File

IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DAUN SIRSAK
(Annona muricata L.) PENGHASIL ANTIBAKTERI

MENGGUNAKAN TEKNIK PCR
Skripsi
Untuk melengkapi syarat-syarat guna memperoleh gelar
Sarjana Farmasi
Disusun Oleh:
Lulu Sofaya
1204015239
PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA
JAKARTA
2016
ii
Identifikasi Bakteri Endofit...Lulu Sofaya,Farmasi UHAMKA,2016.
ABSTRAK
IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DAUN SIRSAK

(Annona muricata L.) PENGHASIL ANTIBAKTERI
MENGGUNAKAN TEKNIK PCR
Lulu Sofaya
1204015239
Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman tanpa
menyebabkan gejala-gejala penyakit. Bakteri endofit dapat memproduksi senyawa
antibakteri, keberadaannya pada daun sirsak (Annona muricata L.)
memungkinakannya memproduksi senyawa bioaktif seperti yang terkandung oleh
tumbuhan inangnya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi secara molekuler bakteri endofit dari daun sirsak penghasil
metabolit sekunder dengan teknik PCR. Hasil isolasi bakteri endofit didapat tiga
isolat, selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan bakteri uji Bacillus
subtilis dan Salmonella typhi. Isolat dengan aktivitas terbesar dilanjutkan dengan
isolasi DNA genom dan diamplifikasi dengan teknik PCR menggunakan primer
27f dan primer 1492r. Hasil amplifikasi kemudian disekuensing dengan gen 16S
rRNA. Bakteri endofit BW-1LM memiliki aktivitas antibakteri dan berhasil
diidentifikasi secara molekuler memiliki tingkat kemiripan 99% dengan Bacillus
licheniformis strain DSM 13.
Kata kunci: bakteri endofit, daun sirsak, pcr, sekuensing dna.
iii
KATA PENGANTAR
Bismillahirrahmanirrohim,
Alhamdulillahirabbil’alamiin, penulis memanjatkan rasa syukur yang tak
terhingga kepada Allah Ta’ala, atas limpahan rahmat dan rahim-Nya penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi, dengan judul “IDENTIFIKASI
BAKTERI ENDOFIT DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) PENGHASIL
ANTIBAKTERI MENGGUNAKAN TEKNIK PCR”.
Penulisan skripsi ini dimaksudkan untuk memenuhi tugas akhir sebagai
salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program
Studi Farmasi FFS UHAMKA, Jakarta.
Dalam Kesempatan ini penulis menyampaikan rasa hormat dan terima
kasih kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan kepada
penulis selama proses pengerjaan skripsi ini berlangsung, terutama kepada:
1. Bapak Dr. Hadi Sunaryo, M.Si., Apt., selaku Dekan FFS UHAMKA, Jakarta.
2. Ibu Kori Yati, M.Farm., Apt., selaku Ketua Program Studi FFS UHAMKA,
Jakarta.
3. Ibu Dra. Fatimah Nisma M.Si., selaku Pembimbing Akademik.
4. Ibu Fitri Yuniarti, M.Si., selaku Pembimbing I yang telah membimbing dan
memberi masukan serta arahan yang bermanfaat mengenai materi bagi
penulis.
5. Ibu Wahyu Hidayati, M.Biomed., selaku pembimbing II yang telah
memberikan masukan dan arahan yang bermanfaat mengenai penulisan
maupun pelaksanaan penelitian bagi penulis.
6. Orang tua tersayang Ibu, Ayah, tante, om, serta kakak, adik, dan sepupuku
terima kasih atas do’a dan dorongan semangatnya kepada penulis, baik moril
maupun materi.
7. Teman-teman seperjuangan Sigit Priyo Utomo, Lutfika Munaziah, Sheila,
Denun, Silvi, Arin, Umi fitri, Cici, Tican, dan Kasilvi yang telah menjadi
sahabat dan mendukung penulis selama ini.
8. Anisa indah yang telah memberikan semangat dan mendukung penulis.
9. Ka Lilis Lisnawati, yang telah menyumbangkan ilmunya kepada penulis,
serta dorongan semangat selama ini.
10. Teman-teman angkatan 2012 yang telah berjuang bersama-sama melewati
kuliah di FFS UHAMKA, semoga ukhuwah kita tetap terjalin.
Penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini masih memiliki banyak
kekurangan karena keterbatasan ilmu dan kemampuan penulis. Untuk itu saran
dan kritik dari pembaca sangat penulis harapkan. Penulis berharap skripsi ini
dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukan. Aamiin.
Jakarta, November 2016
Penulis
iv
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL i
HALAMAN PENGESAHAN ii
ABSTRAK iii
KATA PENGANTAR iv
DAFTAR ISI v
DAFTAR TABEL vii
DAFTAR GAMBAR viii
DAFTAR LAMPIRAN ix
BAB I PENDAHULUAN 1
A. Latar Belakang 1
B. Permasalahan Penelitian 3
C. Tujuan Penelitian 3
D. Manfaat Penelitian 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4
A. Tanaman Sirsak 4
B. Bakteri Endofit dan Isolasi Bakteri Endofit 5
C. Antibiotik dan Uji Antibakteri 6
D. Gen 16S rRNA 8
E. Isolasi DNA 9
F. Polymerase Chain Reaction (PCR) 10
G. Elektroforesis 12
H. Sekuensing DNA dan Identifikasi Molekuler 13
BAB III METODOLOGI PENELITIAN 15
A. Tempat dan Waktu Penelitian 15
1. Tempat Penelitian 15
2. Waktu Penelitian 15
B. Alat Penelitian 15
C. Bahan Penelitian 15
1. Bahan Isolasi Bakteri Endofit 15
2. Bahan Isolasi DNA Genom 15
3. Bahan PCR 15
4. Bahan Elektroforesis 16
5. Bahan Kultur Bakteri 16
D. Prosedur Penelitian 16
1. Tahap Persiapan 16
2. Isolasi Bakteri Endofit Daun Sirsak 16
3. Karakterisasi Morfologi Koloni Isolat Bakteri 17
Endofit Daun Sirsak
4. Fermentasi Bakteri Endofit dengan Medium 17
Fermentasi Nutrient Broth
5. Pengujian Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit 18
secara Kualitatif
6. Isolasi DNA Genom dengan Wizard Kitt 18
7. Analisis DNA Genom dengan Elektroforesis 19
8. Amplifikasi DNA dengan PCR 20
9. Analisis Amplikon dengan Elektoforesis 20
v
10. Sekuensing Gen 16S rRNA 21
11. Alignment Hasil Sekuens dengan Menggunakan 21
Program Bioedit
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 22
A. Determinasi 22
B. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit 22
C. Pengujian Aktivitas Antibakteri secara Kualitatif 23
D. Isolasi DNA Genom 25
E. Analisis DNA dengan Elektroforesis 26
F. Amplifikasi DNA dengan PCR 27
G. Analisis Hasil Sekuensing Gen 16S rRNA 29
BAB V SIMPULAN DAN SARAN 31
A. Simpulan 31
B. Saran 31
DAFTAR PUSTAKA 32
LAMPIRAN 35
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1 Hasil Pengamatan Karakteristik Isolat Bakteri 23
Endofit dari Daun Sirsak (Annona muricata L.)
