kasus reversibel dua langkah, prospek untuk pembuatan algoritma turunan yang
ketat berlaku untuk analisis data eksperimen sementara tampak sia-sia. Namun, pada tahun 1963 Manfred
Eigen memperkenalkan algoritma yang diturunkan secara ketat berdasarkan ketergantungan waktu dari
relaksasi eksponensial komponen setelah gangguan reaksi kimia pada awalnya.
Molekul 2013, 18 8233

pada kesetimbangan [4]. Dalam bentuk percobaan lompatan suhu, analisis ini memaksakan persyaratan kompetensi
kinetik pada mekanisme yang diusulkan tanpa perlu integrasi persamaan diferensial. Pendekatan eksperimental ini
juga menyediakan akses ke peristiwa dalam kerangka waktu mikrodetik, wilayah yang tidak dapat diakses dengan
teknik aliran berhenti atau aliran pendinginan. Pendekatan ini berhasil diterapkan hanya dalam dua kasus, yang
masing-masing memberikan lima fungsi transien yang dapat dibedakan, satu pada reaksi aspartat transaminase [5]
oleh Hammes, dan yang lainnya oleh Kirschner (pada 3-fosfogliseraldehida dehidrogenase [6]). Analisis dengan
persamaan Manfred Eigen mengarah pada mekanisme yang terperinci dan diterima secara umum meskipun
faktanya solusi diakui bergantung pada model dan tidak unik. Seperti disebutkan di atas, bagaimanapun, sebagian
besar percobaan keadaan sementara enzim mengungkapkan hanya dua hingga tiga langkah eksponensial yang
dapat dibedakan bahkan untuk reaksi delapan hingga sepuluh langkah yang sudah mapan. Akibatnya, pendekatan
relaksasi T-jump tidak lagi digunakan secara umum dalam menyelesaikan reaksi enzimatik.

4. Pendekatan Keadaan Transien Saat Ini

Mengingat ketidakmampuan yang ditunjukkan dari pendekatan analitis yang diusulkan sebelumnya untuk menangani data eksperimental

keadaan sementara dari studi reaksi enzim, bidang tersebut telah berkurang ke titik di mana penggunaan utamanya terbatas pada AD hoc fenomena

(seringkali didukung oleh asumsi sewenang-wenang tentang ireversibilitas yang belum terbukti untuk beberapa keadaan dan keseimbangan cepat

yang lain). Pendekatan arus yang paling umum digunakan melibatkan integrasi numerik dari spektrum aliran-berhenti atau aliran-padam diikuti oleh

pemasangan empiris tunggal atau multi-panjang gelombang dari kursus waktu. Metode seperti itu, biasanya disebut rutinitas "penyesuaian global",

umumnya didasarkan pada fungsi "dekomposisi variabel tunggal" (SVD). Solusi seperti kursus waktu transien multi-panjang gelombang menghasilkan

pasangan panjang gelombang dan vektor tergantung waktu. Secara umum belum dipahami bahwa vektor-vektor tersebut merupakan kombinasi dari

fungsi eigen yang terkait dengan s fenomenologis dari persamaan (1). Dengan demikian, mereka memprediksi perilaku skema mekanistik (seringkali

memprediksi kecocokan yang tampak buruk dengan data aktual). Solusi tersebut diliputi oleh dua masalah: (1) mekanisme apa pun dari n langkah

dapat dilengkapi dengan bentuk umum persamaan (1) yang sama, dan (2) karena alasan kurangnya resolusi konstanta laju yang digabungkan seperti

yang dicatat oleh Bernasconi, Aplikasi SVD jarang menghasilkan lebih dari dua hingga tiga pasang nilai eigen yang dapat digunakan bahkan untuk

lebih dari delapan mekanisme langkah yang menggambarkan sebagian besar reaksi enzim. K. Johnson telah mengkritik penggunaan fungsi berbasis

