Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
Journal of Analytical Toxicology 2015;39:519–525 doi:10.1093/jat/
bkv051 Publikasi Advance Access 10 Mei 2015
Metode Validasi untuk Kuantifikasi Buprenorfin dalam Darah Postmortem Menggunakan
Ekstraksi Fase Padat dan Kromatografi Gas Dua Dimensi – Spektrometri Massa
Limon Khatun Nahar*, Unit Toksikologi Rebecca Andrews dan
Sue Paterson, Imperial College London, London, Inggris
* Penulis kepada siapa korespondensi harus ditujukan. Email: l.nahar@imperial.ac.uk
Sebuah metode yang sangat sensitif dan sepenuhnya divalidasi
dikembangkan untuk kuantifikasi buprenorfin dalam darah
postmortem. Setelah proses pengendapan protein dua langkah
menggunakan asetonitril, buprenorfin dimurnikan menggunakan
kartrid ekstraksi fase padat mode campuran (pertukaran C8/kation).
Senyawa dan lipid endogen yang larut dalam air dikeluarkan dari
kartrid sebelum sampel dielusi, dipekatkan, dan diturunkan
menggunakanN-metil-N-trimetilsililtrifluoroasetamida. Sampel
dianalisis menggunakan kromatografi gas dua dimensi-spektrometri
massa (2D GC-MS) dalam mode pemantauan ion selektif. Rxi . polaritas
rendah--5MS (30 m 3 0,25 mm ID 3 0,25 Mm) digunakan sebagai kolom
primer dan kolom sekunder adalah Rxi . dengan polaritas menengah- -
17Sil MS (15 m 3 0,32 mm ID 30,25 MM). Pengujiannya linier dari 1,0
hingga 50,0 ng/mL (R2 > 0,99;n 5 6). Intra hari (n 5 6) dan antar hari (n 5
9) ketidaktepatan (persentase standar deviasi relatif, % RSD) <5% dan
pemulihan rata-rata adalah 60%. Batas deteksi (LOD) dari metode ini
adalah 0,5 ng/mL dan batas kuantifikasi adalah 1,0 ng/mL. GC-MS 2D
meningkatkan LOD buprenorfin sebanyak 20 kali lipat dibandingkan
dengan analisis pada GC-MS konvensional. Metode ini sangat selektif
tanpa campur tangan dari senyawa endogen atau dari 62 obat yang
biasa ditemui. Untuk membuktikan penerapan metode untuk kasus
postmortem forensik, 14 sampel darah postmortem otentik dianalisis.
pengantar
Buprenorfin adalah opioid semi-sintetik yang sangat lipofilik yang berasal
dari alkaloid opium oripavaine (suatu metabolit thebaine) yang terjadi
secara alami (1). Secara kimiawi mirip dengan morfin, tetapi potensinya
20-40 kali lebih besar (1-3). Sejak diperkenalkannya buprenorfin pada tahun
1999 (4), telah berhasil digunakan untuk pengelolaan nyeri sedang hingga
kronis dengan rute pemberian intravena, intramuskular dan sublingual dan
untuk pengobatan ketergantungan opioid (3, 5). Ini tersedia di Inggris
dalam formulasi rendah dan tinggi; 0,2-0,8 mg/hari untuk efek analgesiknya
dan dosis yang lebih tinggi hingga 32 mg/hari digunakan untuk
pengobatan ketergantungan opioid (5, 6). Karena buprenorfin adalah
agonis parsial, ia memiliki potensi ketergantungan fisik yang lebih rendah
yang meminimalkan efek penarikan ketika penggunaannya dihentikan; oleh
karena itu, ini adalah mode pengobatan ketergantungan yang disukai (7, 8).
Dalam sebuah penelitian tentang penggunaan analgesik buprenorfin, dosis
intravena 0,3 mg menunjukkan konsentrasi rata-rata 0,5 ng/mL dalam
plasma 2 jam pasca-dosis.9). Subjek yang menjalani terapi pemeliharaan
sublingual 8 mg/hari dengan buprenorfin biasanya memiliki konsentrasi
berkisar antara 1 hingga 8 ng/mL dalam plasma (10). Kisaran terapeutik
yang dikutip untuk buprenorfin bervariasi. Beberapa mengklasifikasikan ,5
ng/mL dalam plasma sebagai terapi, sementara yang lain menyarankan
2-20 ng/mL (11-13).
Buprenorfin mengalami metabolisme lintas pertama di hati
manusia untuk menghasilkan metabolit aktif N-dealkylbuprenorfin
# Penulis 2015. Diterbitkan oleh Oxford University Press. Seluruh hak cipta. Untuk Izin, silakan email: journals.permissions@oup.com
Artikel
(norbuprenorfin) oleh sitokrom P450 3A4 (14). Baik buprenorfin dan
norbuprenorfin dimetabolisme lebih lanjut oleh glukuronidasi.5, 15).
Meskipun norbuprenorfin adalah metabolit aktif, permeabilitasnya
yang rendah ke dalam otak berarti memiliki sedikit efek analgesik.
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/39/7/519/818763 oleh tamu pada 02 November 2021
Setelah pemberian buprenorfin kronis, konsentrasi norbuprenorfin
menyebabkan sedikit depresi pernapasan (16). Meskipun kuantifikasi
norbuprenorfin akan menarik, mekanisme yang tepat dari depresi
pernapasan oleh norbuprenorfin pada manusia masih kurang
dipahami. Dalam sebuah penelitian terhadap 20 kasus postmortem,
tidak ada pola yang konsisten yang diamati antara konsentrasi
buprenorfin dan norbuprenorfin (5). Sebagian besar penelitian yang
berkaitan dengan efek pernapasan norbuprenorfin telah dilakukan
dengan menggunakan tikus (16-18). Perbedaan terlihat antara
konsentrasi norbuprenorfin yang menyebabkan depresi pernapasan
pada tikus dan yang ditemukan pada kematian manusia terkait
dengan buprenorfin. Konsentrasi norbuprenorfin, yang menyebabkan
depresi pernapasan pada tikus, -100 kali lebih besar daripada yang
diamati pada kematian manusia yang terkait dengan buprenorfin (17).
Hal ini menunjukkan perbedaan besar dalam modus toksisitas antara
manusia dan tikus, atau bahwa ada kurangnya korelasi antara
konsentrasi norbuprenorfin dan kematian pada manusia. Oleh karena
itu sulit untuk menafsirkan peran yang tepat, jika ada, norbuprenorfin
dalam kematian manusia.
Ada peningkatan substansial dalam jumlah resep buprenorfin untuk
pengobatan ketergantungan opioid (19,20) dan dalam ketersediaan
gelapnya di pasar gelap (2, 21). Dari survei, telah ditunjukkan bahwa
mayoritas orang yang menyalahgunakan obat melakukannya untuk
pengobatan sendiri ketergantungan opioid mereka atau untuk
mengurangi rasa sakit. Hanya sedikit yang dilaporkan
menyalahgunakan obat untuk mendapatkan efek euforia (22, 23).
Telah dilaporkan bahwa pelaku terkadang menghancurkan tablet
buprenorfin dan kemudian menyuntikkan atau meminumnya dengan
insuflasi (2, 22). Sejak diperkenalkannya buprenorfin dosis tinggi, 14
kematian telah dilaporkan di Inggris; dalam setiap kasus, almarhum
menyalahgunakan buprenorfin dengan kombinasi obat lain (24). Telah
didokumentasikan bahwa bahkan pada konsentrasi terapeutik,
buprenorfin dapat berakibat fatal bila dikonsumsi dengan obat-obatan
psikotropika dan/atau alkohol dalam jumlah yang tidak mematikan (2,
4, 5, 25). Dalam tinjauan 39 kasus postmortem, konsentrasi
buprenorfin dalam darah postmortem berkisar antara 1,10 hingga
17,88 ng/mL (17). Dalam survei lain kematian yang terkait dengan
buprenorfin, rentang konsentrasi yang diamati adalah 0,7-17,1 ng/mL
dalam darah postmortem (25).
Dalam toksikologi postmortem, metode eksperimental
karena itu harus cukup sensitif untuk mendeteksi buprenorfin
pada konsentrasi ini.
Banyak metode analisis saat ini tersedia untuk analisis
buprenorfin: kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) (3, 26, 27),
kromatografi gas-spektrometri massa
(GC–MS) (28, 29) dan kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS)
atau spektrometri massa tandem (LC-MS-MS) (13, 14,25, 30-32). Untuk
mencapai sensitivitas yang diperlukan untuk kuantifikasi buprenorfin,
sebagian besar metode telah dikembangkan menggunakan LC-MS-MS.
Namun, instrumen ini memiliki keterbatasan karena menghadapi
masalah analisis karena efek matriks (5). Ini mungkin lebih terlihat
pada sampel darah postmortem karena mereka berada pada keadaan
dekomposisi yang bervariasi. Tantangan lain dalam analisis LC-MS-MS
buprenorfin, setidaknya dalam beberapa jenis instrumen, adalah sifat
fragmentasi yang buruk sehingga sulit untuk menemukan transisi
target dan kualifikasi yang tepat (5).
Sebagian besar metode telah dikembangkan dan divalidasi untuk
pemantauan obat terapeutik atau untuk tujuan penegakan hukum
menggunakan sampel darah dan serum antemortem (5, 6, 8, 14, 26). Dalam
diselesaikan pada kolom sekunder, dan dimasukkan ke dalam sumber
ion, meningkatkan sensitivitas keseluruhan untuk analit.
Metode ekstraksi fase padat sederhana (SPE) 2D GC-MS telah
dikembangkan dan divalidasi untuk kuantifikasi buprenorfin
dalam darah postmortem. Sampel darah postmortem otentik dari
kasus HM Coroners telah dianalisis untuk menunjukkan
penerapan metode untuk kasus forensik. Sepengetahuan kami, ini
adalah publikasi pertama dari metode 2D GC-MS yang divalidasi
untuk buprenorfin.
Bahan dan metode
Bahan kimia
Buprenorfin-do4, 100 Mg/mL (dalam metanol), dibeli dari LGC

Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/39/7/519/818763 oleh tamu pada 02 November 2021

kasus Koroner, darah postmortem umumnya merupakan satu-satunya
sampel yang tersedia di mana analisis toksikologi forensik dapat dilakukan.
Untuk menunjukkan kesesuaian metode untuk kasus Koroner, sampel
postmortem harus dianalisis.
Hanya satu metode yang telah diterbitkan, di mana seluruh darah telah
dianalisis, pada instrumentasi GC-MS konvensional yang memperoleh batas
kuantifikasi (LOQ) yang diperlukan untuk analisis buprenorfin (8).
Perkembangan yang lebih baru di GC adalah GC-MS dua dimensi (2D GC-
MS), yang memiliki kemampuan untuk mencapai LOQ yang diperlukan
untuk analisis buprenorfin dalam darah postmortem. 2D GC-MS
menggunakan dua kolom GC dari polaritas yang berbeda untuk
meningkatkan pemisahan analit dari matriks yang tidak diinginkan yang
meningkatkan sensitivitas.
Instrumen ini menggabungkan detektor selektif massa (MSD),
detektor ionisasi nyala (FID), dan sakelar Dean, yang mengontrol
arah aliran gas pembawa dan jebakan pemfokusan krio. Kedua
kolom dihubungkan melalui pelat pemisah mikofluida. Pemisahan
kromatografi awal terjadi di kolom primer dengan aliran gas
pembawa diarahkan ke FID dimana matriks yang tidak diinginkan
dihilangkan. Saklar Deans digunakan untuk mengalihkan aliran
gas untuk secara selektif memotong segmen yang mengandung
analit dari kolom primer ke kolom sekunder yang terhubung ke
MSD. Komponen yang belum diselesaikan di kolom pertama dapat
melakukannya di kolom sekunder. Karena hanya sebagian kecil
yang relevan dari total sampel yang secara kromatografi
Standards (Teddington, UK). Buprenorfin hidroklorida danN-
metil-N-trimetilsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) dibeli dari
Sigma-Aldrich Company Ltd (Poole, UK). Kalium dihidrogen
ortofosfat dibeli dari Fisher Scientific (Loughborough, UK).
Metanol, asetonitril (kelas HPLC), kloroform, propan-2-ol dan
larutan amonia 35% (kelas analitik) semuanya dibeli dari VWR
(Lutterworth, UK). HF Bond Elut-Certify, 3 mL (130 mg), kartrid
SPE diperoleh dari Agilent Technologies (Stockport, UK).
Kondisi instrumentasi dan kromatografi
Kromatografi gas Agilent 6890 dilengkapi dengan sampler cairan
otomatis 7693B, pelat pemisah mikofluida, sakelar Deans, dan FID
yang dihubungkan dengan Agilent 5975C inert XL EI/CI MSD
dengan detektor tiga sumbu. Celah retensi silika yang tidak
dilapisi dan dinonaktifkan terhubung dari sakelar Dekan ke FID.
Gas pembawanya adalah helium. GC dilengkapi dengan
perangkap cryofocusing berpendingin udara (Agilent, UK). Udara
terkompresi dikirim ke perangkap melalui kompresor Jun-Air. Rxi .
dengan polaritas rendahw-5MS (30 m - 0,25 mm ID - 0,25 Mm)
digunakan sebagai kolom primer dan kolom sekunder adalah Rxiw
-17Sil MS (15 m - 0,32 mm ID - 0,25 MM). Parameter GC–MS 2D
tercantum dalam TabelSaya.