Tabel 2 Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat 25
Metabolit Sekunder Bakteri Endofit dari Daun
Sirsak terhadap Bakteri Uji Bacillus subtilis dan
Salmonella typhi
vii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Tanaman sirsak 4
Gambar 2. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Sekunder 24
Bakteri Endofit dari Daun Sirsak (Annona muricata
L.) terhadap Bakteri Uji Bacillus subtilis
Gambar 3. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Sekunder 24
Bakteri Endofit dari Daun Sirsak (Annona muricata
L.) terhadap Bakteri Uji Salmonella typhi
Gambar 4. Fragmen DNA Genom Isolat Bakteri Endofit BW- 27
1LM dari Daun Sirsak
Gambar 5. Hasil Elektroforesis Amplikon DNA Isolat Bakteri 28
Endofit BW1-LM dari Daun Sirsak
Gambar 6. Deskripsi Hasil nucleotide BLAST Gen 16S rRNA 30
Isolat Bakteri Endofit dari Daun Sirsak
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil Determinasi Daun Sirsak 35
Lampiran 2. Skema Kerja Isolasi Bakteri Endofit dari Daun Sirsak 36
Lampiran 3. Skema Kerja Karakterisasi Koloni Bakteri Endofit 37
Lampiran 4. Skema Kerja Proses Fermentasi Bakteri Endofit 38
Lampiran 5. Skema Kerja Peremajaan dan Pembuatan Kultur Uji 39
Bakteri Bacillus subtilis dan Salmonella typhi
Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktifitas Bakteri Endofit secara 40
Kualitatif terhadap Bakteri Uji B. subtilis dan S. typhi
Lampiran 7. Skema Kerja Peremajaan Isolat Bakteri Endofit BW- 41
1LM
Lampiran 8. Skema Kerja Identifikasi Molekuler Bakteri Endofit 42
Lampiran 9. Skema Kerja Isolasi DNA Bakteri Endofit BW-1LM 43
dari Daun Sirsak dengan Wizard Kit
Lampiran 10. Skema Kerja Analisa DNA Genom Isolat Bakteri 45
Endofit dari Daun Sirsak dengan Elektroforesis
Lampiran 11. Skema Kerja Analisa DNA Genom Isolat Bakteri 46
Endofit dari Daun Sirsak Menggunakan PCR
Lampiran 12. Perhitungan Pembuatan Bahan Isolasi Bakteri 47
Endofit dan Fermentasi
Lampiran 13. Perhitungan Pembuatan Bahan Identifikasi 48
Molekuler
Lampiran 14. Perhitungan Pembuatan Primer 27f dan Primer 1492r 50
Lampiran 15. Hasil Isolasi Bakteri Endofit Daun Sirsak 51
Lampiran 16. Hasil Karakterissasi Makroskopik Bakteri Endofit 52
Lampiran 17. Hasil Karakterissasi Mikroskopik Bakteri Endofit 53
Lempiran 18. Hasil Fermentasi Bakteri Endofit 54
Lampiran 19. Isolat Bakteri Endofit BW-1LM 55
Lampiran 20. Hasil Isolasi DNA dan Hasil Amplifikasi DNA BW- 56
1LM
Lampiran 21. Hasil Sekuensing dalam Bentuk Eektroforegram 57
Lampiran 22. Hasil Konsensus Primer 27f dan Primer 1492r dari 58
Sampel Isolat Bakteri Endofit BW-1LM Daun Sirsak
Lampiran 23. Hasil nucleotide BLAST Gen 16S rRNA Isolat 59
Bakteri Endofit dari Daun Sirsak
Lampiran 24. Alat- alat yang Digunakan Selama Penelitian 60
Lampiran 25. Bahan- bahan yang Digunakan Selama Penelitian 62
ix
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya alam, salah
satunya adalah tumbuhan obat yang dimiliki. Beragam jenis tumbuhan yang ada
merupakan sumber daya yang sangat penting dalam upaya pengobatan dan upaya
mempertahankan kesehatan masyarakat. Berbagai jenis tumbuhan diketahui
mengandung senyawa-senyawa bioaktif yang potensial untuk dikembangkan.
Tumbuhan tersebut menghasilkan metabolit sekunder dengan struktur molekul
dan aktivitas biologi yang beraneka ragam, memiliki potensi yang baik untuk
dikembangkan menjadi obat berbagai penyakit (Radji 2005). Metabolit sekunder
yang dihasilkan diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetic dari
tanaman inang ke dalam mikroba endofit (Tan dan Zou 2001).
Mikroba endofit adalah mikroorganisme yang mempunyai habitat hidup di
dalam organ tanaman dalam kurun waktu tertentu, dapat berkolonisasi di dalam
jaringan tanaman tanpa merugikan tanaman inangnya. Mikroba endofit termasuk
bakteri, kapang dan khamir dapat ditemukan pada semua jenis tanaman. Mikroba
endofit dapat menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas,
seperti enzim, zat antimikroba, anti fungi, antikanker, dan zat pengatur tumbuh
tanaman (Kumala 2014). Kemampuan bakteri endofit menghasilkan senyawa aktif
tersebut merupakan potensi yang dapat dikembangkan mengingat umumnya
senyawa aktif diperoleh dengan mengekstraksi tanaman, khususnya tanaman obat.
Senyawa aktif dari tanaman dapat diperoleh dengan membutuhkan waktu dan
proses yang lebih rumit dibandingkan dengan mengekstraksi senyawa dari bakteri.
Salah satu tanaman obat yang dapat dijadikan sumber bakteri endofit adalah daun
sirsak (Annona muricata L.).
Sirsak merupakan tanaman yang memiliki khasiat medis dan banyak
digunakan di Indonesia. Bagian tanaman sirsak yang banyak digunakan adalah
daunnya. Daun sirsak memiliki kandungan senyawa saponin, flavonoid, kumarin,
alkaloid, dan tanin. Haro et al. (2014) melaporkan ekstrak metanol daun sirsak
dapat menghambat bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Ekstrak
daun sirsak yang memiliki khasiat sebagai antibakteri ini, memacu untuk adanya
1
penelitian tentang bakteri endofit yang ada pada daun sirsak. Isolasi bakteri
merupakan langkah awal untuk mengetahui bakteri endofit yang terdapat pada
daun sirsak penghasil metabolit antibakteri melalui identifikasi molekuler dengan
teknik PCR.
Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain
Reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro (Fatchiyah dkk. 2011). Panjang target
DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit
sepasang primer (Muladno 2010). Proses PCR merupakan proses siklus yang
berulang, meliputi denaturasi, annealing, dan ekstensi oleh enzim DNA
polimerase. Setelah proses amplifikasi dilanjutkan dengan analisis dengan
elektroforesis dan identifikasi menggunakan gen penanda 16S rRNA. Gen 16S
merupakan gen yang spesifik terhadap spesies prokariot (Clarridge 2004).
Sekuensing DNA adalah suatu proses penentuan urutan basa suatu DNA, proses
ini menggunakan prinsip reaksi polimerisasi DNA secara enzimatis dengan
penambahan suatu ddNTP yang dilakukan dengan mesin DNA sequencer (Radji
2011).
Penelitian sebelumnya tentang identifikasi molekuler bakteri endofit dengan
teknik PCR telah banyak dilakukan antara lain Bintang et al. (2014) melaporkan
bahwa isolat bakteri endofit BS1 dari tanaman sirih mempunyai tingkat kemiripan
98% dengan Pseudomonas sp. Resti dkk. (2013) melaporkan hasil penelitian
bakteri endofit dari tanaman bawang merah didapat 82 isolat bakteri endofit, dan
enam isolat di antaranya memiliki kemampuan yang potensial terhadap penyakit
hawar daun bakteri. Hasil identifikasi molekular dengan 16S rRNA enam isolat
tersebut memiliki kemiripan dengan Bacillus cereus P14, Bacillus cereus Se07,
Bacillus sp H1, Bacillus sp SJ1, dan Serratia marcescens PPM4. Hidayatun dkk.
(2011) melaporkan bahwa 26 isolat bakteri endofit dan filosfer yang diisolasi dari
empat varietas padi berhasil teridentifikasi dengan metode sekuensing
menggunakan 16S rRNA memiliki kemiripan terhadap kelompok bakteri
Staphylococcus dan Serratia sebanyak 5 isolat, Bacillus sebanyak 4 isolat,
Microbacteria sebanyak 2 isolat, Pseudomonas sebanyak 3 isolat, Enterobacter
2
sebanyak 2 isolat, Klebsiella, Acidovorak, Bulkholderiaceae, dan Agrobacterium
masing masing sebanyak 1 isolat.
Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi secara molekuler bakteri
endofit daun sirsak (Annona muricata L.) penghasil metabolit sekunder
antibakteri. Metabolit sekunder yang dihasilkan bakteri endofit daun sirsak
kemudian dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram. Isolat
yang memiliki aktivitas terbesar dilanjutkan dengan melakukan isolasi DNA
genom untuk mendapatkan DNA murni yang akan diamplifikasi dengan teknik
PCR. Hasil amplifikasi DNA selanjutnya dilakukan analisis dengan elektroforesis
dan sekuensing terhadap gen 16S rRNA. Hasil sekuen yang didapat kemudian
dilakukan alignment dengan data sekuen yang tersimpan di GeneBank
menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
Perbandingan ini dilakukan dengan tujuan untuk melihat tingkat homologi atau
kemiripan informasi genetik bakteri endofit dengan informasi gen yang tersedia.
B. Permasalahan Penelitian
Apakah bakteri endofit daun sirsak (Annona muricata L.) penghasil
metabolit antibakteri dapat diidentifikasi secara molekuler dengan teknik PCR?
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi secara molekuler bakteri
endofit daun sirsak (Annona muricata L.) penghasil metabolit antibakteri dengan
teknik PCR.
D. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat ditindak lanjuti dengan upaya
pengembangan kualitas bakteri endofit pada daun sirsak penghasil metabolit
antibakteri melalui teknik rekayasa genetik untuk meningkatkan kemampuan
produksi senyawa bahan aktif.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Tanaman Sirsak (Annona muricata L.)
Gambar 1. Tanaman Sirsak (Annona muricata L.) Sumber: Pribadi

1. Klasifikasi Tanaman Sirsak
Divisi : Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Bangsa : Ranunculales
Suku : Annonaceae
Marga : Annona
Spesies : Annona muricata L. (Depkes RI 2001).