SVD karena kurang valid dan dalam beberapa kasus menghasilkan jawaban yang salah [7]. Program KinTek-nya, berdasarkan kombinasi konstanta

laju yang menghasilkan diagram Venn, memberikan batasan tambahan pada proses pemasangan yang secara substansial meningkatkan

efektivitasnya. Johnson menunjukkan bahwa program komputer modern dapat memberikan "kesesuaian" yang dapat diterima secara menipu untuk

kursus waktu yang terintegrasi secara digital untuk mekanisme yang diasumsikan dengan kompleksitas yang lebih besar daripada yang didukung

oleh data. Dia menganggap sumber interpretasi keliru semacam ini pada fakta bahwa "analisis kesalahan standar terlalu meremehkan kesalahan"

dalam kumpulan data yang tidak cukup dibatasi, dan menunjukkan bahwa analisis semacam itu cenderung menyembunyikan hubungan antara

beberapa hubungan kompleks yang tersirat dalam persamaan (1) . Pendekatan KinTek memberikan analisis kontur kepercayaan berdasarkan

kesalahan jumlah-kuadrat pada dan menunjukkan bahwa analisis tersebut cenderung menyembunyikan hubungan antara beberapa hubungan

kompleks yang tersirat dalam persamaan (1). Pendekatan KinTek memberikan analisis kontur kepercayaan berdasarkan kesalahan jumlah-kuadrat

pada dan menunjukkan bahwa analisis tersebut cenderung menyembunyikan hubungan antara beberapa hubungan kompleks yang tersirat dalam

persamaan (1). Pendekatan KinTek memberikan analisis kontur kepercayaan berdasarkan kesalahan jumlah-kuadrat padaberpasangan parameter

tersebut, memberikan bukti hubungan yang tersembunyi tersebut. Dia mengilustrasikan kemampuan program KinTek untuk menyesuaikan data yang

diterbitkan dari kasus-kasus yang dibatasi dengan baik dan untuk mengungkapkan kurangnya realitas mekanisme yang diusulkan dalam kasus yang

tidak cukup dibatasi meskipun kecocokan yang tampaknya dapat diterima. NS

Molekul 2013, 18 8234

baru-baru ini dikeluarkan versi 3.0 dari program KinTek memungkinkan solusi simultan dari beberapa kumpulan data,
memungkinkan penerapannya pada pendekatan KIE keadaan sementara yang diusulkan di sini.

Tersirat dalam diskusi Johnson adalah pengenalan konsep baru ke bidang yang ditunjuk
sebagai "FitSpace". Istilah ini mengakui dimensi besar persamaan (1) dari makalah ini sebagai
analog dengan dimensi yang lebih besar dari proses pelipatan protein yang sekarang
umumnya ditetapkan sebagai "ruang lipatan." Versi revisi dari program KinTek baru-baru ini
dikeluarkan yang memungkinkan solusi bersama dari beberapa kumpulan data yang diukur
secara independen. Dengan demikian, di luar peningkatan substansial dalam daya
penyelesaian mekanistik yang disediakan oleh kendala matematis semacam itu, ia memberikan
pendekatan pemasangan global yang unggul untuk pengukuran langsung KIE keadaan-
transien dan memberikan sisa validitas kecocokan yang ketat dari setiap kumpulan data yang
diberikan. untuk mekanisme yang diusulkan. Belum,

5. Pendekatan Baru untuk Masalah

Efek isotop kinetik keadaan tunak (ssKIEs) menurut definisi tidak tergantung pada waktu
dan sinyal tertentu yang digunakan untuk mengukurnya. tKIEs, di sisi lain sangat
bergantung pada waktu dan sinyal (serta pada langkah mekanistik spesifik yang mereka
terapkan). Seperti yang akan kita lihat, sifat-sifat ini memberikan dasar dari paradigma
matematika yang diturunkan secara ketat untuk resolusi mekanistik dari data kinetik
keadaan-transien yang berlaku untuk mekanisme dengan panjang atau tingkat kerumitan
apa pun. Namun, karena reaksi substitusi isotop yang relatif lambat, tKIE yang valid dapat
diperoleh pada batas (t→0) saat waktu reaksi mendekati nol.

