MIKROBIOLOGI

NAMA : KORLENIA SAFITRI

KELAS : XI FARMASI
1 TEKNIK ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
1.1 TEKNIK ISOLASI
Pemisahan mikroorganisme perlu dilakuan untuk mengetahui jenis, karakteristik,
morfologi, fisiologi, kultural mikroorganisme tersebut, yang kemudian dikenal dengan
teknik pemisahan mikroorganisme yang disebut dengan isolasi (Irianto, 2006).

Isolasi merupakan rangkaian untuk memisahkan mikroorganisme sehingga

didapatkanlah kulturmurnu (isolat). Isolat yang didapatkan kemudian ditumbuhkan
pada media yang terpisah sehingga mampu tumbuh dengan baik. Teknik yang
umum digunakan untuk isolasi yaitu dengan metode dilution method (pengenceran
bertingkat). Kemudian dari metode ini dibagi lagi menjadi 3, yaitu :

1. Streak plate technique

Yaitu metode isolasi kualitatif dengan menggoreskan
mikroorganisme yang tumbuh diatas permukaan media padat
dengan menggunakan jarum inokulasi. Cara ini dasarnya ialah
menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah
inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni
terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat
diisolasi lebih lanjut
2. Spread plate technique
Yaitu teknik isolasi dengan cara meratakan enceran campuran
mikroorganisme diatas medium padat secara steril. Metode ini
dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena
konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-
kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni
terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah
memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung
3. Pour plate technique
Yaitu teknik isolasi dengan cara membuat pengenceran secara
berturut turut menggunakan jarum inikulasi dan pipet. Cara ini
dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair
pada temperatur 45-500C dengan suspensi bahan 31 yang
mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri
steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di
permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga
dapat diisolasi lebih lanjut. Kemudian enceran tersebut
dicampurkan dengan agarosa sampai memadat
1.2 IDENTIFIKASI BAKTERI
Identifikasi bakteri merupakan suatu usaha untuk mengetahui jenis serta nama
suatu mikroorganisme dalam satu kelompok tertentu berdasarkan karakteristik
persamaan dan perbedaan yang dimiliki oleh masing masing mahluk hidup.
Identifikasi bakteri dilakukan dengan membanding bandingkan ciri ciri yang ada
dengan bakteri yang belum diketahui sebelumnya. Identifikasi bakteri yang baru
diisolasi memerlukan deskripsi, perincian dan perbandingan yang cukup dengan
deskripsi yang telah di publikasikan untuk mikroorganisme yang serupa.

Proses identifikasi dilakuakn dengan cara pengamatan baik secara morfologi

atau fisiologi. Macam-macam identifikasi yaitu :

1. Identifikasi bentuk koloni

Bentuk umum termasuk melingkar/bulat bertepi
(circular), bentuk seperti akar/pertumbuhan menyebar (rhizoid),
tidak beraturan/tidak bertepi (irregular), berserabut (filamentous),
dan lonjong (spindle).
2. Identifikasi bentuk sel
Bentuk sel dapat diamatidengan mikroskop setelah sel diberi zat
warna misalnya dengan metode pewarnaan sederhana atau
pewarnaan gram. Bentuk se dan letak spora dapat diamati dengan
metode pewarnaan spora, adaya kapsul dapat diamati dengan
pewarnaan kapsul, adanya flagella pada bakteri dapat diamati
dengan pewarnaan flagella
3. Identiikasi reaksi biokimia
Setiap jenis bakteri dapat diidentifikasi genus dan spesies
berdasarkan kemampuannya dalam mereaksikan bahan-bahan
kimia (reaksi biokimia). Contohnya adalah uji katalase, oksidase
sitokrom, lesitinase, hemolise, fermentasi karboidrat, uji hidrogen
sulfida. Media untuk reaksi biokimia dapat dibuat langsung
dilaboratorium atau dibeli dalam bentuk media jadi (KIT). Media ini
biasanya disertai dengan petunjuk pemakaian dan tabel hasil uji
biokimia.
4. Identifikasi reaksi imunologi
Prinsip reaksi imunologi adalah reaksi antara antigen dan antibodi.
Antibodi yang digunakan berupa serum yang sudah diketahui
spesifikasinya. suspensi bakteri (antigen) dicampurkan dengan
serum antibodi didalam tabung reaksi atau dipermukaan kaca
objek, jika terbentuk gumpalan menunjukkan reaksi positif.
5. Pemeriksaan gerak bakteri
1. Cara makroskopik
Bakteri diinokulasikan pada media agar tegak semisolid dengan
cara tusuk lalu diinkubasi. Jika terjadi pertumbuhan pada daerah
 tusukan dan menyebar dipermukaan media menunjukkan reaksi
positif
2. Cara mikroskopik
Cara ini dengan membuat sediaan hidup dari kultur bakteri
dengan cara tetes tegak atau tetes gantung, kemudian dilihat
memakai mikroskop.

