Kondisi Hibridisasi, Stringency

Kondisi pemeriksaan Southern blot dan Northern blot harus dioptimalkan secara empiris untuk setiap
target asam nukleat. Keketatan adalah kombinasi kondisi di mana target terkena probe.
Kondisi keketatan tinggi lebih menuntut penyelidikan: komplementaritas target. Kondisi keketatan rendah
lebih memaafkan. Jika kondisi keketatan diatur terlalu tinggi, probe akan tidak mengikat targetnya. Jika
kondisi diatur terlalu rendah, penyelidikan akan mengikat target yang tidak terkait, memperumit
interpretasi dari hasil akhir.

Beberapa faktor mempengaruhi keketatan. Ini termasuk suhu hibridisasi, konsentrasi garam buffer
hibridisasi, dan konsentrasi denaturan seperti formamida dalam buffer. Sifat dari urutan probe juga dapat
menimpa pada tingkat keketatan. Sebuah probe dengan persentase yang lebih tinggi dari basa G dan akan
mengikat di bawah kondisi yang lebih ketat daripada satu dengan jumlah yang lebih besar dari basa A dan
T. Kondisi hibridisasi yang ideal dapat diperkirakan dari perhitungan suhu leleh, atau Tm, dari urutan
probe. Tm adalah cara untuk menyatakan jumlah energi yang dibutuhkan untuk memisahkan untai
hibridisasi dari urutan tertentu (Gbr. 6-13). Pada Tm, setengah dari barisan adalah untai ganda, dan
setengahnya beruntai tunggal. Tm untuk untai ganda Urutan DNA dalam larutan dihitung dengan cara
rumus berikut:

RNA: Hibrida RNA lebih stabil daripada DNA: DNA hibrida karena lebih sedikit kendala oleh
RNA fosfodiester
 Gambar 6-13 Suhu leleh, Tm, adalah titik di mana
tepat setengah dari urutan untai ganda menjadi untai tunggal.
Temperatur leleh ditentukan pada
titik belok dari kurva leleh. DS, beruntai ganda; SS,
beruntai tunggal.

RNA: Hibrida RNA lebih stabil daripada DNA: DNA

hibrida karena lebih sedikit kendala oleh tulang punggung fosfodiester RNA. Oleh karena itu, rumusnya
sedikit berbeda. Untuk RNA: RNA hibrida, rumusnya adalah:

Tm juga merupakan fungsi dari tingkat komplementaritas antara urutan probe dan urutan urutan sasaran.
Untuk setiap 1% perbedaan urutan, Tm berkurang 1,5 C. Selanjutnya, probe RNA Tm lebih tinggi. RNA:
Hibrida DNA meningkatkan Tm pada 10-15 C. DNA: Hibrida DNA meningkatkan Tm pada 20 25 C. Tm
untuk probe pendek (14-20 basis) dapat dihitung dengan rumus yang lebih sederhana:

Suhu hibridisasi oligonukleotida adalah sekitar 5 C di bawah suhu leleh. Pengaruh kompleksitas urutan
pada efisiensi hibridisasi dapat diilustrasikan dengan nilai Cot. Urutan kompleksitas adalah panjangnya
keunikan (nonrepetitive) urutan nukleotida. Setelah denaturasi, sekuens kompleks membutuhkan lebih
banyak waktu untuk berasosiasi daripada sekuens sederhana, seperti polyA: polyU. Cot adalah ekspresi
dari kompleksitas urutan (Gbr. 6-14). Cot sama dengan konsentrasi DNA awal (Co) kali waktu yang
dibutuhkan untuk reanneal (t). Cot1 / 2s waktu yang diperlukan untuk setengah dari urutan untai ganda
untuk anil di bawah serangkaian kondisi tertentu.
Nilai Tm dan Cot dapat memberikan titik awal untuk pengoptimalan kondisi ketat untuk analisis Southern
blot. Hibridisasi pada suhu 25 C di bawah Tm selama 1-3 Cot1 / 2 dianggap optimal untuk DNA untai
ganda menguji. Kondisi akhir harus ditetapkan secara empiris, terutama untuk probe pendek. Kondisi
ketat untuk rutinitas analisis, setelah ditetapkan, akan digunakan untuk semua tes. Dalam hal komponen
prosedur diubah, kondisi baru mungkin harus ditetapkan. Hibridisasi umumnya dilakukan dalam
hibridisasi tas atau dalam silinder kaca. Dalam batas, sensitivitas analisis meningkat dengan
meningkatnya probe konsentrasi. Karena probe adalah pereaksi pembatas, praktis untuk menjaga volume
hibridisasi solusi rendah. Volume hibridisasi yang disarankan buffer adalah sekitar 10 mL / 100 cm2
membran luas permukaan.
Formamida dalam buffer hibridisasi secara efektif menurunkan suhu hibridisasi yang optimal. Ini sangat
berguna untuk probe RNA dan target yang, karena struktur sekunder, lebih sulit untuk didenaturasi dan
cenderung memiliki suhu renaturasi (hibridisasi) yang lebih tinggi. Inkubasi sistem hibridisasi dalam
keadaan tertutup tas di bak air atau di silinder kaca tertutup di rotary oven mempertahankan noda pada
suhu yang tepat.
Probe pendek (20 basa) dapat berhibridisasi dalam 1-2 jam. Sebaliknya, probe yang lebih panjang
membutuhkan waktu hibridisasi yang lebih lama. Untuk Southern dan Northernblots dengan probe
Panjang 1000 basa, inkubasi dilakukan selama 16 jam atau lebih. Meningkatkan konsentrasi probe dapat
meningkat tingkat hibridisasi. Juga, polimer inert, seperti: sebagai dekstran sulfat, polietilen glikol, atau
poliakrilik asam, mempercepat tingkat hibridisasi untuk probe lebih dari 250 basa.