6. Metode Eksperimental Keadaan Transien

Dua teknik keadaan-transien yang paling umum digunakan adalah (1) Aliran terhenti (diagram pada
Gambar 1), dan (2) aliran padam (diagram pada Gambar 2).
Dalam pendekatan aliran berhenti, larutan dalam satu jarum suntik yang mengandung enzim saja dan satu yang
mengandung substrat saja dalam jarum suntik kedua secara bersamaan didorong melalui mixer cepat yang
menghasilkan larutan reaktif aliran kontinu sementara yang singkat, melewati perangkat pendeteksi optik. Pada titik
waktu ketika gerakan maju dari dua jarum suntik bertemu dengan penghentian mekanis, larutan campuran yang
bereaksi sebagian memulai reaksinya yang bergantung pada waktu. Lamanya waktu di mana larutan campuran
harus melakukan perjalanan ke perangkat penginderaan (biasanya 1-3 milidetik) ditetapkan sebagai "waktu mati".
Dalam aliran pendinginan, campuran reaksi tidak lagi memasuki jarum suntik ketiga tetapi larutan ketiga
(padam) ditambahkan ke jalur yang mengarah ke bejana pengumpul pada jarak tertentu setelah
pencampuran. Larutan ini melibatkan zat penghenti reaksi cepat seperti asam, hidrofob, atau kriogen. Kurang
dari 15 L larutan diperlukan per reaksi.
Setiap alikuot yang diperoleh kemudian dipecah menjadi entitas kimia spesifiknya yang kemudian
dikuantifikasi dengan teknik analisis yang sesuai seperti HPLC.
Molekul 2013, 18 8235

Gambar 1. Diagram peralatan aliran berhenti yang digunakan dalam pengukuran kinetik. Angka
tersebut diadaptasi dari yang tersedia di hal. 221 [1].

Gambar 2. Diagram alat pemadam aliran yang digunakan dalam pengukuran kinetik. Angka tersebut
diadaptasi dari yang tersedia di hal. 221 [1].

7. Aturan Efek Isotop Kinetik Keadaan Sementara

Kami mendefinisikan efek isotop kinetik keadaan transien pada komponen tertentu, x, pada setiap titik yang dinyatakan dalam

waktu sebagai:

/
(5)
/
di mana "h" dan "d" menunjukkan bentuk substitusi protio dan deuterio dari setiap spesies "x".

7.1. Aturan Pertama KIE Transient-State

Aturan ini menyatakan bahwa untuk setiap Pos Reaksi substitusi situs tunggal:
Molekul 2013, 18 8236

lim tKIEX = KIEke dalam (6)

T 0

dan itu untuk apapun pra langkah sensitif isotop dalam reaksi seperti itu:

lim tKIEX = 1 (7)

T 0

Kedua aspek Aturan Pertama ke urutan reaksi linier yang diasumsikan menggunakan simulasi berdasarkan
integrasi numerik dari persamaan yang diturunkan dari Skema 1 [di mana panah menunjukkan langkah peka-
isotop (iss)] ditunjukkan pada Gambar 3 [8].

Skema 1. Mekanisme reaksi yang diasumsikan.

Gambar 3. Penerapan aturan pertama untuk mekanisme reaksi yang diasumsikan. Contoh ini
mengasumsikan KIE intrinsik = 2,3, dan iss adalah langkah 2 [9].

Dapat dilihat dari gambar bahwa tKIE post-iss untuk reaksi komponen C sampai G
semuanya konvergen ke satu titik yang memiliki nilai tepat dari asumsi KIE intrinsik 2,3. Di
sisi lain, langkah-langkah pra-iss, A dan B, konvergen pada nilai kesatuan. Berbagai seperti
simulasi dengan asumsi nilai yang sangat bervariasi dari kedua konstanta laju dan KIEke dalam mengungkapkan tidak ada
penyimpangan dari prediksi Aturan Pertama.

7.2. Aturan Kedua KIE Keadaan Transien

Dapat dilihat dari Gambar 3 bahwa tKIE dari vTAKRSayaSayaEous/post iss langkah menurun pada tingkat dalam urutan
nomor langkah mereka. Eksplorasi fenomena ini, pertama dengan simulasi dan kemudian dengan derivasi yang ketat
menghasilkan aturan:

n
lim tKIE / (8)
T
 0

dimana nS adalah nomor langkah mekanistik yang sebenarnya, subskrip 1 menunjukkan pos pertama iss, dan subskrip n

menunjukkan jumlah langkah yang berurutan dan I adalah bilangan integral yang sama dengan jumlah langkah
Molekul 2013, 18 8237

termasuk dan mendahului iss [8]. Keabsahan Aturan ini ditunjukkan oleh hasil penerapan persamaan (8) pada
program waktu komponen tKIE pada Gambar 3 yang ditunjukkan pada Gambar 4, yang menunjukkan t→o
perpotongan bilangan bulat sempurna yang berurutan.

