RINGKASAN BAGIAN ERIKA

 Pemulihan sel sumsum tulang dari tikus C57BL / 6J

Segera setelah pengorbanan tikus CTR dan AWS, sumsum tulang diperoleh dari
kedua tibi dan femur dari kaki belakang tikus 53-56, dan ditempatkan dalam larutan
fisiologis (NaCl). Sumsum tulang terganggu dengan ujung tumpul dari alat suntik 5-ml.
Sel sumsum tulang diisolasi menggunakan saringan sel FalconVR 100mm (Corning, NY),
mendapatkan suspensi sel tunggal yang seragam dari sumsum tulang. Suspensi sel
tunggal dicuci dua kali dalam PBS dan segera diproses untuk analisis berikut.

 Pemulihan sel germinal ovarium dari tikus C57BL / 6J

Segera setelah tikus CTR dan AWS dikorbankan, ovarium dibedah dari sistem
reproduksi53-55,57 dan ditempatkan dalam larutan fisiologis (NaCl) dengan 1% tripsin
dan 0.1mM EDTA. Indung telur diisolasi dari sistem reproduksi yang tersisa dengan
pemotong dan kemudian diganggu dengan ujung tumpul dari alat penyedot 5 ml. Sel
germinal ovarium diisolasi menggunakan saringan sel FalconVR 100mm (Corning, NY),
jaringan ikat dan kotoran dibiarkan mengendap, memperoleh suspensi sel tunggal yang
seragam dari jaringan ovarium. Suspensi sel tunggal dicuci dua kali dalam PBS dan
segera diproses untuk analisis berikut.

 Deteksi telomerase dengan uji ELISA

Penentuan konsentrasi telomerase tikus secara kuantitatif dilakukan pada preparat
plasma yang diperoleh dari mencit CTR dan AWS sesaat sebelum pengorbanan. Untuk
tujuan ini, alat tes ELISA sandwich-colori- metrik, Kit ELISA Mouse TE (telomerase)
(ElabsciencesVR, Houston, TE) digunakan. Densitas optik (OD) diukur secara
spektrofotometri pada panjang gelombang 450 ± 2 nm.

 Deteksi telomer dengan PNA kit / FITC untuk aliran sitometri

Deteksi telomere dilakukan pada sel sumsum tulang dan pada sel germinal ovarium
mencit CTR dan AWS didapatkan segera setelah pengorbanan. Untuk tujuan ini, Telomer
PNA Kit / FITC untuk Flow Cytometry (Dako - Agilent, Santa Clara, CA) digunakan. Kit ini
memungkinkan deteksi telomer dalam sel hematopoietik berinti menggunakan
hibridisasi in situ fluoresensi dan probe asam nukleat peptida terkonjugasi fluoresens
(PNA). Hasil dievaluasi dengan aliran sitometri menggunakan sumber cahaya dengan
eksitasi pada 488 nm.

 Total uji ROS

Analisis total level ROS dilakukan dalam preparat plasma yang diperoleh dari tikus
CTR dan AWS sebelum sakramen. Untuk tujuan ini, Kit Pengujian spesies oksigen reaktif
total (ROS) 520nm (ThermoFisher, Waltham, MA) dieksploitasi. Sampel plasma
diinkubasi dengan 100mL dari 1 ROS Assay Stain selama 60 menit dalam inkubator 37 C
dengan 5% CO2. Sampel diperlakukan dengan reagen yang diinginkan untuk
menginduksi produksi ROS dan dianalisis pada microplate reader dari 488 nm (laser biru)
di saluran FITC.

 Deteksi GSH dan uji kuantifikasi

 Deteksi dan kuantifikasi kadar glutathione total (GSH) dilakukan pada preparat
plasma yang diperoleh dari tikus CTR dan AWS sebelum pengorbanan. Untuk tujuan ini,
uji kolorimetri, Glutathione Colorimetric Detection Kit (ThermoFisher) digunakan. Untuk
mendapatkan sampel plasma, darah mencit C57BL / 6J yang diberi EDTA disentrifugasi
pada 400 g selama 20 menit, plasma dikumpulkan dan segera dianalisis. Sampel
diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar setelah penambahan reagen deteksi dan
campuran reaksi. Kepadatan optik tercatat pada 405 nm.

 Uji aktivitas SOD

Deteksi dan kuantifikasi aktivitas superoksida dismutase dilakukan pada preparat
plasma yang diperoleh dari mencit CTR dan AWS sesaat sebelum pengorbanan. Untuk
tujuan ini, uji aktivitas kolorimeter, kit Aktivitas Pembuangan Superoksida
(ThermoFisher, USA) digunakan. Untuk mendapatkan sampel plasma, darah tikus yang
diberi EDTA dari tikus C57BL / 6J disentrifugasi pada 400 g selama 20 menit, plasma
dikumpulkan dan segera dianalisis. Sampel diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar
setelah penambahan substrat dan reagen deteksi kromogenik. Kepadatan optik tercatat
pada 450 nm.

