183

O Abbas et al., J. Spektrospeksi Inframerah Dekat. 21, 183-194 (2013)

Diterima: 16 Oktober 2012 n Revisi: 26 Februari 2013 n Diterima: 14 Maret 2013 n Publication: 26 Maret 2013

JURNAL
DEKAT
INFRARED
SPEKTROSKOPI

Deteksi melamin dan asam cyanuric

dalam bahan pakan oleh spektroskopi
inframerah dekat dan kemometrik
O. Abbas, * B. Lecler, P. Dardenne dan V. Baeten
Food and Feed Quality Unit, Valorization of Agricultural Products Department, Walloon Agricultural Research Center
(CRA-W), Chaussée de Namur 24, B-5030 Gembloux, Belgia. E-mail: o.abbas@cra.wallonie.be

Penelitian ini menyelidiki deteksi kontaminasi pakan ternak oleh melamin dan turunannya dengan metode analisis cepat. Tujuan
utamanya adalah untuk mengusulkan alat yang efektif untuk mendeteksi kontaminasi dengan menggunakan persamaan kalibrasi
multivariat yang dibangun di atas database besar bahan pakan yang tidak terkontaminasi. Sampel bungkil kedelai, gluten jagung, dan
gluten gandum terkontaminasi oleh persentase usia melamin dan asam sianurat yang berbeda. Pengaruh aditif ini pada nilai prediksi
inframerah dekat (NIR) protein kasar telah dipelajari. Nilai prediksi protein, dalam hal persentase pemalsuan, dibandingkan dengan yang
diperoleh dengan metode konvensional (Kjeldahl dan Dumas). Penambahan kontaminan menyebabkan peningkatan nilai protein ketika
diukur dengan metode klasik dan penurunan nilai ketika diprediksi oleh model kalibrasi NIR. Di antara modifikasi dalam profil spektral
pakan yang terpengaruh adalah intensitas spektrum sekitar 2170nm, karakteristik penyerapan protein yang mungkin menjelaskan
pengurangan nilai protein prediksi NIR ketika kontaminan ditambahkan. Keuntungan penting dari pendekatan ini adalah deteksi simultan
dari beberapa analit, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi melamin dan asam sianurat pada saat yang bersamaan. Pakan yang
terkontaminasi dianalisis menggunakan basis data bahan pakan umum inframerah dekat (NIR). Persamaan kalibrasi dikembangkan dan
diterapkan pada sampel dalam penelitian ini untuk memvisualisasikan distribusinya sehubungan dengan kumpulan data yang ada yang
tidak mengandung kontaminan. Sampel yang terkontaminasi menyajikan nilai global H (GH) (Mahalanobis distance) lebih besar dari tiga
dan mudah dibedakan dari yang lain. Baik spektrum penuh maupun wilayah spektral yang dipilih antara 2130nm dan 2230nm, termasuk
panjang gelombang yang relevan untuk diskriminasi, digunakan untuk mengembangkan persamaan matematika untuk memprediksi
kandungan protein dan untuk mendeteksi sampel yang terkontaminasi.

Kata kunci: melamin, asam sianurat, kontaminasi, spektroskopi NIR, kemometrik, GH, protein