Tabel I
Parameter GC-MS Dua Dimensi untuk TMS Derivatif Buprenorfin dan Buprenorfin-d4 Analisis

saluran masuk depan Saluran masuk belakang (perangkap pemfokusan cryo) Suhu (8C) Waktu tunggu (menit)

Modus aliran Tekanan konstan Suhu awal 310 13.40

Modus injeksi Berdenyut splitless Jalan #1 8008C/menit 100 2.55
Volume injeksi 1 ML Jalan #2 8008C/menit 280 0.00
Suhu masuk 2508C
Tekanan 25,43 psi (175,3 Kpa)
Tekanan nadi 45,0 psi (310,3 Kpa)
Waktu pulsa 0,80 menit
Aliran pembersihan 50,0 mL/menit
Waktu pembersihan 1,0 menit
Aliran total 54,9 mL/menit

Jalan oven Suhu (8C) Waktu tunggu (menit) Waktu berjalan (menit) Pergantian dekan dipotong

Suhu oven awal Ramp 150 1.00 1.00

#1: 508C/mnt Jalan #2: 300 0.00 4.00
108C/mnt Jalan #3: 120 310 9.95 14,95 14,50– 15,20 menit
8C/mnt Ramp #4: 508 185 0,50 16.49
C/mnt Ramp #5: 108C/ 280 0.00 18.39
menit 310 5.00 26.39