Gambar 4. Kursus waktu aturan kedua dari turunan pertama tKIE diterapkan pada mekanisme
yang digambarkan dalam Skema 1. Saya diatur ke nilai 2 di sini seperti yang dipersyaratkan oleh
lokasi iss dalam contoh ini.

Gagasan bahwa persamaan berdasarkan kursus waktu kinetik dapat memberikan bilangan bulat absolut
yang sesuai dengan bilangan langkah mekanistik tampaknya berlawanan dengan intuisi. Akan tetapi, dapat
dilihat dari persamaan 1 bahwa pada pengenalan setiap langkah yang berurutan, sebuah suku baru berbentuk
et ditambahkan ke persamaan. Proses yang digunakan untuk menentukan nilai batas t→0 dalam persamaan
(8) melibatkan penerapan aturan pital L'H. Sifat aturan ini melibatkan diferensiasi berturut-turut. Setiap
operasi tersebut menghasilkan nilai tak tentu 0/0 sampai jumlahnya mencapai nilai "n" untuk langkah reaksi
tertentu. Karena baik jumlah langkah dalam suatu reaksi maupun berapa kali suatu suku terdiferensiasi tidak
dapat berupa pecahan, persamaan (8) hanya dapat menghasilkan nilai integral. Validitas Aturan ini ditunjukkan
dengan penerapannya pada data simulasi Gambar 3 yang hasilnya ditunjukkan pada Gambar 4.

8. Penerapan Aturan Pertama dan Kedua Efek Isotop Kinetik Keadaan Transien pada
Mekanisme Enzimatik

Sistem yang dipilih untuk tugas ini adalah reaksi yang dikatalisis oleh reaksi yang dikatalisis oleh
pyridine nucleotide linked phenylalanine dehydrogenase (PheDH). Stoikiometri kelas enzim ini
reaksi adalah:

L-asam amino + H2O + NAD(P)+ asam -keto + NH3 + NAD(P)H + H+

(9)
A HAI K n R
Huruf tebal yang ditunjukkan di bawah setiap spesies akan digunakan di seluruh laporan ini. A adalahL-
asam amino, K adalah asam -keto, N adalah amonia, O adalah NADP+ (koenzim teroksidasi), dan R adalah
NAD(P)H (koenzim tereduksi). Mekanisme kimia dasar telah ditunjukkan seperti persamaan (10) (singkatan
huruf tebal dalam dua persamaan ini akan digunakan selama pembahasan berikut). Anggota lain
Molekul 2013, 18 8238

kelas memiliki struktur situs aktif yang serupa, dan reaksinya melibatkan urutan kompleks yang
sama [9].

(10)

Pewarnaan pada persamaan (10) dan selanjutnya pada Gambar 5b menunjukkan arah pergeseran puncak
340 nm dari R(NADPH) bebas seperti yang terjadi pada berbagai kompleks. Hasil percobaan khas (absorbansi
vs panjang gelombang vs waktu) ditunjukkan pada Gambar 5a. Dekonvolusi dari "irisan waktu" individu dari
larik ini menjadi komponen tertentu ditunjukkan pada Gambar 5b. Penerapan aturan Pertama dan Kedua
untuk data tersebut ditunjukkan pada Gambar 5-7 (dari referensi [10]).

Gambar 5. (a) Ketergantungan waktu dan panjang gelombang dari absorbansi optik dari
reaksi yang dikatalisis fenilalanin dehidrogenase. Array 121.600 titik eksperimental telah
diuraikan di sini untuk kejelasan. Konsentrasi reaktan akhir setelah pencampuran adalah 45
M PheDH, 1,0 mM NAD dan 1,0 mM h- atau d-L-Ph pada pH 8,0. (B) Resolusi spektrum khas
pada satu titik waktu (80 ms) ditunjukkan oleh lingkaran terbuka. Kepatuhan hukum bir
diperoleh seperti yang ditunjukkan oleh garis padat melalui lingkaran terbuka yang mewakili
jumlah absorbansi semua komponen.