 Analisis statistik
Hasil dalam teks dinyatakan sebagai sarana ± kesalahan standar (SE), dihitung
menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism (San Diego, CA). Analisis statistik
dilakukan dengan uji-t tidak berpasangan (uji-t Student). Signifikansi statistik ditetapkan
pada p <0,05.

ABSTRAK
Panjang telomer dan aktivitas telomerase saat ini dianggap sebagai stigmata
molekuler yang menua. Air adalah kebutuhan utama tubuh kita dan air harus bersifat basa.
Laporan terbaru menunjukkan bahwa penuaan terkait dengan asupan air yang berkurang.
Kami ingin menyelidiki pengaruh asupan harian air alkali pada ciri molekuler penuaan dan
respons anti-oksidan. Kami menyirami model tikus yang menua dengan atau tanpa
suplementasi alkali. Setelah 10 bulan, kami mendapatkan darah, sumsum tulang dan
ovarium dari kedua kelompok. Di dalam darah, kami mengukur kadar ROS, SOD-1, GSH, dan
aktivitas telomer dan menganalisis panjang telomere di sumsum tulang dan ovarium. Kami
menemukan penurunan kadar ROS dan peningkatan SOD-1, GSH, aktivitas telomerase, dan
panjang telomer pada tikus yang diberi suplemen alkali. Kami tunjukkan di sini bahwa
penyiraman dengan menggunakan suplementasi air alkali sangat meningkatkan penuaan
pada tingkat molekuler.

INTRODUCTION

Proses progresif dan tampaknya tak terhentikan untuk menjadi lebih tua dari hari ke hari,
juga disebut penuaan, memang merupakan proses fisiologis yang umum bagi hampir semua
makhluk hidup, tetapi Prokariota, Protozoa, dan ganggang yang secara bawaan abadi1,2.
Literatur sebelumnya sangat mendukung kemungkinan patogenesis multifaktorial penuaan
termasuk faktor yang telah ditentukan sebelumnya dan yang berhubungan dengan
kerusakan3. Selain itu, spektrum penyakit yang luas telah dikaitkan dengan penuaan
termasuk tumor dan penyakit neurodegeneratif4–8.

Dari sudut pandang molekuler, struktur yang secara langsung terlibat dalam penuaan sel
adalah telomer9,10. Telomer adalah daerah DNA yang sangat berulang di setiap ujung
kromosom, yang melindungi daerah ini dari rekombinasi, degradasi dan fusi antar
kromosom5,6,11. Telomer mamalia terdiri dari pengulangan tandem dari urutan TTAGGG
yang terkait dengan enam kompleks protein pelindung telomer spesifik yang melindungi
ujung kromosom8,11-13. Dengan demikian, semua investigasi yang bertujuan untuk
menyelidiki penuaan dari sudut pandang molekuler telah mengukur aktivitas telomerase
(enzim yang secara langsung terlibat dalam pemanjangan telomer) dan panjang
telomer5,6,14.

Namun, sementara tampak jelas hingga saat ini bahwa pemendekan telomer adalah bukti
molekuler dari penuaan progresif pada tingkat sel, ada informasi yang buruk tentang
mekanisme mana yang dapat mengarah pada proses yang tampaknya tak terhentikan
ini3,15. Beberapa bukti baru-baru ini menunjukkan pertama bahwa akumulasi racun yang
progresif, seperti oksidan, dalam tubuh kita dapat mempercepat penuaan pada tingkat
sel16-18. Jadi, salah satu cara yang mungkin untuk menghadapi penuaan adalah dengan
mengurangi produksi oksidan dan akumulasi selanjutnya ke dalam jaringan. Ini tentu saja
tampak sangat mungkin dan masuk akal; namun, kami tidak memiliki banyak anak panah
untuk mencoba strategi anti-oksidan yang layak19.

Salah satu kebutuhan terpenting bagi tubuh kita adalah air. Air adalah salah satu kebutuhan
esensial untuk kehidupan yang tidak diproduksi oleh tubuh kita (yaitu tidak ada gen yang
mengkodifikasi untuk produksi air) 20,21. Di sisi lain, tubuh kita cukup tangguh untuk
bekerja meski dengan asupan air yang sedikit. Faktanya, terlepas dari jenis kelamin, orang
lanjut usia biasanya memiliki sekitar setengah dari air tubuh% dibandingkan dengan bayi
yang baru lahir, dan ini mungkin karena fakta bahwa mereka minum lebih sedikit air21, 22.