520 Nahar dkk.

 MSD dioperasikan dalam mode ionisasi dampak elektron/
pemantauan ion selektif (EI/SIM) (70 ev). Untuk turunan
trimetilsilil (TMS) dari buprenorfin, ion yang dipantau adalah:
m/z 450 (ion kuantifikasi), 482 dan 506 (ion kualifikasi). Untuk
buprenorfin-d4-TMS, ion yang dipantau adalah m/z 454 (ion
kuantifikasi), 486 dan 510 (ion kualifikasi).
Pembuatan larutan standar
Larutan stok buprenorfin (50,0 ng/mL) dan buprenorfin-d .
standar internal4 (25,0 ng/mL) disiapkan dalam air deionisasi.
Standar kontrol kualitas (QC) yang mengandung buprenorfin
disiapkan dalam air deionisasi pada tiga konsentrasi berbeda:
2,0 ng/mL (QC rendah), 7,0 ng/mL (QC sedang) dan 30,0 ng/mL
(QC tinggi). Semua solusi yang disiapkan disimpan di2208C.
Persiapan kalibrator dan kontrol kualitas
Sembilan standar kalibrasi, yang terdiri dari blangko, 0,0, 0,5, 1,0,
2,5, 5,0, 10,0, 25,0 dan 50,0 ng/mL buprenorfin, disiapkan dalam
tabung ekstraksi dengan mengencerkan 50,0 ng/mL larutan stok
dalam air deionisasi (total 1 mL ). Setiap standar QC (1 mL) dipipet
ke dalam tabung ekstraksi murni.
Persiapan sampel
Untuk kalibrator dan QC, 1 mL darah manusia bebas obat
kadaluarsa ditambahkan. Kemudian, 0,5 mL larutan standar
internal ditambahkan ke kalibrator dan QC, tidak termasuk blanko.
Untuk blanko, 1 mL darah bebas obat diikuti dengan 0,5 mL air
deionisasi ditambahkan. Campuran sampel diaduk dengan vortex
secara menyeluruh. Untuk mengendapkan protein darah, 125ML
asetonitril ditambahkan ke sampel diikuti dengan pencampuran
vortex. Sampel diistirahatkan selama 5 menit dan kemudian
alikuot kedua 125ML asetonitril ditambahkan. Sampel diaduk
kembali dengan vortex. pH sampel diatur hingga pH 5 dengan
menambahkan 3 mL dapar fosfat 0,1 M (pH 5). Sampel dicampur
pada rotary mixer selama 10 menit dan kemudian disentrifugasi
pada 2500 rpm (1048 -G) selama 10 menit.
Ekstraksi fase padat
Kartrid SPE diaktifkan dengan 2 mL metanol dan dikondisikan
secara berurutan dengan menambahkan 2 mL air deionisasi
diikuti dengan 2 mL buffer fosfat 0,1 M (pH 5). Supernatan
sampel darah diaplikasikan pada kartrid yang dikondisikan
diikuti dengan 3 mL air deionisasi. Setelah air melewati, kartrid
diasamkan dengan 250ML 0,1 M HCl. Pencucian tambahan
kartrid dilakukan dengan 0,5 mL metanol sebelum benar-
benar kering. Analit dielusi menggunakan 3 mL kloroform :
propan-2-ol : amonia (80 : 20 : 2) campuran pelarut; eluen
dikumpulkan ke dalam tabung ekstraksi dan dipekatkan di
bawah nitrogen pada 608C sampai tersisa sekitar 1 mL.
Ekstrak dipindahkan ke dalam mikrovial GC dan diuapkan
hingga kering di bawah nitrogen pada suhu 608C. Sampel
diderivatisasi dengan 20 ML MSTFA dan diinkubasi selama 15
menit pada suhu 608C untuk menghasilkan turunan TMS;
buprenorfin-TMS dan buprenorfin-d4-TMS. Sampel kemudian
disuntikkan (1ML) ke 2D GC–MS.
Validasi metode
Untuk persyaratan validasi, kriteria berikut diperhitungkan:
selektivitas, stabilitas, linearitas, batas deteksi (LOD) dan LOQ
yang lebih rendah, akurasi dan presisi intraday dan interday
dan pemulihan. Standar kalibrasi sembilan tingkat (termasuk
blanko) dan set sampel QC dari tiga konsentrasi (2,0, 7,0 dan
30,0 ng/mL) disiapkan. Hasil dievaluasi sesuai.
Spesifisitas / selektivitas
Untuk mencocokkan matriks kalibrator dengan sampel postmortem,
darah utuh bebas obat manusia yang kadaluwarsa digunakan untuk
menyiapkan semua kalibrator dan QC. Spesifisitas metode ini
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/39/7/519/818763 oleh tamu pada 02 November 2021
dikonfirmasi oleh analisis sampel darah bebas obat yang diekstraksi (n
¼ 10), untuk menunjukkan kurangnya interferensi kromatografi dari
senyawa endogen dengan analit yang diinginkan. Meskipun aplikasi
bergantung pada fragmentasi massa spesifik dalam mode SIM,
beberapa obat dapat mengelusi dan berbagi beberapa ion SIM dari
analit yang diinginkan. Untuk menetapkan bahwa tidak ada
interferensi/ko-elusi yang terjadi dari obat lain yang mungkin ada
dalam sampel, campuran obat tunggal yang mengandung 62 obat
yang paling sering diamati dalam toksikologi postmortem dianalisis
(pada 10Mg/mL) dengan metode. Campuran tersebut termasuk opiat,
amfetamin, kokain, antidepresan, antipsikotik, dan obat bebas.
Stabilitas
Untuk memastikan tidak ada artefak sekunder yang dibuat selama
metode ini, konsentrasi tinggi (1 Mg/mL) standar buprenorfin dan
metabolit utamanya norbuprenorfin diekstraksi dan diturunkan
dengan MSTFA. Norbuprenorfin dianalisis untuk memastikan
setiap norbuprenorfin yang mungkin ada dalam kasus
postmortem positif buprenorfin tidak rusak menjadi buprenorfin
selama analisis. Data massa pemindaian dianalisis pada GC-MS
konvensional (Agilent 6890 GC dihubungkan dengan Agilent
5975B inert XL MSD).
Linearitas, LOD dan LOQ
Reproduksibilitas linearitas kurva penuh diverifikasi dengan
menganalisis dua garis kalibrasi penuh pada tiga hari yang
tidak berurutan (n ¼ 6). Agar garis kalibrasi dapat diterima,
nilai terukur terendah harus berada dalam +20% dari nilai
teoretisnya dibandingkan dengan nilai yang diekstraksi
terhadap kurva kalibrasi yang diperoleh, dan standar kalibrasi
lainnya harus berada dalam +15% ( intra/interday). LOD
ditetapkan sebagai konsentrasi terendah yang dapat dideteksi
dengan adanya tiga ion kualifikasi dalam rasio yang dapat
diterima (+20%) dan rasio signal-to-noise (S : N) .3. LOQ
ditentukan oleh konsentrasi terendah yang dapat dideteksi
secara berulang dalam kesalahan +20%.
Akurasi dan presisi
Untuk analisis intraday, QC rendah, sedang dan tinggi (n ¼ 6)
diekstraksi dengan standar kalibrasi penuh. Untuk analisis antar
hari, tiga ulangan dari setiap QC disiapkan dan diekstraksi
Kuantifikasi Buprenorfin dalam Darah Postmortem 521
dengan standar kalibrasi penuh. Ini diulangi pada 3 hari yang
tidak berurutan (n ¼ 9). Persentase deviasi standar relatif (%
RSD) dari hasil yang diperoleh kemudian dihitung untuk
menentukan ketidaktepatan. Persentase akurasi hasil juga
dihitung.
Efisiensi ekstraksi
Tiga QCs (2.0, 7.0 dan 30,0 ng/mL) disiapkan dalam darah bebas obat
(dua pada setiap konsentrasi) dan kemudian diekstraksi menggunakan
prosedur SPE. Enam sampel darah bebas obat juga diekstraksi
menggunakan prosedur SPE. Untuk semua eluen, standar eksternal,
buprenorfin-d4, telah ditambahkan. Untuk eluen darah bebas obat,
buprenorfin kemudian ditambahkan pada mereka pada 2,0, 7,0 dan
Stabilitas
Tidak ada norbuprenorfin-TMS atau artefak sekunder lainnya yang
diamati saat menganalisis buprenorfin. Tidak ada buprenorfin-
TMS yang diamati ketika norbuprenorfin dianalisis.
Stabilitas buprenorfin dalam matriks biologis telah dipelajari
secara ekstensif; stabilitas yang sangat baik telah diamati untuk
buprenorfin, norbuprenorfin dan konjugat glukuronida mereka
pada berbagai suhu dan masa inkubasi baik dalam darah dan
plasma (5, 6, 8, 14).
Linearitas, LOD dan LOQ
Semua baris (n ¼ 6) linier dari 1,0 hingga 50,0 ng/mL dengan
koefisien korelasi R2 . 0,99. Namun, untuk mendapatkan nilai

Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/39/7/519/818763 oleh tamu pada 02 November 2021

30,0 ng/mL (dua pada setiap konsentrasi). Sampel kemudian
dikeringkan, diderivatisasi dan dianalisis. Persentase perolehan
kembali dihitung dengan membagi rasio area puncak rata-rata dari
sampel QC, yang diperkaya sebelum SPE, dengan rasio area puncak
rata-rata sampel yang ditambahkan buprenorfin setelah SPE dikalikan
100.
Aplikasi metode pada sampel postmortem
Laboratorium melakukan analisis toksikologi rutin pada sampel
postmortem yang dikirim dari kasus HM Coroners. Buprenorfin
dikuantifikasi dalam darah postmortem (femoralis) untuk kasus (n ¼
14) di mana toksisitas buprenorfin diindikasikan dalam riwayat atau
ketika selama prosedur skrining penyalahgunaan obat-obatan rutin,
buprenorfin/metabolit terdeteksi dalam urin (33). Sampel disimpan
pada suhu 58C sampai analisis.
yang paling akurat dan dapat direproduksi pada ujung bawah
kurva kalibrasi, garis kalibrasi rendah dan tinggi diproduksi.
Garis kalibrasi rendah adalah 1,0-10,0 ng/mL dan kalibrasi
tinggi 2,5-50,0 ng/mL. Dapat diterimaR2 nilai .0,99 diperoleh
untuk kurva kalibrasi rendah dan tinggi. % kesalahan yang
dapat diterima(+10%) diperoleh di seluruh rentang kalibrasi.
Hasilnya dirangkum dalam TabelII.
LOD dari metode ini adalah 0,5 ng/mL. Pada konsentrasi ini, S :
N adalah 0,3 dan rasio ion dapat diterima. LOQ adalah 1,0 ng/mL
karena ini adalah konsentrasi terendah yang terdeteksi secara
berulang dalam kesalahan +20% dengan S : N .10.
Akurasi dan ketidaktepatan
Akurasi yang dapat diterima sebesar 95% dan ketidaktepatan (% RSD)
sebesar 5% diperoleh untuk kedua intraday (n ¼ 6) dan analisis antar hari(n
¼ 9). Hasilnya dirangkum dalam TabelAKU AKU AKU.

hasil dan Diskusi Efisiensi ekstraksi

metode
Pengendapan protein sebelum SPE dengan asetonitril mencegah
pengendapan yang terjadi di dalam kartrid dan menghasilkan ekstrak
yang cocok untuk derivatisasi. Penambahan asetonitril dua langkah
meningkatkan ikatan hidrogen antara peptida untuk mengendapkan
protein (34). Untuk pembersihan sampel tambahan, SPE dipilih. Karena
buprenorfin adalah obat dasar (pKA 8.5 dan 10.0), penggunaan kartrid
SPE mode campuran yang mengandung kation kuat
penukar (SO- 3) dan fase padat non-polar (C8) sesuai
makan. Buffer fosfat (pH 5) memberikan pemulihan terbaik dengan
elusi minimum senyawa endogen. Setelah memperbaiki analit ke
kartrid dengan 0,1 M HCl, pencucian metanol saja sudah cukup untuk
menghilangkan lipid dan masih memberikan pemulihan yang baik.
Efisiensi ekstraksi rata-rata dari metode ini adalah 60% pada
ketiga konsentrasi QC.
Aplikasi metode pada sampel postmortem
Tidak ada komplikasi selama ekstraksi atau prosedur analisis
untuk sampel postmortem. Hasil untuk 14 kasus postmortem
yang dianalisis dirangkum dalam TabelIV. Konsentrasi
buprenorfin dalam postmortem
Tabel II
Data Validasi Linearitas Kurva Kalibrasi (n ¼ 6) untuk Buprenorfin

Konsentrasi teoritis (ng/mL) Akurasi (%) Ketidaktepatan (% RSD)

Data diperoleh menggunakan kurva kalibrasi 0 hingga 10 ng/mL

0,5 LOD
Spesifisitas / selektivitas 1.0 101.0 5.3
2.5 93.5 1.8
Tidak ada sinyal yang mengganggu yang diamati dari sampel darah bebas
5.0 91.2 3.2
obat yang dianalisis atau dari 62 obat yang paling umum ditemui dalam 10.0 102.6 3.3
toksikologi postmortem menggunakan metode yang dijelaskan. Data diperoleh menggunakan kurva kalibrasi 2,5 hingga 50 ng/mL
2.5 97.3 4.0
Buprenorfin-d4 standar ditemukan mengandung 5.0 89.2 2.9
buprenorfin berlabel nonisotopik sebagai pengotor, dan oleh 10.0 96.4 3.2
25.0 99.2 2.7
karena itu, sinyal kecil (S : N ,3) diamati pada waktu retensi
50.0 100,5 2.8
buprenorfin dalam standar nol. Pengotor ini dalam jumlah
yang dapat diabaikan (,LOD). LOD, batas deteksi.

522 Nahar dkk.

Tabel III
LC–MS-MS saat ini dibandingkan dengan 2D GC–MS
Intra hari (n ¼ 6) dan Interday (n ¼ 9) Validasi Data Buprenorfin LOD metode yang dijelaskan adalah 0,5 ng/mL, yang sesuai untuk
Buprenorfin QC (ng/mL) Nilai rata-rata (ng/mL) Akurasi (%) Ketidaktepatan (% RSD)
toksikologi Koroner. Untuk mendapatkan lebih banyak sensitivitas
untuk buprenorfin, ada kecenderungan menjauh dari GC ke LC-MS-MS
Data validasi intraday (n ¼ 6)
2.0 2.0 99,6 2.5 untuk mendapatkan konsentrasi subnanogram (6, 14, 31). Meskipun
7.0 6.9 98.1 4.0 LC-MS adalah teknik yang sangat sensitif, selektif dan khusus, dalam
30.0 28.9 96.4 2.6 sampel kompleks seperti darah postmortem, efek matriks dapat
Data validasi antar hari (n ¼ 9)
2.0 2.0 99.8 1.4 diamati. Penekanan ion paling sering diamati, meskipun peningkatan
7.0 6.9 98.3 3.2 juga telah terlihat (5, 31). Hal ini menyebabkan hasil yang dilaporkan
30.0 30.5 101.6 4.4
rendah atau tinggi secara keliru, sehingga mengurangi sensitivitas
QC, standar kontrol kualitas. metode. Karena semua sampel darah postmortem berbeda dan
berada pada keadaan dekomposisi variabel (dalam beberapa kasus
sangat kental dan berminyak), efek matriks ini lebih mungkin menonjol
dan sulit ditentukan. Kesulitan lain yang diamati dalam analisis LC-MS

Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/39/7/519/818763 oleh tamu pada 02 November 2021

adalah fragmentasi buprenorfin yang buruk di bawah ionisasi
Tabel IV
Konsentrasi Buprenorfin dalam Darah Kasus Postmortem
elektrospray, sehingga sulit untuk menemukan transisi target dan
kualifikasi yang tepat yang menyebabkan hilangnya spesifisitas (5, 6).
Konsentrasi obat dalam darah postmortem
Kasus Sejarah
2D GC-MS tidak memiliki masalah dengan efek matriks atau
Buprenorfin Lainnya etanol kemampuan fragmentasi.
(ng/mL) (Mg/mL) (mg%)
Beberapa metode memerlukan 2-3 mL darah kasus untuk mengekstrak
1 Gantung 43.0 Morfin: 0,05 , 10 dan menganalisis pada LC-MS-MS (6, 13). Dalam beberapa kasus
2 Kesehatan mental 16.0 Sertraline: 1,35 , 10
postmortem, volume sampel darah yang terbatas diterima untuk beberapa
masalah, obat-obatan terlarang Procyclidine: terapi
pengguna Klorfeniramin: terapi analisis dan oleh karena itu menggunakan hingga 3 mL darah untuk analisis
3 Kemungkinan overdosis 11.0 Dothiepin: 6.71 159 tunggal tidak layak. Metode yang dijelaskan membutuhkan maksimal 1 mL
Fluoksetin: 0,40
4 Pengguna narkoba 8.3 Kokain: penggunaan 67 darah untuk kuantisasi.
rekreasi Quetiapine: Morfin
5 Pengguna narkoba 7.8 terapeutik: 0,48 142
Kodein: 0,03
6-Acetylmorphine: 0,02 GC–MS konvensional dibandingkan dengan GC–MS 2D
Diaz / Desdiaz: Karbamazepin
6 Kematian mendadak 5.0 terapeutik rendah: Morfin 13 GC-MS konvensional memberikan resolusi tinggi, tetapi meskipun
7 Pengguna narkoba 4.2 terapeutik: 0,87 13 kemampuannya untuk mengurangi latar belakang, ia memiliki kesulitan
Kodein: 0,05
dalam mencoba menyelesaikan analit pada konsentrasi subnanogram,
Kokain: penggunaan
rekreasi Amitriptyline: terapi seperti buprenorfin, hadir dalam matriks kompleks seperti darah
8 Masalah kesehatan mental 4.1 Promethazine: 5.60 114 postmortem dan terutama dalam sampel yang mengandung lipid. 2D GC–
Parasetamol: 284
MS mengatasi masalah resolusi dan sensitivitas ini. Saklar Dekan
Dothiepin: Kokain terapeutik
9 Pengguna narkoba 4.0 tinggi: penggunaan rekreasi 35 memungkinkan hanya 0,7 menit dari total waktu berjalan (26,39 menit)
Lignocaine: positif untuk memasuki kolom sekunder melalui perangkap cryofocusing.
Amitriptyline: Citalopram
terapeutik tinggi: terapi tinggi
Perangkap memiliki efek pemekatan pada analit sebelum pemisahan pada
Olanzapine: Dihydrocodeine kolom sekunder, yang meningkatkan sensitivitas. Sebagai matriks minimum
10 Pengguna narkoba 3.8 terapeutik tinggi: 5,40 , 10 terionisasi secara bersamaan dengan analit, sensitivitas untuk deteksi obat
Morfin: 0,03
Quetiapine: terapeutik sangat ditingkatkan memungkinkan buprenorfin untuk dikuantifikasi dalam
Diaz/Desdiaz: terapeutik konsentrasi ng/mL.
11 Pengguna narkoba, di 3.0 Morfin: 0,02 , 10
Untuk mendemonstrasikan peningkatan sensitivitas GC-MS 2D
Subutexw Diaz/Desdiaz: terapeutik
Kokain: penggunaan dibandingkan dengan GC-MS konvensional, buprenorfin pada 10,0 ng/mL
12 Pengguna narkoba 2.3 rekreasi Morfin: 0,39 127 diekstraksi dari darah, diturunkan dengan MSTFA dan dianalisis pada kedua
Kodein: 0,05
13 Ditemukan runtuh 2.0 Tidak ada , 10 instrumen dalam SIM. Angka2 menunjukkan kromatogram ion yang
14 Kemungkinan obat terlarang 1.8 Kokain: penggunaan rekreasi , 10 diekstraksi dari sampel 10,0 ng/mL buprenorfin-TMS yang dianalisis pada
Paroxetine: terapeutik
menggunakan
kedua instrumen. GC-MS 2D meningkatkan LOD sebanyak 20 kali lipat

Subutexw, tablet sublingual yang mengandung buprenorfin; Diaz, diazepam; Desdiaz,

dibandingkan dengan GC-MS konvensional.
desmetidiazepam.

