Penentuan Total Fenolik dan Antioksidan Kapasitas dalam Makanan dan Bahan

PENDAHULUAN

Syarat fenolat mengacu pada beberapa ribu metabolit tanaman aromatik, yang

memiliki setidaknya satu gugus hidroksil yang terikat pada cincin fenil. Di dalam
tumbuhan, senyawa fenolik penting sebagai komponen struktural, khususnya untuk
kesetimbangan dinding sel tanaman, dan sebagai respons terhadap luka. Dalam produk
makanan, fenolat seperti tokoferol dan galat diketahui untuk meningkatkan stabilitas
oksidatif lipid,dan digunakan juga sebagai pewarna makanan dan rasamakanan.
Namun, efek kesehatan dari fenolat banyak senyawa fenolik yang beracun. Makanan nabati
mengandung senyawa fenolik dengan berat molekul tinggi seperti lignin atau domain fenolik
suberin. Pengolahan makanan mengarah pada pembentukan senyawa fenolik baru atau
perubahan yang signifikan pada fenolat nabati. Misalnya, reaksi Maillard menghasilkan
pembentukan produk fenolik, dan fenolat alami digabungkan ke dalam melanoidin, contoh
melanoidin yang paling menojol adalah kopi. Terdapat 4 jenis uji yaitu,uji total fenolat, uji
kapasitas antioksidan berbasis transfer atom hidrogen, uji kapasitas antioksidan berbasis
transfer elektron tunggal, dan uji oksidasi lipid yang dipercepat.

ANALISIS TOTAL FENOLIK

Berdasarkan beragam senyawa fenolik, yang sering dikaitkan dengan senyawa non-

fenolik seperti karbohidrat, untuk menentukan senyawa fenolik dengan uji fenolik
total. Dengan demikian, evaluasi kritis dari hasil yang diperlukan untuk mengklaim
kandungan total fenolik spesifik produk makanan dan bahan makanan. Langkah penting
dalam penerapan uji total fenolik adalah memilih prosedur ekstraksi, untuk menentukan
senyawa fenolik yang akan dimasukkan dalam hasil pengujian. Dan selektivitas yang buruk
dari uji total fenolik.

Persiapan Sampel

Minuman bening seperti anggur putih atau jus apel tidak memerlukan persiapan
lebih lanjut namun digunakan secara langsung atau setelah pengenceran tergantung pada
konsentrasi senyawa fenolik. Buah-buahan, sayuran, sereal, dan bahan makanan olahan
langsung digiling dan diekstraksi. Ekstraksi langsung setelah penggilingan memerlukan
informasi tentang kandungan air dari bahan makanan untuk menyesuaikan skala pelarut
secara teruji selama langkah ekstraksi. Setelah menghancurkan buah atau sayuran segar,
banyak senyawa fenolik terletak pada vakuola dan dapat dengan praktis diekstraksi
menggunakan pelarut yang berbeda setelah dinding sel dan membran pecah.

Ekstraksi

Senyawa fenolik serta konjugat larutnya seperti turunan gula diekstraksi

menggunakan air, pelarut organik polar, atau campuran pelarut organik polar serta air.
Dalam beberapa kasus, pelarut organik yang kurang polar seperti etil asetat digunakan
mengekstrak senyawa fenolik yang kurang polar tetapi mengecualikan fenolat yang sangat
polar . Larutan etanol atau metanol 80% encer bekerja dengan baik sebagian besar bahan
makanan, melarutkan sebagian besar senyawa fenolik serta mengendapkan banyak polimer
seperti polisakarida dan protein.

Hidrolisis

Jenis ikatan umum yang melibatkan senyawa fenolik adalah ikatan glikosidik dan
ikatan ester. Terutama dalam produk sereal dan makanan nabati lainnya, asam fenolik yang
terkait dengan ester. Kondisi basa dapat menurunkan sebagian asam fenolik seperti asam
hidroksisinamat. Untuk mengurangi pengurangan oksidatif, larutan NaOH harus dibersihkan
menggunakan nitrogen, serta bagian atas tabung hidrolisis yang tertutup harus disiram
dengan nitrogen juga.