Selain itu, penelitian terbaru melaporkan bahwa panjang telomer mungkin sangat
dipengaruhi oleh variasi pH lingkungan mikro23. Faktanya, telomerase manusia dapat
diinduksi untuk secara selektif memperpanjang telomer pendek dengan paparan pH rendah
(6,8) 23. Telah diketahui fakta bahwa lingkungan mikro tumor ganas bersifat asam dan
alkalinisasi lingkungan mikro tumor sangat mengganggu pertumbuhan dan perkembangan
tumor24,25. Namun, pengasaman jaringan juga merupakan ciri metabolik dari diabetes tipe
II26. Yang menarik adalah telomer yang lebih pendek, tetapi bukan panjang telomer rata-
rata, terkait dengan penurunan viabilitas dan penuaan sel27. Faktanya, pemendekan
telomer memicu respons kerusakan DNA, yang pasti mengarah ke apoptosis sel atau
penuaan8,27. Tingkat telomerase rendah, mis. karena pH rendah ekstraseluler, terkait
dengan telomer pendek, kondisi kritis yang cepat berakhir dengan kematian sel dan
penuaan23. Sementara peran kritis telomere dalam kanker dan penuaan tampak jelas,
mekanisme bahwa in vivo dapat mempengaruhi telomer baik pemendekan atau
pemanjangan tidak cukup dieksplorasi4–6,9,10,28–32. Satu hipotesis menyatakan bahwa
pemanjangan telomer diatur oleh perekrutan telomerase secara istimewa ke telomer
pendek; satu hipotesis lain menunjukkan bahwa telomerase ada dalam keadaan tidak aktif
atau aktif, dan bahwa telomerase tidak aktif pada telomer panjang dan aktif pada telomer
pendek33. Kedua hipotesis ini tampaknya tidak saling eksklusif, dan yang paling utama kita
tidak tahu apakah salah satu mungkin lebih bekerja pada penuaan normal dan yang lainnya
mendukung penyakit seperti kanker.
Dalam penyelidikan sebelumnya, kami telah menunjukkan bahwa pengobatan oral dengan
Fermentasi Pepaya (FPPVR) menginduksi penghambatan pertumbuhan tumor yang jelas
dalam model melanoma yang sangat agresif; hasil ini konsisten dengan penurunan spesies
oksigen reaktif (ROS) dan peningkatan molekul anti-oksidan alami seperti SOD-1 dan
glutathione dalam darah tikus yang diberi perlakuan34.

Namun, telah dilaporkan bahwa pemberian air alkalin secara in vivo menyebabkan
penundaan penuaan tikus35, mendukung peran kunci air alkali dalam setidaknya
memperlambat proses penuaan.
Selain itu, ada beberapa molekul yang telah terbukti menjadi kunci dalam banyak proses
terkait penuaan (yaitu asam borat, kalium klorida, natrium klorida, kalium hidroksida,
natrium molyb-date dihidrat, natrium selenit). Secara khusus, boron, molibdenum dan
selenium memiliki fungsi yang sangat penting dalam proses metabolisme manusia. Boron
merupakan elemen penting dalam banyak jalur metabolisme manusia dan hewan36. Lebih
lanjut, boron terlibat dalam induksi respons antioksidan terhadap ROS36-38, dalam
metabolisme kalsium dan akibatnya dalam pertumbuhan tulang39, dengan peran potensial
dalam pengeroposan tulang pada periode pascamenopause40. Molibdenum adalah elemen
jejak penting di sebagian besar organisme dengan peran kunci dalam harapan hidup41.
Enzim yang mengandung molibdenum, menggunakan air sebagai donor atau akseptor
oksigen, mengkatalisis oksidasi dan terkadang reduksi molekul kecil dalam metabolisme
nitrogen, sulfur dan karbon42. Defisiensi molibdenum berhubungan dengan kanker
esofagus43-45, dengan tingkat sulfit dan urat yang tinggi dan dengan kerusakan
neurologis46,47. Selenium adalah elemen penting yang secara alami terkandung dalam
banyak makanan termasuk ikan, daging, susu dan turunannya, ragi pembuat bir, sereal,
kacang-kacangan, jamur, buah-buahan dan sayuran48. Selenium merupakan kebutuhan
esensial untuk spektrum yang luas dari aktivitas metabolik, berkat aktivitas
antioksidannya49. Penyakit metabolik seperti hiperglikemia, hiperlipidemia, dan
hiperfenilalaninemia ditandai dengan defisiensi selenium, sedangkan suplementasi selenium
dikaitkan dengan efek menguntungkan pada aterosklerosis, hiperkolesterolemia, diabetes
mellitus tipe 1 dan fenilketonuria49.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki peran potensial air alkali yang dilengkapi
dengan elemen yang dibahas di atas dalam meningkatkan tanda-tanda molekuler penuaan,
seperti aktivitas telomerase dan panjang telomer, yang konsisten dengan induksi respons
antioksidan sistemik.