2. Deskripsi Tanaman
Sirsak merupakan tanaman dengan tinggi pohon sekitar 8 meter. Batang
coklat berkayu, bulat, bercabang. Mempunyai daun berbentuk telur atau lanset,
ujung runcing, tepi rata, pangkal meruncing, pertulangannya menyirip, panjang
tangkai 5 mm, hijau kekuningan. Bunga terletak pada batang atau ranting, daun
kelopak kecil, kuning keputih-putihan, benang sari banyak berambut. Buahnya
bukanlah buah sejati, yang dinamakan “buah” sebenarnya adalah kumpulan buah-
buah (buah agregat) dengan biji tunggal yang saling berimpitan dan kehilangan
batas antar buah. Daging buah sirsak berwarna putih dan berbiji hitam. Akar
berwarna coklat muda, bulat dengan perakaran tunggang (Depkes RI 2001).
4
3. Kandungan daun sirsak
Daun sirsak memiliki kandungan senyawa alkaloid, flavonoid, tannin,
kuinon, steroid, monoterpen/ seskuiterpen, dan polifenolat (Mulyanti dkk. 2015).
4. Kegunaan daun sirsak
Secara tradisional daun sirsak dimanfaatkan untuk mengobati bisul, obat
kejang, dan peluruh keringat (Depkes RI 2001). Antiinflamasi (Meisyayati dan
Dewiwaty 2015), antikanker (Muhartono dkk. 2014), antidiabetes (Firmansyah
dkk. 2016), antikolesterol (Firmansyah dkk. 2016), antibakteri (Haro et al. 2014),
antikonsulvan (Rohadi dkk. 2015), antihiperurisemia (Artini dkk. 2012), dan
antioksidan (Putri 2012).
B. Bakteri Endofit dan Isolasi Bakteri Endofit
Bakteri endofit adalah mikroorganisme yang sebagian atau seluruh dari
siklus hidupnya tinggal dalam jaringan tanaman tanpa menyebabkan gejala
penyakit. Bakteri endofit ini dapat berasosiasi dengan tanaman, membantu
metabolisme tanaman inang dan menghasilkan metabolit sekunder yang mirip
dengan senyawa tanaman inangnya (Kumala 2014). Mereka berada pada jaringan
yang sehat seperti biji, akar, batang, dan daun. Tanaman mendapatkan manfaat
dengan kehadiran bakteri endofit ini seperti memacu pertumbuhan tanaman, dan
meningkatkan resistensi pada tanaman dari berbagai macam patogen dengan
memproduksi antibiotik, sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu
tanaman obat dapat menghasilkan alkaloid atau metabolit sekunder sama dengan
tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak
perlu menebang tanaman aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang
kemungkinan besar memerlukan puluhan tahun untuk dapat dipanen (Radji 2005).
Senyawa bioaktif bakteri endofit dapat dimanfaatkan sebagai antibakteri,
antifungi, antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria, dan antiimunosupresif
(Strobel dan Daisy 2003).
Isolasi bakteri endofit dari tanaman dapat dilakukan dengan cara
menginokulasi sampel tanaman yang telah steril, kemudian ditanamkan ke dalam
suatu medium. Sampel tanaman berupa daun sirsak segar dicuci di bawah air
mengalir untuk menghilangkan tanah dan kotoran yang menempel pada bagian
daun dan dilanjutkan dengan teknik sterilisasi permukaan. Sterilisasi permukaan
5
jaringan tanaman bertujuan untuk membunuh mikroba pencemar yang menempel
pada permukaan jaringan tanaman. Sterilisasi permukaan jaringan tanaman
dilakukan dengan menggunakan larutan etanol 75% dengan cara merendamnya.
Sampel direndam dengan etanol 75%, natrium hipoklorit (NaOCl) 5,3% dan
dibilas kembali dengan etanol 75%. Sampel yang telah disterilkan dikeringkan di
atas kertas saring, dan dipotong dengan menggunakan scalpel steril (Kumala
2014).
Etanol efektif membunuh bakteri dan fungi namun tidak dapat membunuh
endospora dan virus non-enveloped. Mekanisme aksi etanol adalah dengan
mendenaturasi protein mikroorganisme dan melarutkan lipid dari membran
mikroorganisme termasuk lipid pada virus bersampul (enveloped virus).
Kemampuan etanol untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan mempunyai
spektrum yang sangat terbatas, sehingga perlu dikombinasikan dengan bahan
kimia lain seperti larutan natrium hipoklorit (NaOCl) 5,3%. Natrium hipoklorit
akan mengoksidasi protein, sehingga membran sel rusak dah terjadi inaktivasi
enzim mikroorganisme (Pratiwi 2008).
C. Antibiotik dan Uji Antibakteri
Antibiotik adalah substansi yang berasal dari mikroorganisme dan dalam
kosentrasi kecil mampu menghambat dan atau membunuh pertumbuhan
mikroorganisme lain. Berdasarkan spektrum atau kisaran kerjanya antibiotik dapat
dibedakan menjadi antibiotik spektrum luas dan antibiotik spektrum sempit.
Berdasarkan mekanisme aksinya, antibiotik dibedakan menjadi lima, yaitu
antibiotik dengan mekanisme penghambatan sintesis dinding sel, perusakan
membran plasma, penghambatan sintesis protein, penghambatan sintesis asam
nukleat dan penghambatan sintesis metabolit esensial (Pratiwi 2008). Sumber
antibiotik ada dua, yaitu antibiotik alami yang dihasilkan oleh mikroorganisme
berupa metabolit sekunder dan antibiotik sintetis yang dibuat berdasarkan struktur
kimia yang sama dengan antibiotik alami. Metabolit sekunder adalah produk
metabolik yang dihasilkan oleh proses metabolisme sekunder mikroorganisme,
diproduksi selama fase stasioner, dibuat dan disimpan secara ekstraseluler, dan
biasanya berhubungan dengan aktivitas antimikroba (Pratiwi 2008). Bakteri
endofit penghasil metabolit sekunder perlu dilakukan uji aktivitas antibakteri,
6
beberapa metode yang umum digunakan di antaranya seperti yang dijelaskan
berikut ini.
Menurut Pratiwi (2008) beberapa metode yang umum digunakan untuk
menguji daya antibakteri di antaranya:
a. Metode difusi
1) Metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer)
Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang
telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut.
Area jernih mengidikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh
agen antimikroba pada permukaan media agar.
2) E-test
Metode E-test digunakan untuk mengestimasi kadar hambat minimum
(KHM), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat
menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip
plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga kadar
teringgi dan diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme.
Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan
kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorgaisme pada
media agar.
3) Ditch-plate technique
Metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit
yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan Petri pada bagian
tengah secara membujur dan mikroba uji digoreskan kearah parit yang berisi agen
antimikroba.
4) Cup-plate technique
Metode ini dibuat dengan membuat sumur pada media agar yang telah
ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen
antimikroba yang akan diuji.
5) Gradient-plate technique
Metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoritis
bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan media uji
7
ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan Petri dan diletakkan
pada posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dituang di atasnya.
Plate diinkubasi 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi
dan permukaan media mengering. Mikroba uji digoreskan pada arah mulai dari
konsentrasi tertinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total
pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin dibandingkan dengan
panjang pertumbuhan hasil goresan.
b. Metode Dilusi
1) Metode dilusi cair
Metode ini mengukur kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh
minimum (KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran
agen antimikroba pada medium cair yang ditambahakan dengan mikroba uji.
Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya
pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan
sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa
penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24
jam. Media cair yang terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagi KBM.
2) Metode dilusi padat
Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun metode ini
menggunakan media padat. Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen
antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji bebrapa mikroba uji.
D. Gen 16S rRNA
Konsep gen adalah satuan biologis yang membawa sifat keturunan.
Menurut Fatchiyah dkk. (2011), gen terletak secara spesifik dalam lokus-lokus
kromosom dan mempunyai tiga sifat dasar yaitu (1) gen mempunyai fungsi
spesifik dalam sel dan organisme seutuhnya, (2) mampu menggandakan dirinya
secara tepat, sehingga spesifitas fungsinya selalu dipertahankan dari satu generasi
ke generasi selanjutnya, (3) dan dalam keadaan normal gen merupakan molekul
yang stabil, gen dapat bersifat sensitif atau rentan, sehingga dapat menimbulkan
mutasi pada urutan basa nukleotidanya ketika menghadapi perubahan lingkungan.
Asam ribonukleat (RNA) adalah suatu molekul biologi penting yang terdiri
dari untai tunggal panjang nukleotida. Ribosomal RNA merupakan suatu RNA
8
non-coding yang terlibat dalam proses translasi messenger RNA menjadi protein
dan bertindak sebagai komponen katalis pada ribosom (Bushell dan Burns 2012).