Pendahuluan
Amerika Utara oleh beberapa produsen makanan hewan
Dalam beberapa tahun terakhir, kepedulian masyarakat
setelah sejumlah kucing dan anjing jatuh sakit dan mati
terhadap keamanan pangan asal hewan meningkat.
setelah memakan makanan hewan yang terkontaminasi.
Kontaminasi pakan telah menjadi penyebab krisis besar
Badan Pengawas Obat dan Makanan AS melaporkan
Eropa, seperti dioksin-poliklorinasi bifenil (PCB),1
2,3 menemukan melamin dalam
kontaminasi produk unggas oleh dioksin,
makanan hewan peliharaan dan dalam sampel gluten
bovine spongiform encephalopathy (BSE) dan mikotoksin.4 gandum yang diimpor dari satu sumber di China. Melamin
Pada tahun 2007, produk makanan hewan ditarik kembali di telah ditambahkan untuk memberikan dorongan buatan pada
 kandungan nitrogen dari makanan hewan. Ada kejadian sakit, beberapa di antaranya meninggal.5
serupa pada September 2008, tapi kali ini berasal dari Masalah ini telah menarik perhatian otoritas pengatur dan
kontaminasi susu formula bayi buatan China dengan tim peneliti untuk praktik pemberian makan dan
melamin, yang menyebabkan ribuan anak dirawat di rumah
ISSN: 0967-0335 © IM Publications LLP 2013 doi: 10.1255/jnirs.1047 Hak cipta dilindungi undang-undang
184 Deteksi Melamin dan Asam Sianurat dalam Bahan Pakan
pakan industri. Penyelidik sekarang percaya bahwa bahan
kimia yang digunakan untuk membuat lem industri,
penghambat api dan pupuk ditambahkan sebagai suplemen
makanan hewan. Pembeli secara rutin mengukur kandungan
nitrogen dari suplemen tersebut untuk menentukan
kandungan protein mereka dan penyelidik menduga bahwa
pemasok berusaha untuk membuat produk mereka tampak
mengandung lebih banyak protein daripada yang sebenarnya
mereka lakukan dengan menambahkan mela mine. Bahan
kimia ini, tanpa nilai gizi, dapat dengan sengaja ditambahkan
ke suplemen pakan untuk meningkatkan kandungan protein
yang nyata. Peraturan Parlemen dan Dewan Eropa, 1831
(2003), berlaku sejak 18 Oktober 2004, mengatur
penggunaan bahan tambahan pada nutrisi hewan untuk
memastikan perlindungan tingkat tinggi terhadap kesehatan
dan kesejahteraan manusia, lingkungan dan kepentingan
pengguna dan konsumen . Ini menetapkan aturan untuk
otorisasi, pemasaran dan pelabelan aditif pakan. Otoritas
Keamanan Makanan Eropa (EFSA) bertanggung jawab untuk
melakukan penilaian ilmiah tentang aditif pakan.6
Secara bersamaan, banyak penelitian telah dilakukan
untuk mengembangkan teknik analisis yang akurat dan
sensitif untuk menilai kualitas dan keamanan produk pakan.
Spektroskopi NIR banyak digunakan sebagai alat kontrol
kualitas yang sukses dalam industri pakan dan nutrisi hewan.
Faktor kualitas utama yang secara rutin dinilai dalam produk
ini adalah nilai energi, bahan kering, lemak, serat kasar dan
kandungan protein kasar. Prediksi kandungan protein kasar
telah dijelaskan dalam beberapa studi yang telah
menunjukkan kegunaan NIR spektroskopi untuk
mengembangkan model prediksi protein dalam gandum,
barley, gandum dan jagung, dalam campuran kelas yang
berbeda gandum10 dan dalam umpan majemuk.11 Jumlah
protein kasar juga telah diukur dengan spektroskopi
reflektansi NIR ketika mempelajari komposisi pakan untuk
kelinci,12 babi,13 unggas,14 dan sapi perah.15 González-Martín
dkk. (2006)16 menggunakan spektroskopi reflektansi NIR dan
probe serat optik reflektansi jarak jauh untuk melakukan
penentuan instan protein kasar, lemak dan serat dalam
pakan ternak.
Spektroskopi NIR telah terbukti berhasil dalam
memprediksi kandungan protein kasar dan telah terbukti
mampu membedakan protein dari sumber nitrogen
non-protein dalam pakan dan produk makanan.17
Kemajuan dalam instrumentasi NIR telah meningkatkan
kecepatan pengukuran dan meningkatkan sensitivitas. Selain
itu, penggunaan analisis kemometrik telah membantu
memperluas penggunaan spektroskopi NIR sebagai alat
analisis. Saat ini, spektrum mudah dikumpulkan dan
diinterpretasikan. Spektroskopi NIR menawarkan cara
sederhana dan andal untuk melakukan pengukuran rutin,
tetapi memerlukan perangkat kalibrasi yang mewakili semua
sampel yang tidak diketahui di masa mendatang untuk
memastikan akurasi persamaan yang dikembangkan.18
Jaringan nasional dan internasional sedang dikembangkan
untuk menawarkan pilihan aplikasi pra-kalibrasi untuk produk
makanan dan pakan dalam analisis kelembaban, protein,
abu, lemak, serat, pati dan parameter fisik lainnya.
Tujuan kami adalah untuk mendeteksi, dengan cepat dan
efisien, sampel yang menyajikan anomali. Dalam kasus krisis
melamin, kontaminan diidentifikasi dalam urin anjing dan
kucing yang mati setelah makan makanan hewan. Asam
sianurat, ditemukan dalam urin
dan melamin bereaksi bersama untuk membentuk kristal
yang dapat menyebabkan masalah ginjal parah yang
menyebabkan kematian. Oleh karena itu, bahan pakan harus
tunduk pada sistem jaminan kualitas yang tinggi dan efisien
berdasarkan analisis kontrol. Beberapa penelitian telah
dilakukan dengan menggunakan spektroskopi NIR untuk
mendeteksi melamin dan/atau untuk menentukan
kandungannya melalui pengembangan metode kemometrik.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa spektroskopi NIR dapat
memberikan cara yang cepat untuk mendeteksi melamin
dalam susu formula bayi. Asal mula kontaminasi melamin
dapat disebabkan oleh penambahan eksternal yang
disengaja pada produk makanan atau pemalsuan bahan
dalam pakan ternak.22,23 Kemudian perlu untuk memeriksa
komposisi pakan untuk mencegah kemungkinan penularan
dari pakan ke makanan. Liu dkk.24 (2010) bekerja pada
deteksi melamin dalam tepung ikan dengan spektroskopi
Fourier transform NIR; mereka mendefinisikan pita
gelombang karakteristik melamin dan melakukan beberapa
percobaan untuk mengukur kehadiran melamin dalam
konsentrasi antara 0% dan 15% dengan mengembangkan
model kuadrat terkecil parsial (PLS).
Dalam penelitian ini, kami menggunakan spektroskopi NIR
untuk mempelajari pengaruh melamin terhadap nilai prediksi
NIR protein kasar dan membandingkan hasilnya dengan
yang menggunakan metode konvensional (Kjeldahl dan
Dumas). Pakan yang terkontaminasi melamine dan/atau
asam sianurat dianalisis untuk dibandingkan dengan
database bahan pakan umum. Untuk prosedur itu,
persamaan kalibrasi dikembangkan dan diterapkan pada
sampel baru ini untuk menentukan kesamaannya terkait
dengan kumpulan data yang ada yang tidak mengandung
bahan pakan yang terkontaminasi.
Bahan dan metode
Sampel
Sebanyak 169 sampel disintesis pakan ternak (65 sampel
bungkil kedelai, 65 sampel gluten jagung dan 39 sampel
gluten gandum) dipelajari. Sampel terdiri dari sampel
terkontaminasi dan tidak terkontaminasi; untuk setiap jenis
sampel yang tidak dipalsukan (bungkil kedelai, gluten jagung
dan gluten gandum), ditambahkan persentase melamin,
asam sianurat atau keduanya, seperti yang dijelaskan pada spektral melamin murni, kami membeli produk dari tiga
Tabel 1. Mereka disintesis dan disediakan oleh perusahaan sumber (VWR, https://be.vwr.com; Sigma–Aldrich,
internasional untuk pakan dan makanan yang sampel www.sigmaaldrich.com dan Fisher Bioblock,
disiapkan dengan mencampurkannya dalam blender. Sampel www.bioblock.be) .
juga dihomogenkan sebelum pengukuran.
Analisis kimia
Bahan Kimia Protein kasar dianalisis menggunakan metode yang
Melamin dan asam sianurat yang digunakan untuk dijelaskan oleh Kjeldahl25 dan Dumas.26 Reagen yang
pemalsuan dibeli oleh perusahaan yang menyediakan digunakan dalam metode Kjeldahl, seperti kalium sulfat
sampel yang terkontaminasi (dijelaskan dalam Tabel 1), dari K2SO4 dan tembaga sulfat
Acros Organics (www. acros.be). Untuk identifikasi profil
O. Abbas et al., J. Near Infrared Spectrosc. 21, 183-194 (2013) 185

Tabel 1. Deskripsi sampel yang dipalsukan oleh melamin, asam sianurat dan keduanya.