Kesimpulan
darah berkisar antara 1,8 hingga 43,0 ng/mL, yang tercakup GC-MS 2D menunjukkan peningkatan sensitivitas untuk analisis buprenorfin
dalam rentang kalibrasi. Selain satu kasus, beberapa konsumsi dibandingkan dengan GC-MS tradisional. Sinyal latar belakang berkurang
obat diamati (obat terlarang/obat resep/etanol). Rentang secara signifikan karena penghapusan senyawa yang tidak diinginkan yang
konsentrasi yang diamati sebanding dengan hasil darah memasuki MSD, yang meningkatkan sensitivitas, menyediakan sumber ion
postmortem lain yang dipublikasikan (berkisar dari 0,5 hingga yang lebih bersih, dan mengarah pada persyaratan perawatan yang lebih
68,6 ng/mL) (11, 17, 25, 26, 35). Angka1 menunjukkan contoh rendah.
kromatogram ion terpilih dari buprenorfin-TMS yang diamati Kami melaporkan metode SPE 2D GC-MS yang sederhana, efisien
dalam sampel darah postmortem tipikal dan standar kalibrasi. dan hemat biaya untuk kuantifikasi buprenorfin di postmortem

Kuantifikasi Buprenorfin dalam Darah Postmortem 523

 Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/39/7/519/818763 oleh tamu pada 02 November 2021
Gambar 1. Kromatogram ion terpilih dari ekstrak buprenorfin yang diturunkan dengan MSTFA dalam (a) sampel darah postmortem (16,0 ng/mL), (b) 0,5 ng/mL standar (LOD) dan (c)
standar blanko, yang dianalisis pada 2D GC-MS.

Sepengetahuan kami, ini adalah metode buprenorfin pertama yang

divalidasi pada 2D GC-MS.

Referensi
1. Cowan, A., Lewis, JW, Macfarlane, IR (1977) Sifat agonis dan
antagonis buprenorfin, agen antinosiseptif baru. British Journal of
Pharmacology, 60, 537–545.
2. Ferrant, O., Papin, F., Clin, B., Lacroix, C., Saussereau, E., Remoue, JE
dkk. (2011) Keracunan fatal akibat menghirup buprenorfin dan
konsumsi alkohol. Ilmu Forensik Internasional, 204, e8–e11.
3. Mostafavi, A., Abedi, G., Jamshidi, A., Afzali, D., Talebi, M. (2009)
Pengembangan dan validasi metode HPLC untuk penentuan
buprenorfin hidroklorida, nalokson hidroklorida dan
noroksimorfon dalam tablet perumusan. Talanta, 77, 1415–1419.
4. Ho, RCM, Chen, KY, Broekman, B., Mak, B. (2009) resep Buprenorfin,
penyalahgunaan dan penyediaan layanan: perspektif global.
Kemajuan dalam Perawatan Psikiatri, 15, 354–363.
5. Oechsler, S., Skopp, G. (2010) Buprenorfin dan metabolit utama dalam
spesimen darah dikumpulkan untuk analisis obat dalam tujuan
penegakan hukum. Ilmu Forensik Internasional, 195, 73–77.
6. Selden, T., Roman, M., Druid, H., Kronstrand, R. (2011) LC-MS-MS analisis
buprenorfin dan norbuprenorfin dalam darah lengkap dari pengguna
narkoba yang dicurigai. Ilmu Forensik Internasional, 209, 113–119.
7. Jacob, JJC, Michaud, GM, Tremblay, EC (1979) Campuran opiat
agonis-antagonis dan ketergantungan fisik. Jurnal Farmakologi
Klinis Inggris, 7, 291S–296S.
8. Papoutsis, II, Nikolaou, PD, Athanaselis, SA, Pistos, CM,
Spiliopoulou, CA, Maravelias, CP (2011) Pengembangan dan
validasi metode GC/MS yang sangat sensitif untuk penentuan
buprenorfin dan nor-buprenorfin dalam darah . Jurnal Analisis
Farmasi dan Biomedis, 54, 588–591.
9. Watson, PJQ, McQuay, HJ, Bullingham, RES, Allen, MC, Moore,
Gambar 2. Kromatogram ion terpilih dari buprenorfin (10,0 ng/mL) yang diekstraksi dari darah,
RA (1982) Perbandingan dosis tunggal buprenorfin 0,3 dan 0,6 mg
diturunkan dengan MSTFA dan dianalisis pada (a) GC–MS standar dan (b) 2D GC–MS.
IV diberikan setelah operasi: efek klinis dan konsentrasi plasma.
Jurnal Anestesi Inggris, 54, 37–43.
10. Cobos, JP, Martin, S., Etcheberrigaray, A., Trujols, J., Batlle, F., Tejero,
darah. LOD adalah 0,5 ng/mL, LOQ 1,0 ng/mL dan linearitas A. dkk. (2000) Uji coba terkontrol pemberian buprenorfin harian versus
hingga 50,0 ng/mL. GC-MS 2D kurang dari setengah biaya LC-MS- tiga kali seminggu untuk pengobatan ketergantungan opioid.
MS dan dapat digunakan sebagai metode analisis alternatif. Ketergantungan Narkoba dan Alkohol, 59, 223–233.