RNA bekerja membawa informasi genetik dari DNA menjadi protein di dalam
ribosom, dan ribosomal RNA (rRNA) merupakan komponen utama penyusun
berat ribosom, yaitu 65%. Molekul rRNA merupakan tempat berlangsungnya
sintesis protein (Fatchiyah dkk. 2011).
Pada organisme prokariot terdapat tiga jenis rRNA dengan koefisien
sedimentasi 5S, 16S, dan 23S. Gen 16S rRNA membentuk kompleks dengan
protein dan membentuk subunit ribosomal 30S, sedangkan rRNA 23S dan 5S
membentuk kompleks dengan protein dan membentuk subunit ribosomal 50S.
Subunit ribosomal 30S dan 50S bersatu membentuk ribosom 70S. Analisis sekuen
yang umum digunakan untuk bakteri adalah sekuen dengan gen 16S rRNA. Gen
16S rRNA merupakan gen yang bersifat spesifik terhadap spesies prokariot
(Clarridge 2004). Daerah gen 16S rRNA merupakan subunit dari ribosom
prokariot 30S yang memiliki 1542 komponen nukleotida. Daerah gen 16S rRNA
biasanya digunakan untuk identifikasi bakteri dan studi filogenetik (Kumala
2014).
E. Isolasi DNA
DNA merupakan molekul penyusun kromosom yang tersusun atas
basa-basa nukleotida, gugus fosfat, dan gula pentosa. Molekul DNA membawa
informasi hereditas dari sel. Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai
teknologi analisis DNA. Teknik ini merupakan hal yang penting karena dalam
melakukan identifikasi yang dibutuhkan sebuah DNA yang murni, komponen lain
dari bakteri harus dihilangkan karena dapat menjadi pengganggu dalam analisa
molekuler (Fatchiyah dkk. 2011). Molekul DNA yang sering digunakan dalam
identifikasi molekular adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel
bakteri (Radji 2011). Isolasi DNA genom dari sel bakteri, terdiri dari beberapa
tahap yaitu kultivasi sel dalam media yang sesuai, pemecahan dinding sel,
ekstraksi DNA genom, dan purifikasi DNA (Radji 2011).
Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan dengan cara kimia yaitu dengan
menggunakan enzim lisozim, etilendiamin tetra asetat (EDTA) atau kombinasi
dari keduanya. Proses pengeluaran DNA dari sel, dilakukan dengan cara
9
diekstraksi atau dilisiskan dengan penambahan dapar ekstraksi atau dapar lisis
untuk mencegah kerusakan pada DNA. Proses selanjutnya adalah pemisahan
DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan, DNA
perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Pemisahan
DNA dari komponen sel yang lain termasuk debris sel, dilakukan dengan cara
sentrifugasi (Fatchiyah dkk. 2011).
Langkah terakhir dalam isolasi DNA adalah menentukan kualitas DNA
yang telah diisolasi. Untuk menentukan kemurnian DNA dapat dilakukan
pengujian kuantitatif menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan juga secara
kualitatif menggunakan elektroforesis gel agarosa. Isolasi DNA merupakan tahap
pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan baik pada
kromosom inti maupun pada organel, yaitu pada mitokondria dan kloroplas.
Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk
memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan
DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Pada saat melakukannya, DNA harus
dijaga agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang
(Fatchiyah dkk. 2011).
F. Polymerase Chain ieaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis
enzimatik untuk mengamplifikasi fragmen DNA secara in vitro (Radji 2011).
Teknologi PCR pertama kali ditemukan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Saat
ini, teknologi PCR banyak digunakan dalam bidang sains dan teknologi
khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik, dan evolusi
molekular (Handoyo dan Rudiretna 2001). Proses PCR merupakan proses siklus
yang berulang, meliputi denaturasi, annealing, dan ekstensi oleh enzim DNA
polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk
membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan
mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35
siklus, meliputi:
1. Tahap denaturasi untai ganda
Denaturasi untai ganda merupakan langkah yang kritis selama proses PCR,
sehingga rantai DNA yang berantai ganda akan terpisah menjadi rantai tunggal.
10
Suhu yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA.
Suhu pada tahap denaturasi adalah pada kisaran 92-95oC, selama 30 detik
2. Tahap primer annealing
Primer annealing merupakan pengenalan (annealing) suatu primer terhadap
DNA target tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan G-C, dan
konsentrasi primer itu sendiri. Amplifikasi akan lebih efisien apabila suhu
annealing tidak kurang dari 37oC agar tidak terjadi mispriming. Oleh karena itu,
pada suhu sekitar 55oC akan dihasilkan amplifikasi produk yang mempunyai
spesifitas yang tinggi. Primer akan menempel pada urutan nukleotida yang sesuai
dengan urutan primer itu sendiri, dan menempel pada posisi ujung-5’ dari untai
DNA target yang telah terurai pada proses sebelumnya. Waktu yang diperlukan
pada proses annealing, yaitu selama 30 detik (Fatchiyah dkk. 2011).
3. Tahap ekstensi pita DNA dengan DNA polimerase
Pada tahap ekstensi terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai
dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target
yang akan bergerak dari ujung-5’ menuju ujung-3’ dari untai tunggal DNA.
Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai
dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase
(1000 bp) yang akan diamplifikasi, memerlukan waktu satu menit bila kurang dari
500 bp, hanya diperlukan waktu 30 detik dan pada kisaran 500 tetapi kurang dari
1 kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1 kb, akan memerlukan waktu
2 menit di setiap siklusnya. Adapun suhu ekstensi berkisar 70-72oC (Fatchiyah
dkk. 2011).
Kompenen yang diperlukan pada reaksi PCR, yaitu cetakan DNA, primer,
Taq DNA, deoksiribonukeotida (dNTP), alat PCR, dan larutan dapar. Cetakan
DNA adalah fragmen DNA yang akan dilipatkangandakan. Kemurnian DNA
target dapat memengaruhi reaksi amplifikasi dan menghambat kerja enzim DNA
polimerase. Primer disusun dari urutan oligonukleotida sepanjang 15-32 bp pada
ujung-5’ pita DNA cetakan untuk mengawali proses sintesis DNA. Taq DNA
polimerase merupakan enzim yang diisolasi dari Thermus aquaticus yang
melalakukan katalis reaksi sintesis DNA. Deoksiribonukleotida (dNTP) yang
11
terdiri dari dATP, dCTP, dTTP, dan dGTP yang biasa digunakan adalah
konsentrasi 200µM. Konsentrasi tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan
dengan enzim polimerase, sedangkan konsentrasi rendah akan memberikan
ketepatan yang tinggi. PCR merupakan alat yang digunakan untuk proses
amplifikasi. Alat ini dengan cepat meregulasi suhu dan siklus waktu yang
dibutuhkan untuk amplifikasi, dan larutan dapar yang akan bekerja dengan baik
untuk cetakan DNA dan primer, yang terdiri atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl, dan
1,5mM MgCl (Fatchiyah dkk. 2011).
G. Elektroforesis
Untuk melakukan uji kuantitatif dan kualitatif isolat DNA dan RNA , maka
dapat dilakukan pengukuran dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan
elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan
molekul yang menggunakan medan listrik (elektro) sebagai penggerak molekul
pada matriks penyangga berpori (foresis) (Fatchiyah dkk. 2011). Metode ini
sangat umum digunakan untuk memisahkan molekul yang bermuatan. Jika gel
ditempatkan ke dalam tangki elektroforesis yang mengandung larutan dapar dan
tangki tersebut dialiri listrik, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH
netral akan bergerak (migrasi) ke arah positif (Muladno 2010). Kecepatan migrasi
DNA yang bergerak pada medan listrik tergantung pada konsentrasi agarosa,
ukuran dan konformasi molekul DNA, arus listrik dan suhu (Fatchiyah dkk.
2011). Elektroforesis dapat digunakan untuk pemisahan makromolekul seperti
asam nukleat dan protein (Fatchiyah dkk. 2011).
Gel merupakan medium yang tepat digunakan pada proses elektroforesis,
ada dua jenis gel yang biasa digunakan yaitu gel agarosa dan gel poliakrilamid.
Gel agarosa (Agarose Gel Electrophoresis) dengan visualisasi menggunakan
Etidium Bromida (EtBr) dan gel poliakrilamid (Polyacrilamid Gel
Electrophoresis) dengan visualisasi menggunakan silver staining. Gel
poliakrilamid memiliki pori-pori sangat kecil, sehingga sangat efektif untuk
memisahkan fragmen DNA dengan ukuran kecil 5 - 500 bp. Sedangkan DNA
dengan panjang 50 bp hingga beberapa mega basa dapat dipisahkan dengan gel
agarosa (Sambrook dan Russell 2001).