% penambahan %asam %campuran

melaminpenambahan sianuratpenambahan

kedelai TepungSM 1.00–3.984 0.50–5.554 0.50–6.054

01

SM02 1.94–6.004 0.53–5.984 1.06–5.414

SM03 2.54–5.544 0.94–3.934 2.04–5.934

SM04 0.53–6.034 1.96–6.044 0.54–4.934

SM05 0.55–5.034 2.54–5.554 1.50–4.504

Gluten jagung GM01 2.00–6.024 0.54–6.024 0.55–5.344

GM02 0.52–4.974 1.02–5.544 0.50–6.094

GM03 1.49–4.584 1.99–6.114 1.10–4.074

GM04 0.55–5.934 0.55–5.044 2.04–6.174

GM05 1.04–5.544 1.51–4.564 2.58–5.554

Gluten gandum GW01 1.07–3.974 0.53–5.554 0.54–5.884

GW02 2.05–6.034 0.53–6.094 1.06–5.614

GW03 2.63–5.584 1.00–3.964 2.17–6.154

4
jumlah sampel yang dipalsukan untuk setiap matriks dan dengan setiap kontaminan .
CuSO4, dibeli dari HUMEAU (,AUTHORS to INSERT URL)
dan asam sulfat H2SO4, natrium hidroksida NaOH, asam
klorida HCl dan asam borat H3BO3 berasal dari VWR. A.
Peralatan Gerhardt digunakan (tipe vapodest 20 c www.gemi
nibv.nl). Untuk analisis pembakaran (metode Dumas), semua
reagen dibeli dari LECO Corporation dan LECO FP-2000
Protein-nitrogen Analyzer (LECO Corporation, St Joseph, MI,
USA) digunakan. Penentuan dilakukan dalam rangkap dua
dan hasilnya dinyatakan dalam g/kg (bahan kering).
Kandungan protein kasar diperkirakan menggunakan faktor
konversi berdasarkan perkiraan persentase nitrogen dalam
protein. Protein kasar kemudian dihitung dengan mengalikan
kandungan nitrogen dengan konstanta berdasarkan
komposisi asam amino rata-rata dari contoh tipikal produk;
faktor nitrogen (N)×6.25 biasanya digunakan untuk produk
pakan.
Akuisisi spektrum
Analisis spektroskopi dilakukan dalam rangkap dua pada
sampel umpan, menggunakan monokromator NIRSystems
6500 (Foss NIRSystems Inc. Laurel, MD 20.723, USA).
Spektrum dikumpulkan antara 400 nm dan 2498 nm, dengan
interval 2 nm dan dengan menambahkan 32 pemindaian.
Spektrum dikumpulkan sebagai log 1R1. Karena beberapa
spektrum sampel dalam basis data bahan pakan umum
dikumpulkan antara 1100 nm dan 2498 nm, hanya wilayah ini
yang diperhitungkan dan wilayah 400-1098nm dikeluarkan.
 Data dikumpulkan menggunakan perangkat lunak ISI mempengaruhi spektrum individu. DT menghilangkan tren
Windows Near-infrared WinISI III—versi 1.50(e) (Infrasoft nonlinier dari data spektroskopi dengan memasang polinomial
International, LLC Foss). Perangkat lunak ini juga digunakan orde tinggi ke setiap spektrum individu, kemudian
untuk pengolahan data dan analisis statistik. menghilangkan kelengkungan garis dasar yang diperkirakan.
Spektrum diproses menggunakan perlakuan turunan (1, 5, 5,
Analisis statistik 1) di mana angka pertama menunjukkan penerapan turunan
Persamaan kalibrasi global dibuat menggunakan database pertama, yang kedua adalah perbedaan titik data di mana
besar yang tersedia di CRA-W yang berisi spektrum semua turunan dihitung, yang ketiga adalah jumlah titik data yang
sampel database bahan pakan ternak (22.689 sampel digunakan dalam pemulusan pertama dan yang keempat
dengan nilai protein laboratorium yang diketahui). Basis data adalah jumlah titik data di mana pemulusan kedua diterapkan.
kalibrasi mewakili variabilitas besar dalam komposisi kimia Persamaan terbaik dipilih berdasarkan kesalahan standar
dan sumber bahan pakan ternak. Kalibrasi global dilakukan terendah dari validasi silang (SECV). Saat menggunakan satu
menggunakan kuadrat terkecil parsial yang dimodifikasi27 persamaan untuk memprediksi sampel baru, tiga tes kontrol
(MPLS—WinISI, Foss, DK) regresi. MPLS sangat mirip diterapkan; lingkungan H (NH) yang harus kurang dari 1,0,
dengan regresi PLS. PLS dimodifikasi dengan menormalkan nilai T outlier yang harus kurang dari 2,5 (sampel dengan nilai
residual reflektansi pada setiap panjang gelombang dan residu tertinggi dihilangkan menggunakan Tkriteria>2,5) dan
sebelum menghitung faktor berikutnya.28 Regresi MPLS GH yang harus kurang dari 3,0. Nilai-nilai ini ditentukan
diterapkan dengan validasi silang empat kelompok dan menggunakan pengaturan standar dalam perangkat lunak
koreksi pencar dengan standar normal variate (SNV) dan WinISI. GH dapat didefinisikan sebagaistandar H jarak(jarak
detrend (DT). Pra-perawatan SNV mengoreksi variasi Mahalanobis) dari spektrum rata-rata.28 Sampel dengan GH
spektral yang terkait dengan ukuran partikel.29 Seperti SNV, lebih besar dari tiga dianggap berbeda dari database.
DT adalah transformasi berorientasi baris yang
186 Deteksi Melamin dan Asam Sianurat dalam Bahan Pakan
untuk menentukan kandungan protein dalam produk di mana
beberapa senyawa hidup berdampingan.
Melamin yang ditambahkan ke sampel pakan yang
dipelajari menyebabkan perubahan bentuk spektrum
Hasil dan Pembahasan senyawa ini (Gambar 2). Bahu pada 1466nm karena
Melamin (atau 1,3,5-triazin-2,4,6-triamin) adalah senyawa penyerapan tambang mela yang ditambahkan muncul pada
organik yang kaya akan nitrogen (66% massa). Strukturnya spektrum sampel yang terkontaminasi. Wilayah antara
memberikan tanda spektral yang kaya akan puncak. 1956nm dan 2226nm juga terpengaruh, tetapi tidak dengan
Penetapan pita utama spektrum (Gambar 1) ke mode cara yang sama untuk semua jenis sampel umpan. Gluten
getaran yang sesuai memberikan informasi rinci tentang gandum menunjukkan sedikit variasi saat menambahkan
struktur melamin (Tabel 2). melamin; hanya peningkatan pita pada 1466nm yang muncul
Puncak pada 1018nm dikaitkan dengan 2 nada atas dari saat melamin ditambahkan. Tepung kedelai dan gluten jagung
nd