Uji Kolorimetri untuk Penentuan Fenolik "Total"

Prinsip dan Karakteristik

Tes kolorimetri untuk menentukan kandungan fenolik total didasarkan pada

kemampuan senyawa fenolik untuk dioksidasi. Saat ini, dua reagen yang sering digunakan,
yang awalnya dikembangkan untuk mengukur tirosin dan triptofan asam amino aromatik
tetapi nonfenolik yaitu reagen Folin-Denis dan Reagen Folin-Ciocalteu . Kedua reagen
mengandung ion polimer kompleks yang terbentuk dari asam heteropoli fosfomolibdat dan
fosfotungstat. Fenolat dibentuk dalam kondisi basa dan kemudian dioksidasi, sehingga
mereduksi reagen fosfotungstik-fosfomolibdat yang awalnya berwarna kuning.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa senyawa pereduksi lain selain fenolat dapat
mereduksi reagen Folin ,dengan demikian ditentukan sebagai senyawa fenolik dalam
pengujian ini. Selain asam askorbat dan beberapa vitamin lainnya, banyak senyawa lain
seperti tiol , basa nukleotida, dan ion logam aktif redoks dilaporkan aktif dalam pengujian
ini.

Prosedur FolinCiocalteu

1. Larutan sampel bening ditambahkan ke air suling dalam labu takar.

2. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan, dan dicampur.
3. Setelah 1 menit dan sebelum 8 menit, larutan natrium karbonat 20% ditambahkan,
dan volume diatur.
4. Setelah kurang lebih 2 jam (warna biru sudah stabil), warna yang dihasilkan
ditentukan secara spektrofotometri dalam kuvet 1 cm pada 760 nm.
5. Absorbansi rata-rata blanko bebas fenol (warna kuning harus memudar menjadi
tidak berwarna) / dikurangi.
6. Jumlah total fenolik ditentukan dengan menggunakan kurva standar.
7. Tergantung pada senyawa standar yang digunakan, jumlah total fenolat yang
dilaporkan

Metode Kromatografi
Metode kromatografi sering digunakan untuk mengukur senyawa fenolik individu atau
untuk memantau profil fenolik produk makanan. Namun, tidak cocok untuk mengukur
kandungan fenolik total produk makanan kecuali hanya mengandung beberapa senyawa
fenolik, yang lebih dikenal sebagai senyawa standar. Pilihan metode kromatografi
tergantung pada senyawa fenolik yang akan ditentukan. Semua fenolat yang dapat
diekstraksi secara teoritis sesuai untuk metode kromatografi cair, senyawa fenolik yang
lebih sedikit secara signifikan cukup mudah menguap untuk dianalisis dengan kromatografi
gas (GC) tanpa derivatisasi sebelumnya.

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)

Kromatografi cair kinerja tinggi High Performance Liquid Chromatography (HPLC)adalah