12
Larutan dapar berfungsi untuk menghantarkan arus listrik, terdiri atas
larutan dapar TAE dan TBE. Pewarna EtBr digunakan sebagai alat identifikasi
dan mengukur semikualitatif fragmen DNA yang terpisah dalam gel. Keuntungan
khusus yang diperoleh dengan melakukan elektroforesis gel adalah pita DNA
dapat dideteksi dengan kepekaan tinggi. Pita-pita DNA di dalam gel terwarnai
dengan zat warna EtBr, EtBr ini akan terikat di antara dua untai ganda DNA,
sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar karena pewarna ini
mengandung zat fluoresen (Fatchiyah dkk. 2011).
H. Sekuensing DNA dan Identifikasi Molekuler
Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik
penentuan urutan basa nukleotida pada suatu fragmen DNA. Urutan tersebut
dikenal sebagai sekuens DNA yang merupakan informasi paling mendasar suatu
gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk
pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk
menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara
membandingkan sekuensnya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.
Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan
seperti kedokteran, bioteknologi, dan forensik (Handoyo dan Rudiretna 2001).
Metode yang dapat digunakan untuk menentukan urutan nukleotida suatu
DNA terdiri atas dua metode, yaitu metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger-
Coulson. Metode Maxam-Gilbert didasarkan atas pemotongan basa-basa DNA
secara spesifik dengan menggunakan regensia tertentu, sedangkan metode Sanger-
Coulson didasarkan atas metode enzimatik menggunakan DNA polimerase
(Sambrook dan Russell 2001). Saat ini para ahli sering menggunakan metode
terminasi dideoksi Sanger yang diaplikasikan secara manual maupun secara
otomatis, karena teknik Sanger yang lebih sederhana, sedangkan Maxam
menggunakan reagen pemotong DNA yang sangat toksik (Brown 1991).
Terminasi dideoksi Sanger adalah metode penentuan urutan nukleotida DNA
berdasarkan terminasi basa spesifik pada saat dilakukan sintesis DNA secara in
vitro dengan enzim DNA polimerase (Kumala 2014).
Basa spesifik yang digunakan untuk terminasi adalah dideoksinukleosida
trifosfat (ddNTP), yaitu deoksinukleosida trifosfat (dNTP) yang tidak mempunyai
13
gugus hidroksil pada karbon 3’-nya. Hilangnya gugus hidroksil ini menyebabkan
DNA polimerase gagal membentuk ikatan fosfodiester dengan dNTP atau ddNTP
berikutnya, sehingga terjadi terminasi pada perpanjangan rantai DNA setelah
bergabung dengan ddNTP. Ada tiga tahap utama dalam reaksi sekuensing
dideoksi Sanger, yaitu denaturasi, annealing (penempelan primer ke DNA
cetakan), dan ekstensi atau pemanjangan rantai. Sekuensing DNA mirip dengan
PCR, teknik ini menggunakan bahan-bahan dan prosedur yang sama, dan reaksi
juga dilakukan dalam DNA Termochycler yang sama seperti yang digunakan
dalam reaksi PCR. Perbedaannya, sekuensing hanya menggunakan satu primer
untuk setiap reaksi, sehingga amplifikasi produk terjadi secara linear, bukan
eksponensial seperti pada PCR. Perbedaan lainnya adalah penggunaan
dideoksinukleotida (ddNTP) untuk menghentikan pemanjangan rantai DNA
(Kumala 2014).
Identifikasi secara molekuler pada bakteri dapat dilakukan dengan
menggunakan gen 16S rRNA. Kriteria yang memenuhi persyaratan taksonomis
yang paling baik yaitu memiliki persen identitas sebesar 96% - 99%. Salah satu
perangkat lunak pencari database adalah Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST). Program ini digunakan untuk melakukan perbandingan sekuen antara
sekuen DNA yang terdapat pada database GenBank. Hasil BLAST terdiri dari
tiga bagian yang berbeda, yaitu grafik yang menunjukkan bagaimana porsi
kesamaan sekuen yang dibandingkan, daftar hits yang berisi nama sekuen yang
serupa dengan yang dicari urut berdasarkan kesamaan dan penyejajaran antara
sekuen yang dicari dengan sekuen yang ada pada database (Bushell dan Burns
2012).
14
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian
1. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium
Bioteknologi Fakultas Farmasi dan Sains, Jurusan Farmasi, Universitas
Muhammadiyah Prof. DR. Hamka Jakarta.
2. Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2016 – Oktober 2016
B. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: tabung reaksi, rak
tabung reaksi, labu Erlenmeyer, Beaker glass, gelas ukur, pipet mikro, mikrotip,
tabung mikrosentrifugasi, cawan Petri, jarum Ose, batang pengaduk, object
glass, cover glass, botol semprot, bunsen, jangka sorong, kertas cakram dengan
diameter 6 mm, kapas, kain kassa, plastic wrap, inkubator (Memmert), oven
(Memmert), autoklaf (Hirayama Hiclave HVE-50), laminar air flow (Cabinet),
hot plate (Akebonno), waterbath, microsentrifuge refrigenerator (PerfectSpin 24
Plus ), PCR thermo cycler (Tanach RAY-MG48), elektroforesis (Mupid EXU),
UV transilluminator (Genesys 20), Rotary shaker (Eyela).
C. Bahan Penelitian
1. Bahan Isolasi Bakteri Endofit
Sampel berupa daun sirsak (Annona muricata L.) segar dipotong hingga
berukuran 1-1,5 cm, alkohol 75%, akuades, NaOCl 5,3%, medium Nutrient Agar
(NA) dan medium Nutrient Broth (NB).
2. Bahan Isolasi DNA Genom
Isolat bakteri endofit daun sirsak (Annona muricata L.), EDTA, Lysozyme,
Isopropanol, Etanol 70%, dan Wizard kit. Wizard Genomic DNA Purification Kit
dari Promega, yang terdiri dari Nuclei Lysis Solution, RNase Solution, Protein
Praecipitation Solution, dan DNA Rehydration Solution.
3. Bahan PCR
Forward primer 27f (5’-AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG-3’) dan
reverse primer 1492r (5’-TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG A-3’) (Rosita
15
2012). Nuclease free water, GoTaq Green PCR Master Mix dari Promega, yang
terdiri dari: Taq DNA polymerase, dapar PCR, dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dan
Mg2+.
4. Bahan Elektroforesis
Gel agarosa, etidium bromide (EtBr), larutan dapar Tris Asetat EDTA
(TAE), DNA ladder 1 kb (Promega) dan loading dyes (Thermo Scientific).
5. Bahan Kultur Bakteri
Medium Muller Hinton Agar (MHA), biakan bakteri uji Bacillus subtilis
dan Salmonella typhi.
D. Prosedur Penelitian
1. Tahap Persiapan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini seperti dari kaca dan plastik
digunakan dalam keadaan steril. Alat-alat tersebut disterilisasi dengan dibungkus
menggunakan kertas. Alat-alat dari kaca disterilisasi dengan cara sterilisasi kering
dalam oven pada suhu 160ºC selama 2 jam, sedangkan alat-alat dari plastik
disterilisasi dengan uap air panas bertekanan tinggi menggunakan autoklaf pada
suhu 121°C selama 15 menit. Etanol 75% digunakan untuk sterilisasi laminar air
flow dan lingkungan di sekitar perlakuan, serta pemanasan menggunakan bunsen
digunakan untuk sterilisasi jarum Ose. Medium NA, MHA dan NB yang
digunakan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.
2. Isolasi Bakteri Endofit Daun Sirsak
Tahapan ini menggunakan metode yang digunakan oleh Kumala (2014)
pertama, sampel daun sirsak dalam kondisi segar dicuci dengan air mengalir
hingga bersih lalu dipotong dengan ukuran 1-1,5 cm. Kedua, potongan sampel
direndam etanol 75% selama 1 menit. Setelah itu, cairan perendam dibuang dan
diganti dengan natrium hipoklorit 5,3% lalu didiamkan selama 5 menit. Ketiga,
cairan perendam dibuang kembali dan sampel dibilas dengan etanol 75%
sebanyak tiga kali. Sampel yang telah steril lalu ditanam pada media Nutrient
Agar (NA) yang telah ditambahkan nistatin dan diinkubasi di ruang gelap pada
suhu ruang dan diamati hingga terdapat koloni yang tumbuh. Pemurnian
dilakukan dengan memindahkan koloni yang tumbuh ke cawan Petri yang berisi
16
NA. Setelah diperoleh biakan murni, bakteri endofit disimpan di dalam agar
miring NA (Kumala 2014).