grup N–H, sedangkan puncak yang menunjuk pada 1466nm, tampaknya lebih dipengaruhi oleh keberadaan melamin dan
1490nm dan 1520nm dan 1958 nm dapat dikaitkan dengan pita 1956nm, 1992nm, 2096nm dan 2226nm selain yang
nada atas pertama dari N–H. Pita kombinasi muncul pada pada 1466nm muncul pada spektrum sampel yang
1998nm dan 2058nm masing-masing sesuai dengan terkontaminasi. Besarnya perubahan spektral dari melamin
kombinasi deformasi regangan N–H / N–H dan kombinasi tampaknya tergantung pada matriks umpan. Faktanya,
matriks yang dipelajari memiliki ukuran dan bentuk partikel
deformasi ikatan H ikatan / N–H N–H.30 Pita pada 2160 nm
dan 2226 nm dapat dikaitkan dengan getaran struktural 1, 3, yang berbeda. Sampel gluten gandum sebagian besar terdiri
5—triazina. dari partikel yang sangat halus sedangkan partikel bahan
dasar gluten jagung dan bungkil kedelai bervariasi dari halus
Sebuah perbandingan spektrum melamin NIR dengan
hingga rata-rata atau kotor tergantung pada matriksnya.
senyawa kaya protein dilaporkan dalam literatur31
Karena bubuk melamin bersifat elektrostatik, homogenisasi
menunjukkan tidak adanya karakteristik pita protein dalam
yang baik diperlukan, terutama dengan sampel massal
spektrum melamin. Tulang punggung peptida protein
karena hal ini dapat mempengaruhi “visibilitas” melamin
menyajikan pita terutama pada 1600 nm, 2050 nm dan 2180
dalam campuran.
nm, sesuai dengan nada atas pertama amida A dan pita
Deteksi sampel yang terkontaminasi didasarkan pada
kombinasi dari berbagai jenis amida, masing-masing. Dalam
modifikasi spektrum sampel tercemar di wilayah
banyak penelitian, pita sekitar 2180 nm telah dipilih untuk
1100-2498nm, yang disebut sebagai "spektrum penuh"
menentukan kandungan protein dalam pakan atau produk
dalam penelitian ini. Untuk menonjolkan perbedaan,
makanan. Pita ini dianggap tumpang tindih antara pita
diputuskan untuk
serapan 2170nm (peptida) dan 2190 nm (amida).17,32
Yamashita dkk. (1994)17
mencari daerah spektral diskriminatif. Gelombang utama Gambar 1 menemukan bahwa penyerapan pada 2170

nm adalah yang paling stabil

Gambar 1. Spektrum senyawa melamin tercatat antara 400nm dan 2498nm.

 O. Abbas et al., J. Spektrometer Inframerah Dekat. 21, 183-194 (2013) 187Penetapan

Tabel 2.inframerah dekat (NIR) pita spektral melamin.