teknik kromatografi cair yang sering digunakan untuk memisahkan berbagai komponen
dalam campuran. Tujuan menggunakan HPLC adalah untuk memisahkan molekul dalam
waktu minimum. Ekstraksi senyawa fenolik sampel langsung disuntikkan ke dalam sistem
HPLC, atau dimurnikan dengan ekstraksi cair/padat. Komponen matriks yang tidak
digunakan diesktrasi dengan air atau campuran air dengan jumlah kecil dan dibuang, dan
diekstrasi dengan pelarut yang mengandung sebagian besar pengubah organik seperti
metanol. Pemisahan senyawa fenolik pada fase gerak dengan fase diam C18 dan fenil-heksil
lebih sering digunakan dalam analisis fenolat dari bahan makanan. Fenil-heksil dapat
tergantung pada sistem gradien yang digunakan, memberikan selektivitas untuk senyawa
aromatik karena interaksi antara fase diam dan analit fenolik. Fase gerak sebagian besar
adalah air dan jumlah pengubah organik yang beragam, dengan metanol dan asetonitril
yang sering digunakan. Seluruh senyawa fenolik adalah UV aktif, menjadikan deteksi UV
sebagai mode deteksi yang diminati. Tergantung pada konjugasi sistem
elektron, penyerapan UV maksimum dapat sangat bervariasi.
Misalnya, asam ferulic dengan sistem elektron yang diperpanjang menunjukkan UV
maksimum sekitar 325 nm, sedangkan asam propionat 3-(3-hidroksi-4-metoksifenil)
memiliki UV maksimum sekitar 275 nm . Dengan adanya detektor array fotodioda mampu
mengukur spektrum penuh UV secara bersamaan di laboratorium analisis.

Kromatografi Gas

Kromatografi gas (KG) adalah metode pemisahan campuran menjadi komponen-komponen

berdasarkan interaksi fase gerak dan fase diam. Fase gerak adalah gas yang stabil sedangkan
fase diam dapat berupa padatan/cairan. Sampel yang dapat dipisahkan dengan metode ini
harus bersifat volatil. Karena senyawa fenolik tidak mudah menguap tanpa dekomposisi,
analisis kromatografi gas fenolat memerlukan derivatisasi. Sililasi menggunakan reagen
derivatisasi seperti nHAI-bistrifluoroasetamida adalah metode derivatisasi yang sering
digunakan senyawa fenolik, menggantikan hidrogen aktif dengan gugus trimetilsilil . Sililasi
dapat dilakukan secara langsung dalam reagen sililasi dengan atau tanpa penambahan
katalis.
Terutama dalam sililasi gugus hidroksil yang terhalang dan dapat ditingkatkan dengan
menggunakan pelarut /katalis aprotik. Sedangkan derivatisasi cukup meningkatkan
volatilitas senyawa fenolik sederhana dan pemisahan GC, fenolat yang lebih besar terutama
jika terkonjugasi dengan gula. Turunan TMS dari fenolat sederhana seperti hidroksibenzoat
dan asam hidroksisinamat dipisahkan dengan baik pada fase GC stasioner nonpolar . Deteksi
dapat dilakukan secara nonspesifik menggunakan flame ionization detector atau lebih
spesifik lagi menggunakan deteksi MS.
Western Blot

Sebagai salah satu immunoassay yang menggunakan interaksi antigen-antibodi untuk

mengetahui adanya protein tertentu dalam suatu sampel, western blot merupakan metode
berbasis laboratorium yang menggabungkan dua teknik, yaitu elektroforesis gel
poliakrilamida dan immunoassay. Pada bagian pertama Western blot, protein dalam
campuran kompleks dipisahkan oleh PAGE menurut massa molekulnya. Bagian kedua,
protein yang dipisahkan menjadi sasaran immunoassays untuk mendeteksi protein
antigenik. Dengan menggunakan kombinasi teknik ini, memungkinkan untuk
mengidentifikasi protein target dan mengkonfirmasi identitas berdasarkan massa molekul.
Protein spesifik dalam jumlah picogram dapat dideteksi pada blot barat yang sangat
sensitif. Untuk menyiapkan sampel protein untuk pemisahan awal oleh PAGE, sampel
biasanya direbus dalam larutan buffer yang mengandung zat pereduksi dan deterjen, untuk
membuka rantai peptida protein. Enzim yang digunakan dalam Western blot berbeda dari
yang digunakan dalam ELISA karena tujuannya adalah untuk membentuk produk berwarna
yang tidak larut agar tetap berada di membran. Intensitas warna dan lebar pita protein
menunjukkan konsentrasi protein target dalam ekstrak sempel.Western blot sangat cocok
untuk analisis sampel makanan yang telah mengalami kondisi pemrosesan.