3. Karakterisasi Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit Daun Sirsak
Pengamatan morfologi dilakukan pada kultur murni bakteri yang telah
diinkubasi selama 24 jam. Pengamatan yang dilakukan berupa makroskopik dan
mikroskopik. Pengamatan morfologi koloni bakteri endofit secara makroskopik di
antaranya pigmentasi koloni, bentuk koloni, elevasi koloni, permukaan koloni,
dan konsistensi koloni. Pengamatan secara mikroskopik meliputi, bentuk dan
warna sel dengan pewarnaan Gram. Pewarnaan dilakukan pada kultur murni
bakteri yang telah diinkubasi selama 18-24 jam, sediaan bakteri yang telah direkat
pada gelas objek dibubuhi larutan kristal violet selama 1 menit sebanyak 1 tetes,
kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan kembali.
Tahap selanjutnya pemberian larutan lugol sebanyak 1 tetes, diamkan
selama 1 menit, dicuci dengan air dan dikeringkan kembali. Preparat selanjutnya
dicuci dengan alkohol 96% sampai zat warna luntur dari preparat, lalu dibilas
dengan air dan biarkan hingga mengering. Tahap terakhir dilakukan dengan
pemberian safranin sebanyak 1 tetes didiamkan selama 30 detik. Preparat dicuci
kembali dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring. Pengamatan dilakukan
di bawah mikroskop dengan pengamatan bentuk sel dari preparat bakteri dan
warna yang dihasilkan, sehingga dapat diketahui jenis Gram dari bakteri tersebut
(Pratiwi 2008).
4. Fermentasi Bakteri Endofit dengan Medium Fermentasi Nutrient Broth
Fermentasi bakteri endofit dilakukan dengan cara menginokulasikan
bakteri endofit dalam medium nutrient broth (NB). Medium dibuat dengan
melarutkan NB dengan aqua dest. Kemudian campuran dipanaskan hingga
mendidih. Setelah itu, medium disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C
selama 15 menit. Medium yang telah steril, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
steril sebanyak 10 ml. isolat bakteri endofit diinokulasikan ke dalam tabung
reaksi yang telah berisi medium NB. Lalu campuran tersebut diinkubasi selama
7x24 jam dengan kecepatan shaker 145 rpm. Setelah itu, tiap 1x24 jam campuran
diambil sebanyak 1 ml dan disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 5000
rpm. Supernatan hasil sentrifugasi dipindahkan ke tabung mikro baru. Supernatan
17
tersebut digunakan sebagai larutan antibakteri untuk pengujian aktivitas
antibakteri bakteri endofit secara kualitatif.
5. Pengujian Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit secara Kualitatif
Uji aktivitas bakteri endofit penghasil antibakteri pada penelitian ini
dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar kertas cakram. Isolat bakteri
endofit dari agar miring diregenerasi ke media nutrient agar (NA), sedangkan
bakteri uji diregenerasi ke dalam 5 mL media nutrient broth (NB) yang dilakukan
di dalam lemari laminar air flow. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 28-30°C kemudian diukur serapannya dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm, sehingga diperoleh
transmitan 25%. Apabila lebih dari transmitan 25% mikroba diinkubasi lagi
sampai diperoleh transmitan 25% dan apabila kurang dari transmitan 25%
lakukan pengenceran. Suspensi bakteri yang telah memenuhi nilai transmitan
25% diambil sebanyak 10% kultur cair bakteri uji dimasukkan ke dalam media
MHA yang bersuhu 37℃. Lalu larutan isolat bakteri dituangkan sebanyak 20 ml
ke dalam cawan Petri steril dan ditunggu hingga dingin.
Kertas cakram yang telah disterilisasi lalu direndam dalam supernatan hasil
fermentasi. Kertas cakram yang telah direndam supernatan hasil fermentasi
tersebut lalu diletakkan pada medium yang telah terinokulasi bakteri patogen.
Selanjutnya diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37oC lalu diamati aktivitas
antibakteri dengan ada tidaknya zona hambatan di sekitar kertas cakram. Isolat
bakteri endofit dengan aktivitas antibakteri terbesar, selanjutnya akan dilakukan
proses isolasi DNA genom.
6. Isolasi DNA Genom dengan Wizard Kit
Isolat bakteri yang akan digunakan untuk proses isolasi DNA, terlebih
dahulu dikultur dalam medium Nutrient Broth (NB) dan diinkubasi pada suhu
37oC selama 24 jam. Proses isolasi dilakukan berdasarkan protokol yang terdapat
pada Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega 2014). Sebanyak 1,5 ml
kultur bakteri dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus (microtube) 2,0 ml
steril. Setelah itu, kultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan 13000 x g selama 2
menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, kemudian diresuspensikan endapan sel
bakteri secara menyeluruh dengan 480 µl EDTA 50Mm. Lalu ditambahkan 120 µl
18
lysozyme dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit
disentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 13000 x g dan dibuang supernatan
yang terbentuk. Tahap selanjutnya ditambahkan 600 µl nuclei lysis solution lalu
dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 80oC selama 5 menit untuk melisiskan
sel, sampel didiamkan pada suhu ruang kemudian ditambahkan 3 µl RNase
solution lalu dihomogenkan dengan membalikkan tabung. Setelah itu diinkubasi
pada suhu 37oC selama 30 menit. Tahap berikutnya ditambahkan 200 µl protein
precipitation solution kemudian dihomogenkan selama 20 detik dengan vortex
kecepatan tinggi, lalu diinkubasi sampel pada suhu dingin selama 5 menit dan
disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 13000 x g.
Supernatan yang berisi DNA selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung
mikrosentrifus baru yang berisi 600 µl isopropanol, dihomogenkan dengan lembut
sampai terlihat helai benang DNA. Setelah itu, campuran yang sudah homogen
disentrifugasi pada kecepatan 13000 x g selama 2 menit, selanjutnya supernatan
yang terbentuk dipindahkan secara hati-hati dan tabung dikeringkan dengan kertas
absorban. Sebanyak 600 µl etanol 70% ditambahkan ke dalam tabung yang berisi
DNA, dihomogenkan tabung dengan lembut untuk mencuci pelet DNA. Setelah
itu, disentrifugasi pada kecepatan 13000 x g selama 2 menit dan tabung
dikeringkan selama 15 menit. Tahap terakhir ditambahkan 100 µl DNA
rehydration solution kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam. DNA
disimpan pada suhu 2-8 oC (Promega 2014).
7. Analisis DNA Genom dengan Elektroforesis
Analisis DNA genom bakteri dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Agarosa konsentrasi 1% dibuat dengan cara ditimbang agarosa sebanyak 0,5
gram dalam 50 ml TAE 1X, dan dididihkan hingga larut. Setelah agak
dingin, sisir dipasang kemudian larutan tersebut dituang pada cetakan gel dan
didiamkan hingga mengeras. Setelah gel mengeras sisir diangkat dan nampan
dipindahkan ke wadah elektroforesis. Wadah tersebut terlebih dahulu diberi dapar
TAE 1X hingga menggenangi permukaan gel agarosa. Sebanyak 10 µl DNA hasil
isolasi dicampurkan dengan 2 µl loading dye 6x lalu dihomogenkan. Campuran
tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel. Pada sumur berbeda dimasukkan DNA
ladder 1kb.
19
Elektroforesis dinyalakan dan diatur tegangannya sebesar 100 volt.
Kemudian, alat dijalankan hingga xylene cyanol mencapai 1 cm dari tepi bawah
gel. Selanjutnya gel agarosa diambil dan dimasukkan ke dalam wadah yang sudah
mengandung etidium bromida selama 15 menit dalam ruang gelap, kemudian
dibilas dengan akuades selama 5 menit. Hasil diamati pada UV transilluminator
pada panjang gelombang 300 nm dan fragmen DNA yang muncul
didokumentasikan. Hasil positif ditandai dengan adanya fragmen DNA yang
mucul pada gel agarosa (Fatchiyah dkk. 2011).
8. Amplifikasi DNA dengan PCR
Proses amplifikasi genom bakteri terhadap gen 16S rRNA dilakukan
dengan menggunakan primer 27f dan primer 1492r. Proses amplifikasi dilakukan
berdasarkan protokol yang terdapat pada Maxima Hot Start Green PCR Master
Mix (2X). Sebanyak 25 µl Maxima Hot Start PCR master mix (2X)
dimasukkan ke dalam microtube 0,5 ml. Nuclease free water ditambahkan
sebanyak 9 µl, kemudian campuran diresuspensikan sampai larut sempurna
dengan cara dihomogenkan. Selanjutnya, campuran yang sudah homogen
ditambahkan primer 27f dan primer 1492r masing-masing sebanyak 2,5 µl, lalu
dihomogenkan. Sebanyak 3 µl DNA ditambahkan ke dalam tabung mikro lalu
dihomogenkan. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam PCR.
