I.

TINJAUAN PUSTAKA

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan

komponen dalam medium tertentu atau pemisahan larutan senyawa kimia dengan absorpsi
memilih pada zat penyerap, zat cair dibiarkan mengalir melalui kolom zat penyerap, misalnya
kapur, alumina dan semacamnya sehingga penyusunnya terpisah menurut tingkat kepolaran
senyawa, pada sebagian senyawa perbedaan tersebut dapat dicirikan oleh adanya perbedaan
warna.

Metode pemisahan dalam kromatografi menggunakan sistem dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa
gerak. Dalam kromatografi, campuran analit akan dibawa oleh fasa gerak melewati fasa diam.
Ketika melewati fasa diam, senyawa-senyawa yang ada dalam campuran akan berinteraksi
dengan fasa diam dengan afinitas (ketertarikan) yang berbeda-beda. Senyawa yang memiliki
afinitas lebih rendah terhadap fasa diam (tidak begitu terikat pada fasa diam) akan bergerak lebih
cepat daripada senyawa yang memiliki afinitas yang lebih tinggi. Dengan cara inilah campuran
senyawa dapat dipisahkan satu sama lain. Jadi, teknik pemisahan kromatografi didasarkan pada
perbedaan afinitas senyawa analit terhadap fasa diam dan fasa gerak.

Beberapa teknik kromatografi yang banyak digunakan antara lain Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) dan Kromatografi Kolom (KK). KLT merupakan pemisahan komponen kimia
berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi yang ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase
gerak (eluen). Komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben
terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak
dengan jarak yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya. (Alen, 2017)

Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar partisi ke dalam fase diam gel silika,
semakin sedikit waktu yang dibutuhkan fase gerak untuk bergerak menyusuri plat sehingga
semakin pendek jarak tempuh senyawa tersebut menaiki plat dalam waktu tertentu (Syahmani,
dkk. 2017)

Dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT) / Thin Layer Chromatography (TLC), sampel yang ingin
dianalisa akan diteteskan pada pelat, kemudian diletakkan dalam gelas kimia atau chamber yang
berisi larutan pengelusi (fase gerak). Larutan pengelusi ini akan bergerak membawa analit ke
atas di sepanjang pelat berdasarkan prinsip kapilaritas. Pemilihan pelarut akan sangat
mempengaruhi pergerakan analit pada fasa diam. Pelarut yang polar akan cenderung membawa
analit yang lebih polar ketika bermigrasi di sepanjang pelat, begitu pula sebaliknya.

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti
lipida-lipida dan hidrokarbon. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi
kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara
kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.

Ketika kromatografi telah selesai dilakukan, proses visualisasi perlu dilakukan dengan cara
mengaplikasikan reagen pewarna tertentu pada pelat TLC. Reagen ini akan bereaksi dengan
analit menghasilkan titik-titik yang dapat terlihat dengan jelas pada pelat. Metode visualisasi lain
yang dapat digunakan adalah dengan menambahkan senyawa fluoresen, seperti zinc silikat yang
telah diaktivasi dengan mangan, ke dalam material adsorbent.

Setelah proses kromatografi berlangsung, dilakukan identifikasi senyawa hasil pemisahan

dengan KLT, dengan membandingkan kedudukan noda terhadap permukaan pelarut, yang
dikenal dengan nilai RF.

Nilai RF adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh
eluen. Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut
dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel.

Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga
sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan
tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus
berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, maka harus mengurangi kepolaran eluen, dan
sebaliknya. Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal (b) dan
jarak tepi muka pelarut dari titik awal (a).

Jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal

Nilai RF = Nilai RF=
Jarak yang ditempuh oleh pelarut darititik asal

Ada bebrapa hal yang mempengaruhi nilai RF dalam KLT, yaitu :

a. Sifat fasa diam.

b. Kemurnian fasa gerak.
c. Tebal lapisan fasa diam.
d. Jumlah atau banyaknya sampel.
e. Struktur kimia dari senyaa yang dipisahkan.
f. Suhu, pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu tetap.
g. Kejenuhan uap dari fasa gerak dalam wadah yang digunakan (Leba, 2017).

Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang menggunakan zat penyerap (fase
diam) dalam wadah kaca berbentuk buret, fase gerak dituangkan di atas dan menetes di bawah.
Dalam kromatografi kolom, fase diam ditempatkan dalam kolom yang dilewati fasa gerak yang
dipengaruhi oleh adanya tekanan gravitasi.