Kursus waktu sementara eksperimental untuk reaksi fenilalanin dehidrogenase untuk -h dan -d fenilalanin
yang dirakit dari serangkaian resolusi yang ditandai pada Gambar 5b ditunjukkan pada Gambar 6.
Molekul 2013, 18 8239

Gambar 6. Kesesuaian simultan dari keempat komponen ke jalur waktu komponen h(protio) dan
d(deuterio) dari tanggal penyelesaian Gambar 3 di mana C dan D mengikuti jumlah komponen merah
dan biru masing-masing. Komponen yang digeser merah ditunjukkan dengan simbol berbentuk berlian
dan komponen yang digeser biru oleh lingkaran. Simbol terbuka menunjukkan komponen tersubstitusi
h; simbol tertutup menunjukkan komponen tersubstitusi d [10].

Penerapan aturan Pertama dan Kedua pada data yang ditunjukkan pada Gambar 5 gagal memberikan integral nS
nilai untuk 3,4 dan 5 langkah penerapan Aturan Kedua. Namun, penerapan integral nS
nilai untuk nomor langkah sebelum dan sesudah penerbitan ke perluasan yang diperlukan dari bagian tengah dari

reaksi dari 4 sampai 7 langkah termasuk 2 langkah pra-iss seperti yang ditunjukkan pada persamaan (11) memenuhi
aturan, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7, memberikan nilai integral wajib yang ditunjukkan pada Gambar 7b. Dapat
dilihat bahwa masing-masing dari dua sinyal merah dan dua sinyal biru yang ditunjukkan oleh data pada Gambar 6a kini
telah dipecah menjadi empat program waktu komponen yang dapat dibedakan dan bahwa iss telah dipindahkan ke
langkah 3. [Ketidaksesuaian teori yang cenderung ke data di wilayah 25–35 ms mungkin karena kesalahan dalam resolusi
spektroskopi atau fitur mekanistik yang belum dikenali dengan jelas dari plot residu yang diperluas di bawah panel a].

Penerapan aturan-aturan ini pada reaksi yang dikatalisis fenilalanin dehidrogenase [10] mewakili pendekatan
model-independen, bebas asumsi, dan multi-langkah pertama yang dapat diterapkan untuk resolusi mekanistik data
kinetik enzim keadaan-transien. Dengan demikian, itu mewakili keadaan seni saat ini. Namun demikian, pemeriksaan
dekat dari panel kesalahan residual mengungkapkan beberapa area penyimpangan kecil namun signifikan yang
menunjukkan kompleksitas mekanistik lebih lanjut yang belum ditemukan.
Penerapan Aturan Kedua yang berhasil ini pada mekanisme fenilalanin dehidrogenase memberikan
ujian yang sangat berat terhadap daya penyelesaian mekanistik aturan tersebut. Berbeda dengan hasil
percobaan aliran berhenti padaL-reaksi glutamat dehidrogenase, yang menghasilkan empat hingga lima
spesies antara yang dapat dibedakan secara spektroskopi, L-percobaan fenilalanin dehidrogenase hanya
menghasilkan dua sinyal yang masing-masing berhubungan dengan setidaknya dua komponen. Namun
demikian, penerapan Aturan Kedua, dengan menggunakan kompleksitas jalur waktu sinyal, mampu
membedakannya menjadi entitas yang kompeten secara kinetik.
Molekul 2013, 18 8240

Gambar 7. Penerapan Aturan Pertama dan Kedua pada reaksi PheDH. (A)
Penerapan kursus Aturan-waktu Pertama tKIEs dari komponen reaksi dengan
asumsi mekanisme enam langkah Persamaan (11). (B) Penerapan Aturan Kedua
menggunakan nS nilai yang dihitung dari kurva pas panel a.