Proses PCR dilakukan menggunakan metode yang dilakukan oleh Bartlett
dan Stiling (2003), adapun tahapan proses PCR terdiri dari sebagai berikut:
a. Initial denaturation pada suhu 95ºC selama 5 menit sebanyak 1 siklus
b. Denaturation pada suhu 95°C selama 1 menit sebanyak 30 siklus
c. Annealing pada suhu 56ºC selama 1 menit sebanyak 30 siklus
d. Extension pada suhu 72ºC selama 1 menit sebanyak 30 siklus
e. Final extension pada suhu 72ºC selama 10 menit sebanyak 1 siklus
Amplikon yang diperoleh dari hasil PCR kemudian dianalisis dengan
elektroforesis menggunakan gel agarose.
9. Analisis Amplikon dengan Elektroforesis
Amplikon hasil amplifikasi yang didapat dianalisis dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1%. Agarosa konsentrasi 1% dibuat dengan cara
ditimbang agarosa sebanyak 0,5 gram dalam 50 ml TAE 1X, dan dididihkan
20
hingga larut. Setelah agak dingin, sisir dipasang kemudian larutan tersebut
dimasukkan ke dalam cetakan gel dan didiamkan hingga membeku. Setelah gel
mengeras sisir diangkat dan nampan dipindahkan ke wadah elektroforesis.
Wadah tersebut terlebih dahulu diberi dapar TAE 1X hingga menggenangi
permukaan gel agarosa. Sebanyak 6 µl amplikon hasil amplifikasi dimasukkan ke
dalam sumur gel agarosa secara hati-hati. Pada sumur berbeda dimasukkan DNA
ladder 1kb sebanyak 6 µl.
Elektroforesis dinyalakan dan diatur tegangannya sebesar 50 volt, kemudian
alat dijalankan hingga xylene cyanol mencapai 1 cm dari tepi bawah gel.
Selanjutnya gel agarosa diambil dan dimasukkan dalam wadah yang sudah
mengandung etidium bromida selama 15 menit dalam ruang gelap, kemudian bilas
dengan akuades selama 5 menit. Hasil diamati pada UV transilluminator pada
panjang gelombang 300 nm dan fragmen DNA yang muncul didokumentasikan.
Hasil positif ditandai dengan adanya fragmen DNA yang mucul pada gel agarosa
10. Sekuensing Gen 16S rRNA
Amplikon dimasukkan ke dalam tabung mikro 0,2 ml kering dan steril,
kemudian diberi label dan disegel dengan parafilm untuk mencegah kebocoran
dan perembesan. Sampel dikirim ke Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jakarta
Indonesia untuk selanjutnya dipurifikasi dan disekuensing.
11. Alignment Hasil Sekuens dengan Menggunakan Program Bioedit
Informasi DNA hasil sekuensing dianalisis dengan program Bioedit. Sekuen
DNA yang diperoleh dalam bentuk elektroforegram (Lampiran 21) dibandingkan
dengan sekuens database pada situs nBLAST
(http:/www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Setelah hasil yang didapat dibandingkan
dengan data pada GeneBank, kemudian dilakukan alignment terhadap persen
kemiripan dengan bakteri lain pada database.
21
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi
Determinasi merupakan tahap awal dalam penelitian untuk mendapatkan
identitas yang benar dari tanaman yang akan diteliti, sehingga dapat memberikan
kepastian tentang kebenaran tanaman tersebut. Berdasarkan hasil determinasi
tanaman sirsak yang dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat
Penelitian LIPI, Cibinong-Bogor menunjukkan bahwa daun sirsak yang menjadi
substrat bagi pertumbuhan bakteri endofit adalah Anonna muricata L. yang
termasuk dalam suku Annonaceae (Lampiran 1).
B. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri
Isolasi bakteri endofit dilakukan dengan menggunakan metode tanam
langsung pada medium Nutrient Agar (NA). Hasil dari proses isolasi yang telah
dilakukan diperoleh tiga isolat bakteri endofit yaitu BW-1LM, BW-2LP, dan BW-
3LK. Pengamatan morfologi secara makroskopik terhadap koloni bakteri hasil
isolasi meliputi bentuk koloni, pigmentasi koloni, konsistensi koloni, elevasi
koloni, dan tepian koloni. Pengamatan secara mikroskopik dilakukan terhadap
bentuk dan warna sel koloni bakteri dengan pewarnaan Gram. Hasil pewarnaan
Gram lalu dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x (Lampiran 17).
Hasil pengamatan makroskopik menunjukkan bahwa isolat BW-1LM
berwarna putih kekuningan, berbentuk tidak beraturan dan memiliki konsistensi
berlendir. Sedangkan hasil mikroskopik menunjukkan sel bakteri berbentuk basil
dan merupakan bakteri Gram positif. Pengamatan makroskopik isolat BW-2LP
berwarna putih, berbentuk tidak beraturan dan memiliki konsistensi berlendir,
sedangkan hasil mikroskopik menunjukkan sel bakteri berbentuk bulat dan
merupakan bakteri Gram positif. Pengamatan makroskopik isolat BW-3LK
berwarna putih, berbentuk tidak beraturan dan berlendir. Pengamatan mikroskopik
menunjukkan sel bakteri berbentuk bulat dan merupakan bakteri Gram negatif.
Hasil pengamatan karakteristik isolat bakteri endofit dapat dilihat pada Tabel 1.
22
Tabel 1. Hasil Pengamatan Karakteristik Isolat Bakteri Endofit dari Daun
Sirsak (Annona muricata L.)
Kode Morfologi
Isolat Bentuk Pigmentasi Konsistensi Elevasi Tepian Bentuk Sel Warna Sel
BW-1 Tidak Putih Tidak

Berlendir Timbul Basil Ungu
LM Beraturan kekuningan Beraturan
BW-2 Tidak Tidak
Putih Berlendir Timbul Bulat Ungu
LP Beraturan Beraturan
BW-3 Tidak Tidak
Putih Berlendir Timbul Bulat Merah
LK Beraturan Beraturan
Hasil data pada Tabel 1 terlihat bahwa ketiga isolat memiliki karakteristik
yang berbeda. Ketiga isolat bakteri tersebut dimurnikan, sehingga didapatkan tiga
koloni tunggal yang digunakan sebagai kultur stok dan kultur kerja. Proses
pemurnian dilakukan untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh bakteri lain.
Karakteristik yang diperoleh dari pewarnaan Gram ada 2 macam yaitu warna ungu
dan warna merah. Bakteri yang berwarna merah adalah bakteri Gram negatif,
sedangkan bakteri berwarna ungu adalah bakteri Gram positif (Radji 2010).
Bakteri Gram negatif dapat berwarna merah karena dinding sel bakteri
Gram negatif mengandung kadar lipid yang tinggi, sekitar 20%. Lipid ini dapat
larut pada tahap pencucian sediaan dengan alkohol 96%, sehingga pori-pori pada
dinding sel membesar dan zat warna yang sudah diserap oleh sel akan dilepaskan
kembali, akibatnya bakteri tersebut menjadi tidak berwarna dan pada saat
penetesan larutan safranin warna merah yang akan menempel pada dinding sel
bakterinya. Sebaliknya pada bakteri Gram positif pencucian dengan alkohol 96%
akan menyebabkan protein pada dinding sel mengalami denaturasi, sehingga pori-
pori mengecil dan kompleks ungu Kristal iodin tetap terperangkap pada dinding
sel, akibatnya bakteri berwarna ungu (Radji 2010).
C. Pengujian Aktivitas Antibakteri secara Kualitatif
Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan menginokulasikan kertas cakram
yang telah direndam dalam supernatan hasil fermentasi bakteri endofit daun
sirsak pada medium Muller Hinton Agar (MHA) yang telah dicampur bakteri uji
Gram positif Bacillus subtilis dan bakteri uji Gram negatif Salmonella typhi.
Sebelumnya ketiga isolat bakteri endofit diinokulasikan pada medium fermentasi
23
NB, kemudian dilakukan fermentasi selama 7x24 jam dengan kecepatan 145 rpm.
Hasil fermentasi kemudian disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 5000
rpm. Supernatan hari ke-1 sampai hari ke-7 yang dihasilkan kemudian digunakan
sebagai larutan uji aktivitas antibakteri.
BW-1LM BW-2LP BW-3LK

Gambar 2. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Sekunder Bakteri
Endofit dari Daun Sirsak (Annona muricata L.) terhadap Bakteri
Uji Bacillus subtilis
BW-1LM BW-2LP BW-3LK
Gambar 3. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Sekunder Bakteri

Endofit dari Daun Sirsak (Annona muricata L.) terhadap Bakteri
Uji Salmonella typhi
Hasil uji aktivitas pada bakteri B. subtilis dapat dilihat pada Gambar 2,
berdasarkan gambar tersebut zona hambat dapat terlihat di sekitar kertas cakram
pada produk fermentasi hari ke-5 dan hari ke-6. Gambar 3 merupakan hasil uji
aktivitas metabolit sekunder bakteri endofit terhadap bakteri S. typhi, pada produk
fermentasi hari ke-6 dan hari ke-7 terlihat adanya zona hambat di sekitar kertas
24
cakram, sedangkan dua isolat lainnya tidak mampu menghambat pertumbuhan
kedua bakteri uji tersebut.