Panjang gelombang (nm) Tugas

1018 –NH str. nada atas kedua

1466, 1490, 1520 N–H str. nada atas pertama

1958 N–H str. nada atas pertama

1998 N–H str./N–H def. Kombinasi

2058 N–H str. H terikat ditambah N–H def. Kombinasi

2160 Getaran struktur triazinaGetaran struktur

2226 triazina

Str: peregangan, def:deformasi yang

panjangbertanggung jawab atas diskriminasi antara
spektrum disorot menggunakan metode regresi step-up
(tersedia pada perangkat lunak WinISI): ini adalah panjang
gelombang antara 2130 nm dan 2230 nm . Selain itu, wilayah
ini mencakup pita pada 2170nm yang bertanggung jawab
atas penentuan kandungan protein. Itu dipilih untuk penelitian
kami dan akan diberi nama "wilayah yang dipilih".
Penentuan protein
Di antara 169 sampel yang tersedia (Tabel 1), 35 sampel
pakan kosong dan terkontaminasi (nilai yang berbeda dari
kontaminan tambahan) adalah
Gambar 2 yang
dipilih dan dianalisis dengan metode spektroskopi kimia dan
NIR. Sampel yang terkontaminasi oleh melamin, asam
sianurat atau keduanya dipilih untuk mencakup berbagai
variasi konsentrasi aditif dan jenis matriks. Tepung kedelai,
gluten jagung dan gluten gandum dipalsukan oleh salah satu
atau kedua kontaminan melamin dan/atau asam sianurat.
Persamaan kalibrasi dikembangkan menggunakan sampel
dalam database bahan pakan umum dari senyawa pakan
yang tersedia di CRA-W (22.689 sampel bersih dengan nilai
protein laboratorium yang diketahui). Model dihitung pada
"spektrum penuh" antara 1100nm dan 2498nm dan pada
"wilayah yang dipilih" antara 2130nm dan 2230nm. Diukur
 Gambar 2. Pengaruh
kontaminasi oleh melamin dari sampel pakan spektrum (A: 5,57%, B: 3,56%, C: 3,05% dari melamin ditambahkan).
188 Deteksi Melamin dan Asam Sianurat dalam Bahan Pakan
oleh kalibrasi spektroskopi NIR. Sebuah plot yang
menggambarkan evolusi nilai protein
(nilai laboratorium atau nilai prediksi) sebagai fungsi
Nilai referensi protein kasar yang diperoleh dengan analisis persentase melamin dan/atau asam sianurat yang
kimia dibandingkan dengan nilai prediksi yang dihasilkan ditambahkan telah dibuat (Gambar 3).
Gambar 3. Perbandingan antara nilai prediksi nitrogen yang diperoleh dengan analisis spektroskopi (wilayah yang dipilih antara
2130nm dan 2230nm, spektrum penuh antara 1100nm dan 2498nm) dan nilai referensi yang diperoleh dengan analisis kimia [Dumas
dan Kjeldahl) dari sampel yang dipelajari (a): gluten gandum, (b) bungkil kedelai, (c) gluten jagung].
O. Abbas et al., J. Spektrometer Inframerah Dekat. 21, 183-194 (2013) 189
protein yang diperoleh dengan metode Kjeldahl dan Dumas
klasik meningkat, tetapi menurun jika diprediksi dengan
model kalibrasi berdasarkan spektrum NIR. Dalam beberapa
Hasil pada Gambar 3 menunjukkan bahwa nilai Dumas dan kasus, nilai yang diprediksi bahkan negatif.
Kjeldahl sangat mirip, menunjukkan ketepatan kedua metode Dari grafik yang disajikan pada Gambar 3, pengaruh
kimia basah. Rerata selisih antara nilai Dumas dan nilai pematangan pada sampel pakan tergantung pada jenisnya.
Kjeldahl adalah 0,71 untuk sampel kedelai, 0,5 untuk sampel Nilai selisih antara nilai protein terukur dan nilai prediksi tidak
gluten gandum dan 0,17 untuk sampel jagung. Perlu juga sama untuk ketiga jenis senyawa pakan tersebut.
dicatat bahwa nilai prediksi protein kasar berkorelasi terbalik Perbedaannya lebih signifikan untuk bungkil kedelai daripada
dengan nilai referensi. Pada penambahan kontaminan, nilai gluten jagung yang, pada gilirannya, menunjukkan
kesenjangan yang lebih besar daripada gluten gandum.
Selain itu, perbedaan ini juga dipengaruhi oleh jenis dan
konsentrasi relatif melamin atau asam sianurat yang
ditambahkan.
Untuk lebih menggambarkan fenomena ini, kasus gluten
jagung akan disajikan secara rinci, sebagai contoh. Nilai
protein dalam sampel yang diukur dengan metode referensi
Kjeldahl dan nilai prediksi yang diperoleh dengan persamaan
yang dikembangkan pada wilayah yang dipilih dan spektrum
penuh disajikan pada Tabel 3. Jika kita mempertimbangkan
sebagai contoh kasus matriks berkode GM02, nilai yang
dihasilkan dari metode kimia meningkat dari sekitar 64,51
menjadi 79,91% ketika pemalsuan dengan melamin
meningkat dari 0% menjadi 4,97%,
tetapi ada penurunan nilai yang diprediksi baik oleh
persamaan yang dikembangkan pada spektrum penuh (dari
sekitar 65,18 menjadi 48,35 %) atau oleh yang
dikembangkan di wilayah yang dipilih (dari 60,65% menjadi
9,62%) ketika melamin bervariasi dari 0% hingga 4,97%.
Perlu dicatat bahwa dua sampel, GM03 dan GM04 (sebelum
kontaminasi), menunjukkan nilai GH yang sedikit meningkat
yang dapat menjelaskan perbedaan yang diamati dalam nilai
protein yang diprediksi (persamaan dikembangkan pada
spektrum NIR penuh) dibandingkan dengan sampel gluten
jagung non-terkontaminasi lainnya. .
Tabel tersebut juga menunjukkan bahwa perbedaan antara
nilai terukur dan yang diprediksi meningkat tajam dengan
peningkatan kontaminasi. Pengaruh kontaminasi sangat
nyata ketika bahan pezina ditambahkan dalam persentase
yang tinggi.
Metode Kjeldahl dan Dumas memberikan nilai nitrogen
yang tinggi karena nitrogen dari kontaminan diukur sebagai
protein. Sebaliknya, spektroskopi NIR dengan jelas
membedakan antara nitrogen dari protein dan nitrogen dari
sumber lain yang digunakan dalam penelitian ini. Prediksi
nilai atau sifat kimia didasarkan pada korelasi antara pita
spektrum tertentu dan nilai kimia referensi. Penyerapan pada
2170 nm biasanya digunakan untuk menentukan kandungan
protein.17 Intensitas pita ini tidak meningkat dengan
kontaminasi melamin begitu pula nilai prediksi kandungan
protein. Sebaliknya, dalam beberapa kasus ada penurunan
besar. Profil spektral sampel bahan pakan dimodifikasi
dengan adanya melamin dan/atau asam sianurat. Ini mungkin
menjelaskan mengapa nilai protein kasar turun. Pengurangan
ini lebih jelas ketika bekerja pada wilayah spektrum NIR yang
dipilih (2130nm–2230nm).

Tabel 3. Nilai protein diukur dengan metode kimia dan diprediksi dengan teknik spektroskopi untuk sampel gluten jagung.