2 INOKULASI BAKTERI DAN CARA INOKULASI BAKTERI

2.1 INOKULASI BAKTERI
Penanaman bakteri (inokulasi) adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari
medium yang lama ke medium yang baru. Pekerjaan ini memerlukan ketelitian
dalam keadaan steril baik alat maupun ruanganya yang digunakan untuk inokulasi
bakteri di dalam laboratorium.

Keadaan yang steril ini ditujukan untuk mencegah terjadinya kontaminasi yaitu
masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Ruangan untuk inokulasi di
laboratorium sebaiknya kecil, bersih dan bebas dari angin. Pada waktu mengadakan
inokulasi baik sekali jika meja tempat inokulasi itu didasari dengan kain basah.

2.2 CARA INOKULASI BAKTERI

1. Siapkan biakan murni bakteri Escheria Coli dan Bacillus Subtilis 10
2. Siapkan 6 tabung nutrient cair steril
3. Panaskan ujung ujung jarum ose sampi membara
4. Buka sumbat (kapas) tabung reaksi yang sudah ada biarkan murni bakteri
yang akan ditanam (mulut tabung reaksi tetap dekat dengan lampu bunsen)
5. Jarum ose yang sudah steril dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang ada
bakteri yang akan diinokulasikan dan diambil sedikit biarkan murni
6. Kebalikan tutup tabung reaksi seperti semula dengan menjepit
menggunakan jari kelingking
7. Jarum ose yang sudah ada koloni bakterinya dimasukkan kedalam tabung
reaksi yang ada nutrient cairnya, kemudian aduk-aduk sehingga koloni
bakteri enyebar dalam nutrient agar
8. Tutup tabung reaksi yang sudah ditanami menggunakan kapas
9. Panaskan jarum ose samapi membara supaya bakteri yang masih
menempel mati
10. Inkubasikan hasil inokulasi pada suhu kamar 11

3 PEWARNAAN BAKTERI SEDERHANA, GRAM DAN NEGATIF,

SOPRA
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri dengan mudah.
Pewarnaan gram untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884.

3.1 PEWARNAAN BAKTERI SEDERHANA

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam
zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk
mengetahui morfologi dan susunan selnya. pewarnaan ini dapat menggunakan
pewarnaan basa. Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling
banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat
warna untuk mewarnai organisme tersebut.

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan

sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Sebelum
dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian
difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika
suspensi bakteri terlalu encer maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri
dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel
bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

3.2 PEWARNAAN BAKTERI GRAM

Pewarnaan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan
termasuk pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat
gram positif dan gram negatif. Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram
positif dan Gram negative dapat diamati dengan jelas.

1. Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat sehingga
tidak dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan
(safranin), hal ini disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya,
yang mempunyai afinitas kuat terhadap kompleks crystal violet dan iodine
(jodium).
2. Bakteri Gram negatif tidak mengikat cat utama secara kuat, sehingga dapat
dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan.

N Zat Warna Gram Positif Gram Negatif

O
1 Kristal violet Ungu Ungu
2 Iodin Ungu Ungu
3 Alkohol Ungu Ungu
4 Saframin Ungu Merah

3.3 PEWARNAAN BAKTERI SPORA

Spora bakteri tidak mudah untuk diwarnai, karena spora merupakan bagian sel
bakteri yang mempunyai dinding yang tebal dan keras, sehingga sukar ditembus
oleh zat warna. Oleh karena itu, untuk mewarnai spora perlu dilakukan dengan
pemanasan agar dinding spora retak dan mudah diwamai dan zat pewarna yang
diberikan harus lebih kecil daripada spora bakteri supaya bisa terserap masuk ke
dalam spora.

Tidak semua bakteri berspora, umumnya bakteri yang membentuk spora

bersifat termofil yaitu bakteri yang bisa bertahan hidup pada suhu tinggi. Spora pada
bakteri berfungsi untuk melindungi dirinya dari lingkungan yang tidak
menguntungkan bagi kelangsungan hidupnya. Selama membentuk spora bakteri
tersebut tidak dapat berkembang biak dan untuk berkembang biak bakteri harus
merubah dirinya menjadi sel vegetatif (dalam kondisi lingkungan yang
menguntungkan baginya). Pewarnaan spora dilakukan jika umur bakteri lebih dari 5
x 24 jam.