Kromatografi kolom terbagi dalam kromatografi kolom terbuka (konvensional) dan kromatografi
kolom tertutup. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi
serapan atau adsorpsi. Kromatografi adsorpsi banyak digunakan dalam pemisahan senyawa-
senyawa organik, senyawa-senyawa nonpolar dan konsistuen-konstituen yang sulit untuk
menguap.

Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen

campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom
adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat, metode ini banyak digunakan untuk analisis
biokimia dan organik. Teknik pelaksanaannya dilakukan dengan kolom. Sebagai fasa diam di
dalam kolom dapat dipilih silika gel atau alumina.

Fasa gerak dalam kromatografi kolom bertindak sebagai pembawa campuran, komponen-
komponen campuran akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari
fase diam sehingga terjadi pemisahaan. Fasa gerak dalam analisis kromatografi kolom dapat
berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut dengan komposisi tertentu. Pelarut dapat
merupakan pelarut polar dan pelarut non polar. Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan
murni. Eluen dipilih sedemikian rupa sehingga faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3
supaya meminimalisasi penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang
digunakan pada kromatografi kolom dipilih supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan
secara efektif.

Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah berupa adsorben yang tidak boleh
larut dalam fasa gerak, ukuran partikel fasa diam harus seragam. Fasa diam berbentuk serbuk
microsporous untuk meningkatkan luas permukaan. Fase diamsilika dapat berupa :

1) Silika gel tanpa pengikat (silika gel H dan N)

2) Silika gel dengan pengikat (silika gel G)
3) Silica gel dengan pengikat dan zat berfluoresensi (GF)
4) Slika gel untuk kolom kromatografi (preparatif)

Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang
dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair, ukuran kolom
tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum perbandingan panjang dan
diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya adalah 25-30 kali berat bahan yang
akan dipisahkan.
Kolom serapan yaitu untuk memisahkan suatu campuran, kolom dapat digunakan dan diisi
dengan penyerap zat padat seperti alumina sebagai fasa tetap dan dialiri dengan pelarut seperti
benzena sebagai fasa gerak.

Bila pelarut dibiarkan mengalir melalui kolom ia akan mengangkut senyawa-senyawa yang
merupakan komponen-komponen dari campuran. Kecepatan bergerak dari suatu komponen
tergantung pada berapa besarnya zat terhambat/tertahan oleh penyerap di dalam kolom. Jadi
suatu senyawa yang diserap lemah akan bergerak lebih cepat daripada yang diserap kuat. Akan
terlihat bahwa jika perbedaan-perbedaan dalam serapan cukup besar maka akan terjadi
pemisahan yang sempurna.

Pengisian kolom tidak mudah untuk mernperoleh pengisian kolom yang homogen, tetapi perlu
dicoba hingga mendapatkan hasil yang maksimum. Pengisian yang tidak teratur dari penyerap
akan mengakibatkan merusak batas-batas pita kromatografi. Putusnya penyerap dalam kolom
biasanya disebabkan oleh gelembung-gelembung udara selama pengisian. Untuk mencegah hal-
hal tersebut sedapat mungkin zat pengisi/penyerap dibuat menjadi "bubur" dengan pelarut
kemudian dituangkan perlahan-lahan dalam tabung. Jika penyerap dibiarkan turun perlahan-
lahan dapat dibantu dengan mengguncang perlahan-lahan maka akan diperoleh pengisian yang
homogen. Jika besarnya partikel-partikel penyerap sama, akan lebih mudah untuk mendapatkan
pengisian yang homogen.

Metode pemisahan kromatografi kolom memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai
fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan
campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang cukup lama, bisa berjam-
jam hanya untuk memisahkan satu campuran (Nurdiani,2018).
Faktor yang mempengaruhi kecepatan gerak zat:

a) Daya serap adsorben

b) Sifat pelarut
c) Suhu sistem kromotografi.

Kecepatan turunnya sampel dipengaruhi oleh :

a) Tekanan didalam kolom semakin besar semakin cepat

b) Panjang absorben, makin panjan makin cepat turunnya senyawa
c) Ukuran partikel absorben
d) Rongga udara dalam absorben
e) Jika ada rongga udara dalam adsorben maka jalannya senyawa akan terganggu.