Contoh Melamine sianurat Jumlah Kjedahl Persamaan di Persamaan di

Identifikasi Added asamditamb Aditif Method spektrum penuh wilayah NIR
(%) ahkan (%) (%) NIR (%) Terpilih (%)
(%)

GM01 0.00 0.00 0.00 65.02 65,18 60,16

GM01-C 0,5457,63 0,00 65,40 64,94 0,54

GM02 0,00 0,00 0,00 64,51 65,18 60,65

GM02-M 0,52 0,00 63,32 0,52

66,1455,25

GM02-M 4,97 0,00 4,97 79,91 48,35 9,62

GM02-X 63,96 0,39 0,53 65,46 0,13 57,75

GM03* 0,00 0,00 0,00 60,85 64,84

64,49

GM03- C 59,53 59,43 1,99 1,99 67,07 0,00

GM03-X 0,94 2,59 3,53 71,66 58,65 58,26

GM04* 0,00 0,00 0,00 60,61 64,15

64,16

GM04-C 0,00 5,04 5,04 71,09 58,43 54,93

GM04-M 1,53 0,00 1,53 69,93 59,17 60,13

GM05 0.00 0.00 0.00 64.02 63.20 60.04

GM05 -X 4,10 1,44 5,55 78,25 51,11 22,48

M: Penambahan melamin, C: Penambahan asam sianurat, X: Penambahan campuran melamin dan asam sianurat,
 *
Sampel yang memilikisedikit meningkat GH nilai; NIR: inframerah dekat
190 Deteksi Melamin dan Asam Sianurat dalam Bahan Pakan
Tabel 4. Performa kalibrasi persamaan yang dikembangkan
berdasarkan database bahan pakan umum dan spesifik (bungkil
kedelai, gluten jagung, dan gluten gandum). Spektrum NIR penuh
digunakan.
Tampaknya melamin lebih berpengaruh pada matriks
SECV 1-VR
pakan daripada asam sianurat. Bahkan, perbandingan nilai
acuan dan nilai prediksi yang diperoleh ketika campuran pakan umum 1.13 0.99
asam sianurat dan melamin ditambahkan ke GM03 dan Bahan
GM05 menunjukkan bahwa peningkatan nilai referensi atau
penurunan nilai prediksi lebih ditandai ketika campuran yang Bungkil kedelai 0.72 0.86
ditambahkan terutama terdiri dari melamin (kasus GM05-X). Gluten jagung 0.74 0.93
Gluten 0.67 0.90
Deteksi outlier gandum
Spektrum NIR sampel yang terkontaminasi terlihat berbeda
dari sampel yang tidak terkontaminasi. Untuk menyelidiki
perbedaan ini, model matematika telah dikembangkan untuk
secara statistik membandingkan spektrum NIR dari senyawa Model MPLS yang dikembangkan pada spektrum NIR
yang terkontaminasi dengan yang ada di database. Dua penuh dipilih berdasarkan parameter statistik untuk
metode dicoba; pertama, persamaan kalibrasi dikembangkan memprediksi H jarak(GH) dengan tepat. Nilai yang dihasilkan
berdasarkan “basis data bahan pakan umum” (sama seperti untuk SECV dan koefisien determinasi dalam validasi silang
yang digunakan untuk prediksi protein), kemudian model (1-VR) tercantum dalam Tabel 4.
kedua berdasarkan “basis data bahan pakan spesifik” yang Penggunaan database besar untuk kalibrasi
berbeda (bungkil kedelai, jagung gluten dan gluten gandum) menguntungkan karena meningkatkan ketahanan kalibrasi,
(Gambar 4). tetapi menurunkan akurasi prediksi (SECV = 1.13)
Kalibrasi MPLS didasarkan pada spektrum database dibandingkan dengan database bahan pakan tertentu
bahan pakan umum yang tersedia di CRA-W. Baik "spektrum (bungkil kedelai, gluten jagung atau gluten gandum), di mana
penuh" 1100-2498 nm dan "wilayah terpilih" 2130-2230 nm SECV masing -masing sama dengan 0,72, 0,74 dan 0,67
dipelajari. Tujuannya adalah untuk mendapatkan persamaan untuk bungkil kedelai, gluten jagung, dan gluten gandum.
yang dapat diterapkan pada sampel bungkil kedelai, gluten Basis data umum mencakup berbagai macam sampel yang
jagung dan gluten gandum apakah terkontaminasi atau tidak. dapat mempengaruhi kinerja model untuk satu kelas atau
Penerapan model tersebut menunjukkan bahwa satu kelompok bahan. Persamaan khusus dikembangkan
persamaan yang dikembangkan menggunakan 2130-2230 hanya pada satu database sampel yang sesuai yang
nm wilayah yang dipilih memungkinkan sampel yang mengarah ke hasil yang lebih akurat.
terkontaminasi untuk lebih baik dibedakan dengan
memberikanlebih tinggi GH yang nilaidibandingkan dengan Deteksi outlier berdasarkan database bahan
yang diperoleh dengan menggunakan spektrum penuh pakan umum
1100-2498nm. Namun, karena tujuannya adalah untuk Salah satu contoh disajikan; yaitu bungkil kedelai. Histogram
menentukan apakah mungkin untuk membedakan atau GH nilaisebagai fungsi persentase (a) melamin, (b) asam
mendeteksi sampel yang terkontaminasi berdasarkan sianurat dan (c) campuran aditif yang ditambahkan, sesuai
spektrumnya tanpa apriori pengetahuan, kami memilih untuk
menyajikan pekerjaan yang dilakukan pada spektrum penuh.