iss n
1 2 3 4 5 6 (11)
E+O+A EOA EOA' ERI ERC ERKN ERK
A B C D E F G

Palfey dan Fagan [11] dieksplorasi ruang lingkup penerapan Aturan Kedua untuk berbagai
pola mekanistik dan mengidentifikasi sejumlah batasan untuk ruang lingkup itu. Aturan ini telah terbukti valid untuk mekanisme

linier dengan panjang berapa pun dan untuk mekanisme yang mengandung loop tertutup yang mengarah ke satu set

produk. Dalam kasus seperti itu, bagaimanapun, nS akan memberi nomor langkah untuk jalur terpendek bahkan dalam kasus di mana jalur

yang lebih panjang mungkin lebih cepat. Aturan gagal hanya dalam kasus di mana mekanisme yang diusulkan tidak memadai

atau di mana mekanisme yang memadai berisi loop terbuka. Dalam kasus seperti itu nS akan menghasilkan rata-rata numerik dari

dua nilai individu yang terpisah; secara umum, nilai seperti itu tidak akan menjadi bilangan bulat sederhana.

Terlepas dari peran dasarnya dalam menerapkan aturan tKIE seperti yang dibahas di atas, pengukuran reaksi
tersubstitusi iss-deuteron (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7) memiliki fungsi tambahan kedua yang sangat
berguna; dengan menyediakan rangkaian kedua dari kursus waktu komponen, mereka menggandakan jumlah
kendala yang dapat diterapkan pada resolusi data keadaan transien dalam hal himpunan persamaan diferensial
yang mengekspresikan mekanisme yang diusulkan.

9. Aturan Ketiga KIE Keadaan Transien

Aturan ini menyatakan bahwa untuk reaksi substitusi isotop bertingkat:

Molekul 2013, 18 8241

Π liim
, (12)
Π M

Secara sederhana, dalam urutan seperti itu, tKIE yang diamati untuk spesies tertentu pada t→0 adalah
produk aljabar dari semua KIE intrinsik untuk langkah-langkah reaksi maju sebelum pembentukan produk dari
langkah ke-n. Palfey dan Fagan telah memberikan derivasi analitik yang ketat untuk aturan ini yaitu
berlaku terutama untuk isotop pelarut (D2O) studi [11]. Sandro Ghisla telah memverifikasi validitas
aturan ini untuk reaksi katalis enzim flavin (komunikasi pribadi). Schneckdkk. sudah mendaftar
aturan ketiga dalam studi KIE pelarut mereka dari protease sistein [12].

10. Ruang Lingkup Penerapan Peraturan tKIE

Sementara pekerjaan eksperimental yang mendukung teori yang dijelaskan di atas didasarkan pada pendekatan
aliran berhenti multi-panjang gelombang yang dijelaskan di tempat lain [13], teori ini juga berlaku untuk teknik aliran
pendinginan yang menerapkan analisis kimia untuk produk yang dilepaskan di berbagai titik dalam transisi. -
menyatakan rentang waktu. Dengan demikian, tidak memerlukan substrat kromoforik atau fluoresen, sangat
memperluas jangkauan sistem enzim dari mana tKIEke dalam nilai dapat diperoleh. Dari fitur ini
dua poin berikut: (1) Sementara hanya rasio massa D/H 2 yang cukup untuk penentuan KIE
dengan perbandingan langsung laju reaksi, telah ditunjukkan bahwa spektrometri rasio-massa dari alikuot
reaksi enzim keadaan tunak cukup akurat untuk memungkinkan pengukuran KIE dari isotop stabil seperti 13C,
15N, dan 18O [1]. weissdkk. menggunakan kombinasi efek KIE hidrogen dan nitrogen keadaan tunak untuk
menetapkan urutan dasar entitas kimia yang umum untuk semua dehidrogenase asam amino terkait-
nukleotida piridin seperti yang ditunjukkan pada persamaan (11) [14]. (2) Pendekatan multinuklear semacam
itu, yang memerlukan penggunaan teknik aliran pendinginan, harus membebaskan tiga aturan tKIE dari
batasan penerapan pada mekanisme pemutusan ikatan CH saja, dan memungkinkan penggunaan potensinya
dalam mengeksplorasi mekanisme mekanisme enzimatik. secara umum. Untuk pengetahuan kita, pendekatan
ini belum dicoba.
Tiga pendekatan untuk penyelidikan kinetik mekanisme katalisis enzimatik, keadaan tunak, aliran berhenti dan
aliran pendinginan tidak boleh dianggap sebagai metode kompetitif atau bahkan alternatif; masing-masing memiliki
kemampuan untuk memberikan kontribusi unik untuk memecahkan aspek-aspek tertentu dari masalah dan masing-
masing memiliki keterbatasan dan titik buta. Dengan demikian, penyelidikan yang tepat dari reaksi enzimatik harus
melibatkan penerapan ketiga pendekatan.
Mengingat temuan K. Johnson tentang ketidakmampuan Chi2 sebagai kriteria kompetensi kinetik dalam referensi [7]
juga jelas bahwa kumpulan terbatas teori analitik yang diturunkan secara ketat dan dapat diterapkan secara eksperimental