524 Nahar dkk.

11. Kintz, P. (2001) Kematian yang melibatkan buprenorfin: ringkasan
kasus Prancis. Ilmu Forensik Internasional, 121, 65–69.
12. Repetto, MR, Repetto, M. (1997) Kebiasaan, racun, dan konsentrasi
mematikan dari 103 obat penyalahgunaan pada manusia. Jurnal
Toksikologi-Toksikologi Klinis, 35, 1–9.
13. Kintz, P. (2002) Serangkaian baru dari 13 kematian terkait
buprenorfin.Biokimia Klinis, 35, 513–516.
14. Rodriguez-Rosas, ME, Lofwall, MR, Strain, EC, Siluk, D., Wainer, IW
(2007) Penentuan buprenorfin, norbuprenorfin dan enansiomer
metadon dan metabolitnya secara simultan (EDDP)
dalam plasma manusia dengan kromatografi cair/spektrometri
massa.Jurnal Kromatografi B, 850, 538–543.
15. Kerucut, EJ, Gorodetzky, CW, Yousefnejad, D., Buchwald, WF,
Johnson, RE (1984) Metabolisme dan ekskresi buprenorfin pada
manusia. Metabolisme dan Disposisi Obat, 12,577–581.
16. Michiteru, O. (2007) Farmakologi dasar buprenorfin.Jurnal
Suplemen Nyeri Eropa, 1, 69–73.
17. Megarbane, B., Marie, N., Pirnay, S., Borron, SW, Gueye, PN, Risede,
P.dkk. (2006) Buprenorfin bersifat protektif terhadap efek depresi
dari norbuprenorfin pada ventilasi. Toksikologi dan Farmakologi
Terapan, 212, 256–267.
18. Megarbane, B., Vodovar, D., Baud, FJ (2011) Kematian dalam kaitannya
dengan mendengus buprenorfin dan konsumsi etanol: mekanisme
toksisitas. Ilmu Forensik Internasional, 207, 59–60.
19. Ridge, G., Gossop, M., Lintzeris, N., Witton, J., Strang, J. (2009) Faktor
yang terkait dengan peresepan buprenorfin atau metadon untuk
pengobatan ketergantungan opiat. Jurnal Perawatan Penyalahgunaan
Zat, 37, 95–100.
20. de Wet, CJ, Reed, LJ, Bearn, J. (2005) Munculnya peresepan
buprenorfin di Inggris: analisis data regional NHS, 2001-03.
Kecanduan, 100, 495–499.
21. Alho, H., Sinclair, D., Vuori, E., Holopainen, A. (2007) Kewajiban penyalahgunaan
tablet buprenorfin-nalokson pada pengguna obat IV yang tidak diobati.
Ketergantungan Narkoba dan Alkohol, 88, 75–78.
22. Moratti, E., Kashanpour, H., Lombardelli, T., Maisto, M. (2010)
Penyalahgunaan intravena karakteristik buprenorfin dan tingkat di
antara pasien yang menjalani terapi pemeliharaan obat.
Investigasi Obat Klinis, 30, 3–11.
23. Schuman-Olivier, Z., Albanese, M., Nelson, SE, Roland, L., Puopolo, F., Klinker,
L. dkk. (2010) Pengobatan sendiri: Penggunaan buprenorfin terlarang oleh
pencari pengobatan yang bergantung pada opioid. Jurnal Perawatan
Penyalahgunaan Zat, 39, 41–50.
24. Schifano, F., Corkery, J., Gilvarry, E., Deluca, P., Oyefeso, A., Ghodse,
AH (2005) Mortalitas buprenorfin, kejang dan data resep di Inggris,
1980-2002. Psikofarmakologi Manusia-Klinis dan Eksperimental,
20, 343–348.
25. Lai, SH, Yao, YJ, Lob, DST (2006) Sebuah survei kematian terkait
buprenorfin di Singapura. Ilmu Forensik Internasional, 162,80–86.
26. Mercolini, L., Mandrioli, R., Conti, M., Leonardi, C., Gerra, G., Raggi,
MA (2007) Penentuan simultan metadon, buprenorfin dan
norbuprenorfin dalam cairan biologis untuk tujuan pemantauan
obat terapeutik. Jurnal Kromatografi B-Teknologi Analitik dalam
Ilmu Biomedis dan Kehidupan, 847, 95-102.
27. Liu, SY, Liu, KS, Kuei, CH, Tzeng, JI, Ho, ST, Wang, JJ (2005)
Penentuan buprenorfin dan prodrugnya secara simultan,
buprenorfin propionat, dengan kromatografi cair kinerja tinggi
dengan deteksi fluoresensi: aplikasi untuk studi farmakokinetik
pada kelinci. Jurnal Kromatografi B-Teknologi Analitik dalam Ilmu
Biomedis dan Kehidupan, 818, 233–239.
28. Fuller, DC (2008) Sebuah prosedur spektrometri massa
kromatografi gas sederhana untuk penentuan simultan
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/39/7/519/818763 oleh tamu pada 02 November 2021
buprenorfin dan norbuprenorfin dalam urin manusia. Jurnal
Toksikologi Analitik, 32, 626–630.
29. George, S., George, C., Chauhan, A. (2004) Pengembangan dan
penerapan metode spektrometri massa kromatografi gas cepat
untuk memantau protokol penarikan buprenorfin. Ilmu Forensik
Internasional, 143, 121–125.
30. Liu, AC, Lin, TY, Su, LW, Fuh, MR (2008) Online ekstraksi fase padat
kromatografi cair-elektrospray-tandem analisis spektrometri
massa buprenorfin dan tiga metabolit dalam urin manusia.Talanta,
75, 198–204.
31. Concheiro-Guisan, M., Shakleya, DM, Huestis, MA (2009)
Kuantifikasi simultan buprenorfin, norbuprenorfin, buprenorfin
glukuronida, dan norbuprenorfin glukuronida dalam plasenta
manusia dengan spektrometri massa kromatografi cair.Kimia
Analitik dan Bioanalitik, 394, 513–522.
32. Pirnay, S., Herve, F., Bouchonnet, S., Perrin, B., Baud, FJ, Ricordel, I.
(2006) Liquid chromatographic-electrospray ionization mass
spectrometric analysis of buprenorphine, norbuprenorphine,
nordiazepam and oxazepam dalam plasma tikus. Jurnal Analisis
Farmasi dan Biomedis, 41, 1135-1145.
33. Paterson, S., Cordero, R., McCulloch, S., Houldsworth, P. (2000) Analisis
urin untuk penyalahgunaan obat menggunakan ekstraksi fase padat
mode campuran dan spektrometri massa kromatografi gas. Biokimia
Klinis Annals, 37, 690–700.
34. Gekko, V., Ohmae, E., Kameyama, K., Takagi, T. (1998) Interaksi
asetonitril-protein: kelarutan asam amino dan solvasi preferensial.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)–Struktur Protein dan
Enzimologi Molekuler, 1387, 195-205.
35. Tracqui, A., Kintz, P., Ludes, B. (1998) Buprenorfin kematian terkait
antara pecandu narkoba di Perancis: laporan 20 kematian. Jurnal
Toksikologi Analitik, 22, 430–434.
Kuantifikasi Buprenorfin dalam Darah Postmortem 525