Gambar 4. Skema prosedur yang digunakan untuk menghitungglobal H (GH) dan untuk memprediksi N.
 O. Abbas et al., J. Spektrometer Inframerah Dekat. 21, 183-194 (2013) 191

Gambar 5. Evolusi GH dalam fungsi persentase pemalsuan bungkil kedelai saat menggunakan persamaan bahan pakan umum [(a):
melamin, (b): asam sianurat, (c): jumlah aditif].
ditunjukkan pada Gambar 5. Setiap bagian dari histogram
sesuai dengan satu sampel yang dipalsukan pada berbagai
persentase. Gambar 5. Sampel bungkil kedelai menunjukkan
GH yang nilaibervariasi antara 0,23 dan 0,83 tanpa adanya
kontaminan. Ketika melamin ditambahkan ke matriks SM04
antara 0,53% dan 6,03%, nilai GH meningkat dan bervariasi
antara
3,55 dan 85,77 [Gambar 5(a)]. Penambahan asam sianurat
dengan persentase kurang dari 3,5% tidak mempengaruhi
nilai GH matriks SM01, SM02, SM05. Pada tingkat
kontaminasi ini, asam sianurat memiliki pengaruh yang lebih
kecil daripada melamin [Gambar 5(b)]. Baik melamin dan
asam sianurat kemudian ditambahkan ke sampel bungkil
 kedelai dalam persentase yang berbeda [Gambar 5(c)] yang mengarah ke
192 Deteksi Melamin dan Asam Sianurat dalam Bahan Pakan
asam sianurat.
Deteksi outlier berdasarkan database bungkil
kedelai spesifik Database
GH Nilai7,63 dan 11,61 (SM02) untuk kontaminasi antara bungkil kedelai terdiri dari 8630 sampel yang nilai referensi
1,06% dan 5,41% . Komposisi sampel (SM03 dan SM05) proteinnya sudah diukur dengan kimia basah.
tidak terpengaruh ketika kontaminan ditambahkan pada Gambar 6 menunjukkan bahwa: GH Nilaiuntuk sampel
tingkat sekitar 3%; campuran yang ditambahkan terutama yang tidak terkontaminasi sekitar 3 atau kurang, tetapi lebih
terdiri dari asam sianurat. Selain itu, perbandingan Grafik a, b tinggi ketika melamin, asam sianurat atau keduanya
dan c pada Gambar 5 menunjukkan bahwa, dalam banyak ditambahkan.
kasus, nilai GH yang sesuai dengan penambahan melamin
lebih tinggi daripada yang disebabkan oleh penambahan

Gambar 6. Evolusi GH dalam fungsi persentase pemalsuan bungkil kedelai saat menggunakan persamaan bahan pakan spesifik
kedelai [(a): melamin, (b): asam sianurat, (c) total aditif).
O. Abbas et al., J. Spektrometer Inframerah Dekat. 21, 183-194 (2013) 193