yang tersedia saat ini tidak memadai untuk mengambil keuntungan penuh dari tumpah ruah fenomenologis yang
disediakan oleh studi keadaan sementara. Kemajuan lebih lanjut di bidang ini harus dikejar.

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini didukung oleh hibah dari NIH (5R21GM071257).

Molekul 2013, 18 8242

Konflik kepentingan

Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Referensi

1. Masak, PF; Cleland, WWKinetika dan Mekanisme Enzim; Ilmu Garland: New York, NY, AS,
2007.
2. Moore, JW; Pearson, RGKinetika dan Mekanisme; John Wiley & Sons: New York NY, AS,
1981.
3. Bernasconi, CF Kinetika Relaksasi; Academic Press Inc.: New York, NY, AS, 1976.
4. Eigen, M.; de Maeyer, L. Dasar teoritis spektrometri relaksasi. Di dalamTeknik Kimia;
Wiley (Antarsains): New York, NY, AS, 1973.
5. Hammes, GG; Haslam, JL Sebuah penyelidikan kinetik interaksi asam eritro-
betahidroksiaspartat dengan aspartat aminotransferase.Biokimia 1969, 8, 1591–1598.
6. Kirschner, K.; Eigen, M.; Bitman, R.; Voigt, B. Pengikatan nikotinamida-adenin dinukleotida ke
ragi d-gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase: studi relaksasi lonjakan suhu pada
mekanisme enzim alosterik.Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat1966, 56, 1661–1667.
7. Johnson, KA Memasang data kinetik enzim dengan KinTek Global Kinetic Explorer. Metode
Enzim. 2009, 467, 601–626.
8. Nelayan, HF; Palfey, BA; Maniscalco, SJ; Indyk, L. Hubungan antara Ketergantungan
Waktu dari Efek Isotop Kinetik Keadaan Transien dan Lokasi Kompleks dalam Urutan
Reaksi.J. Fisik. Kimia A2006, 110, 4465–4472.
9. Rife, JE; Cleland, WW Mekanisme kinetik glutamat dehidrogenase.Biokimia 1980,
19, 2321–2328.
10. Nelayan, HF; Maniscalco, SJ; Hitungan, J.; Tabanor, K. Penerapan aturan kedua efek isotop
kinetik keadaan transien pada mekanisme enzimatik.Biokimia 2009, 48, 12265-12271.
11. Palfey, BA; Fagan, RL Analisis efek isotop kinetik pada laju awal dalam kinetika keadaan
transien.Biokimia 2006, 45, 13631–13640.
12. Schneck, PL; McDevitt, Wakil Presiden; McQueney, HS; Meek, Mekanisme Kimia TD dari Protease
Sistein, Cathepsin C, Seperti yang Diungkapkan oleh Integrasi Efek Isotop Kinetik Pelarut Steady-
State dan Pre-Steady State.Biokimia 2008, 47, 8697–8710.
13. Fisher, HF pendekatan kinetik Transient-state mekanisme katalisis enzimatik. acc. Kimia Res.
2005, 38, 157–166.
14. Weiss, PM; Klem, CY; Cleland, WW; Cook, PF Penggunaan deuterium primer dan15Efek isotop
N untuk menyimpulkan tingkat relatif langkah dalam mekanisme dehidrogenase alanin
dan glutamat. Biokimia 1988, 27, 4814–4822.

© 2013 oleh penulis; pemegang lisensi MDPI, Basel, Swiss. Artikel ini adalah artikel akses terbuka
yang didistribusikan di bawah syarat dan ketentuan lisensi Creative Commons Attribution (http://
creativecommons.org/licenses/by/3.0/).