Penambahan melamin ke dalam bungkil kedelai dalam
persentase bervariasi antara 0,53 dan 6,03 menyebabkan
peningkatan GH antara 18,06 dan 1575,18 (SM04).
Penambahan asam sianurat dalam persentase 0,94-3,93
(SM03) menyebabkan GH
nilaiantara 41,89 dan 448,12. The contamination by the
mixture of the additives in percentages varying between 0.50
and 6.05 (SM01) resulted in an increase of GH values from
4.20 to 271.17.
From graphs 6(a), 6(b) and 6(c), it can be noticed that the
influence of one or several contaminants is closely
dependent on the type of soybean meal matrix. This was also
observed when applying the general feed ingredient
database, but GH
values were greater when the specific soybean meal
database was used. In the case of the example of a
contamination by melamine (0%–5%), GH values ranged
from 0 to 269.20 when the general database was used and
from 0 to 1575.18 when the soybean meal database was
used. This can be explained by the fact that, when using the
equation built using exclu sively spectra from the soybean
meal database, higher GH are observed than those obtained
using the equation built on spectra from the feed ingredient
database. This is quite logical and it can be easily explained
by the fact that the vari ability included in the feed ingredient
database is larger due to the database composition. This
database contains not only soybean meal samples, but also
other kinds of ingredient that can, eventually, mask some of
the effects of the contaminant.
Conclusion
The results of this study illustrate the ability of NIR spectro
scopy to detect contamination by melamine and its
derivatives like cyanuric acid in feed samples such as
soybean meal, maize gluten and wheat gluten. The
calibration equations developed enabled the prediction of the
protein content that decreased instead of increasing, as
shown by chemical anal ysis. In addition, the use of a large
robustly gathered feed data base allowed identification of the
adulterated samples with GH
values higher than 3.
The use of a specific feed ingredient database was found to
accentuate the detection of anomalies existing in one sample
type.
Acknowledgement
We thank Dr George Sinnaeve and his technician team for
the reference method analyses.
References
1. C. von Holst, “In-house validation of a simplified method
194 Detection of Melamine and Cyanuric Acid in Feed Ingredients
for the determination of PCBs in food and feedingstuffs”,
Eur. Makanan Res. teknologi. 213, 154 (2001). doi:
10.1007/ s002170100326
2. N. Van Larebeke, L. Hens, P. Schepens, A. Covaci, J.
Baeyens, K. Everaert, JL Bernheim, R. Vlietinck and G.
De Poorter, “The Belgian PCB and dioxin incident of
January–June 1999: exposure data and potential impact
on health”, Environ. Perspektif Kesehatan. 109(3), 265
(2001). doi: 10.1289/ehp.01109265
3. L. Phillips, J. Bridgeman and M. Ferguson-Smith, “The
BSE Inquiry”, 1, in Findings and Conclusions, pp.
887–881. Stationary Office, London, UK (2000).
4. ND Davis, JW Dickens, RL Freie, PB Hamilton, OL
Shotwell, TD Wyllie and JF Fulkerson, “Protocols for
surveys, sampling, post-collection handling and analy sis
of grain samples involved in mycotoxin problems”, J.
American Off.. Anal. Kimia 63(1), 1 (1980).
5. wwwn.cdc.gov/travel/content/in-the-news/melamine
china.aspx. Accessed: 21/5/2009.
6. www.efsa.europa.eu/EFSA/ScientificPanels/FEEDAP/
efsa_locale1178620753812_FeedAdditivesApplications
. htm. Accessed: 21/5/2009.
7. PC Williams and KH Norris (Eds), Near-Infrared
Technology in the Agricultural and Food Industries.
American Association of Cereal Chemists, St Paul, MN,
USA (1987).
8. BA Orman, Jr and RA Schumann, J. Agric. Food Chem.,
39, 883 (1991).
9. PC Williams and DC Sobering, J. Near Infrared
Spectrosc. 1, 25 (1993). doi: 10.1255/jnirs.3.
10. PC Williams, KH Norris and DC Sobering, J. Agric.
Kimia Makanan. 33, 239 (1985). doi:
10.1021/jf00062a021 11. I. Murray and PA Hall, Anal.
Prok. 20, 75 (1983). 12. C. Xiccato, A. Torcino, A.
Carazzolo, M. Meurens, L. Maertens and R. Carabaño,
“Nutritive evaluation and ingredient prediction of
compound feeds for rabbits by near-infrared reflectance
spectroscopy”, Anim. Feed Sci. teknologi. 77, 201 (1999).
doi: 10.1016/S0377- 8401(98)00253-3
13. SLY Chen, A. Hsu and ML Lee, “Application of near
infrared reflectance spectroscopy to compositional
analysis of commercial pig feed mixes”, J. Assoc.
Mati. dubur. Kimia 70, 420 (1987).
14. EV Valdes and S. Leesson, “Near infrared reflectance
analysis as a method to measure metabolized energy in
complete poultry feeds”, Poult. Sci. 71, 1179 (1992). doi:
10.3382/ps.0711179
15. A. Purnomoadi, K. Btajoo, K. Ueda and F. Terada,
“Influence of feed source on determination of ether
extract (DM) and crude protein (CP) in milk by near
infrared spectroscopy”, Int. Dairy J. 9, 447 (1999). doi:
10.1016/S0958-6946(99)00050-3
16. I. González-Martín, N. Álvarez-García and JL
Hernández-Andaluz, “Instantaneous determination of
crude proteins, fat and fibre in animal feeds using near
infrared reflectance spectroscopy technology and a
remote reflectance fibre-optic probe”, Anim. Feed Sci.
teknologi. 128, 165 (2006). doi: 10.1016/j.anifeed
sci.2005.11.007
 spectra of bovine serum albumin in aqueous solutions:
spectral analysis by principal component analysis and
evolving factor analysis”, Appl. Spectrosc. 57(10), 1223
17. H. Yamashita, H. Takamura and T. Matoba, “Effect of (2003). doi: 10.1366/000370203769699072
non-peptide and non-protein nitrogen compounds for 33. H. Kamishikiryo, K. Hasegawa and T. Matoba, “Stability
the determination of protein content by near infrared of 2170 nm as a key wavelength for protein analysis by
spectroscopy”, J. Near Infrared Spectrosc. 2, 145 near infrared spectroscopy”, Nippon Shokuhin Kogyo
(1994). doi: 10.1255/jnirs.41 Gakkaishi 38, 850 (1991). doi: 10.3136/nskkk1962.38.850
18. V. Baeten and P. Dardenne, “Spectroscopy: develop
ments in instrumentation and analysis”, Grasas
Aceites 53(1), 45 (2002).
19. SL Yuan, Y. He, TY Ma, D. Wu and PC Nie, “Fast deter
mination of melamine content in milk base on vis/NIR
spectroscopy method”, Spectrosc. Spectral Anal. 29(11),
(in Chinese) 2939 (2009).
20. YW Dong, ZH Tu, DZ Zhu, YW Liu, YN Wang, JL
Huang, BL Sun and ZN Fan, “Feasibility of NIR spec
troscopy to detect melamine in melamine”, Spectrosc.
Spectral Anal. 29(11), (in Chinese) 2934 (2009).
21. RM Balabin and SV Smirno, “Melamine detection by mid-
and near-infrared (MIR/NIR) spectroscopy: A quick and
sensitive method for dairy products analysis includ ing
liquid milk, infant formula and milk powder”, Talanta
85(1), 562 (2011). doi: 10.1016/j.talanta.2011.04.026
22. CW Cruywagen, MA Stander, M. Adonis and T. Calitz,
“Hot topic: pathway confirmed for the transmission of
melamine from feed to cow's milk”, J. Dairy Sci. 92(5),
2046 (2009). doi: 10.3168/jds.2009-2081
23. JS Shen, JQ Wang, HY Wei, DP Bu, P. Sun and LY
Zhou, “Transfer efficiency of melamine from feed to
milk in lactating dairy cows fed with different doses of
melamine”, J. Dairy Sci. 93(5), 2060 (2010). doi:
10.3168/ jds.2009-2590
24. X. Liu, G. Jia, C. Wu, K. Wang and X. Wu,
“Determination of characteristic wave bands and
detection of melamine in fish meal by Fourier transform
near-infrared spec
troscopy”, J. Near Infrared Spectrosc. 18, 113 (2010).
doi: 10.1255/jnirs.871
25. AOAC Official Methods of Analysis, 16th Edn, Method
No. 979.09. AOAC, Arlington, VA, USA (1995).
26. AOAC Official Methods of Analysis,16th Edn, Method
No. 992.23. AOAC, Arlington, VA, USA (1995).
27. JS Shenk and MO Westerhaus, “Analysis of agricul
ture and food products by near infrared reflectance
spectroscopy”, in Infrasosft International Monograph.
Infrasoft International, Port Matilda, PA, USA (1993).
28. JS Shenk and MO Westerhaus, Crop Sci. 31, 1148
(1991).
29. MS Dhanoa, SJ Lister and RJ Barnes, “On the scales
associated with near-infrared reflectance dif ference
spectra”, Appl. Spectrosc. 49(6), 765 (1995). doi:
10.1366/0003702953964615
30. BG Osborne and T. Fearn, Near Infrared Spectroscopy
in Food Analysis. Longman, Scientific & Technical,
Harlow, Essex, UK (1986).
31. AJ Sadler, JG Horsch, EQ Lawson, D. Harmatz, DT
Brandau and CR Middaugh “Near infrared photoacous
tic spectroscopy of proteins”, Anal. Biokimia. 138(1), 44
(1984). doi: 10.1016/0003-2697(84)90766-8
32. B. Yuan, K. Murayama, Y. Wu, R. Tsenkova, X. Dou, S.
Era and Y. Ozaki, “Temperature dependent near infrared