Tabel 2. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat Metabolit Sekunder
Bakteri Endofit dari Daun Sirsak terhadap Bakteri Uji
Bacillus subtilis dan Salmonella typhi
Kode Aktivitas Antibakteri

No. Isolat Bakteri uji Hari ke-5 Hari ke-6 Hari ke-7
1. BW-1 LM B. subtilis 8,76 mm 9,01 mm -
2. BW-1 LM S. typhi - 9,11 mm 9,21 mm
Hasil pada Tabel 2 menunjukkan diameter zona hambat dari tiap isolat
bakteri. Angka tersebut menunjukkan aktivitas yang dihasilkan hanya dimiliki
oleh isolat BW-1 LM. Bakteri endofit tersebut dapat menghambat bakteri B.
subtilis dan S. typhi, sehingga digunakan untuk identifikasi molekular selanjutnya
dengan metode sekuensing gen 16S rRNA menggunakan teknik amplifikasi PCR.
D. Isolasi DNA Genom
Proses selanjutnya yaitu isolasi DNA genom bakteri endofit BW-1 LM yang
telah diremajakan sebelumnya dalam medium Nutrient Broth (NB) dan diinkubasi
pada suhu 37oC selama 1x24 jam. Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan
Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega 2014). Wizard kit tersebut adalah
seperangkat reagen yang dirancang untuk mengisolasi DNA dari leukosit, jaringan
hewan dan tumbuhan, yeast, bakteri Gram postif dan bakteri Gram negatif. Prinsip
isolasi DNA menggunakan Wizard kit yaitu lisis, ekstraksi, presipitasi protein, dan
rehidrasi DNA (Promega 2014). Penggunaan Wizard kit dalam proses ini sangat
penting karena dapat menghasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi dalam
waktu yang cepat.
Tahap pertama membuat dapar lysis dengan EDTA dan lisozyme. EDTA
berfungsi untuk menghambat enzim DNAse yang dapat menghidrolisis DNA.
Pada penelitian ini ditambahkan lysozyme karena isolat yang akan diisolasi adalah
bakteri Gram positif. Bakteri Gram positif memiliki beberapa lapisan
peptidoglikan yang tebal dan kaku (20-80 mm), maka dari itu perlu ditambahkan
enzim lysozyme untuk mendegradasi peptidoglikan yang ada pada bakteri
(Fatchiyah dkk. 2011). Tahapan berikutnya proses pelisisan sel, yaitu kultur
bakteri yang terdapat dalam medium NB disentrifugasi untuk mengendapkan sel
25
bakteri. Endapan sel yang diperoleh diresuspensikan dalam EDTA dan lysozyme,
sebagai tahap awal pelisisan sel dan diinkubasi untuk memecahkan dinding sel
bakteri.
Proses selanjutnya, dilakukan dengan penambahan nuclei lysis solution,
yang berfungsi guna memaksimalkan pelisisan sel. Selanjutnya, ditambah RNAse
solution yang digunakan untuk menghilangkan RNA, sehingga DNA dapat
diisolasi secara utuh (Muladno 2010). Setelah itu, ditambahkan protein
praecipitation solution yang berfungsi untuk mengendapkan protein. Tahap
terakhir pemberian isopropanol dan DNA rehydration solution, isopropanol yang
ditambahkan dengan supernatan dicampur dengan cara inverting. Isopropanol
berfungsi untuk mengendapkan DNA, sedangkan DNA rehydration solution
berfungsi untuk pengeringan atau penguapan larutan. DNA yang tertampung
tersebut selanjutnya digunakan pada proses PCR. Hasil DNA selanjutnya diuji
secara kualitatif dengan elektroforesis.
E. Analisis DNA dengan Elektroforesis
Hasil isolasi berupa DNA genom, selanjutnya dielektroforesis untuk
menguji hasil isolasi DNA secara kualitatif. Medium yang digunakan berupa gel
agarosa dengan konsentrasi 1% yang dilarutkan dalam larutan dapar TAE 1x.
Penggunaan dapar TAE 1x bertujuan untuk memudahkan proses migrasi fragmen
DNA sesuai dengan kekuatan ioniknya (Muladno 2010). Pada proses
elektroforesis, hasil isolasi DNA dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa yang
terbentuk. Selain itu, ke dalam sumur yang berbeda dimasukkan DNA ladder 1kb
sebagai penggaris pita DNA.
Elektroforesis dijalankan dan diatur tegangannya 100 volt selama 30 menit,
ini yang biasa digunakan dalam analisis (Fatchtiyah dkk. 2011). Kekuatan
tegangan listrik ini dapat mempengaruhi proses elektroforesis, karena dapat
menggerakkan DNA yang berada di kutub negatif menuju ke kutub positif
(Muladno 2010). DNA ladder 1 kb digunakan sebagai penanda molekul DNA
pada besar 250 bp sampai 10000 bp. Loading dye mengandung xylene cyanol dan
bromophenol blue yang berfungsi sebagai zat warna yang mengikat pita DNA
yang memudahkan dalam pengamatan jalannya elektroforesis. Serta gliserol yang
26
ada pada loading dye berfungsi sebagai pemberat agar molekul DNA tetap berada
dalam sumuran gel agarosa (Sambrook dan Russell 2001).
Adanya pita DNA genomik ditandai dengan bantuan pewarnaan zat
berfluoresensi ethidium bromide, senyawa ini akan terikat di antara dua untai
ganda DNA, sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar pada UV
transiluminator (Fatchiyah dkk. 2011). Hasil elektroforesis DNA genom dapat
terlihat pada Gambar 4 berikut.
Gambar 4. Fragmen DNA Genom Isolat Bakteri Endofit BW-1LM dari

Daun Sirsak. Lajur1:Produk Isolasi Genom. Lajur2:DNA ladder
Hasil isolasi DNA pada Gambar 4 menunjukkan hasil yang positif, yaitu
munculnya pita DNA pada panjang basa di atas 10000 bp. Hal tersebut sesuai
karena hasil isolasi DNA berupa DNA genom, yaitu DNA yang terdiri dari
keseluruhan gen, sehingga ukuran molekulnya besar.
F. Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan terhadap isolat bakteri endofit BW-1
LM dengan menggunakan primer 27f (5’-AGA GTT TGA TCA CTG GCT CAG-
3’) dan primer 1492r (5’-TAC GGC TTA CCT TGT TAC GA-3’) seperti yang
digunakan oleh Rosita (2012). Primer 27f adalah primer forward yang menempel
pada ujung 5’ untai DNA target yang telah terurai sebelumnya, sedangkan primer
1492r adalah primer reverse yang akan menempel pada ujung 5’ rantai tunggal
yang lainnya.
Proses amplifikasi pada PCR terdiri dari tiga tahap yaitu denaturation,
annealing dan extension. Proses amplifikasi diawali dengan initial denaturation
27
atau denaturasi awal pada suhu 95oC selama 5 menit untuk mempersiapkan untai
DNA yang akan dipisahkan. Tahap kedua adalah denaturation pada suhu 95oC
selama 1 menit yang bertujuan untuk memisahkan untai ganda DNA. Tahap
berikutnya dilanjutkan dengan proses annealing pada suhu 55oC selama 1 menit
dengan tujuan untuk penempelan primer pada daerah yang menjadi target PCR.
Proses selanjutnya yaitu extension pada suhu 72oC selama 1 menit untuk
memperpanjang primer berdasarkan sekuen pada untai DNA lama. Proses
denaturation, annealing, dan extension dilakukan sebanyak 30 siklus. Proses PCR
diakhiri dengan post extension pada suhu 72oC selama 10 menit untuk
menyempurnakan proses perpanjangan pita DNA.
Proses amplifikasi dilakukan berdasarkan protokol yang terdapat pada Go
Taq Hot Start Green Master Mix (2x). Komponen yang terdapat pada Go Taq
Green adalah taq DNA polymerase, reaction buffer, dNTPs, dan MgCl2. PCR
master mix (2x) adalah larutan dengan dua kali konsentrasi dari semua komponen
yang dibutuhkan dalam proses amplifikasi, kecuali primer dan cetakan DNA.
Keuntungan menggunakan PCR Master Mix (2x) adalah dapat menghemat waktu
serta mengurangi kesalahan dan kontaminasi karena berkurangnya jumlah
pemipetan yang harus dilakukan. Analisis hasil amplikon kemudian dapat dilihat
dengan menggunakan proses elektroforesis pada Gambar 5.
Gambar 5. Hasil Elektroforesis Amplikon DNA Isolat Bakteri Endofit

BW-1LM dari Daun Sirsak. Lajur1:DNA ladder 1kb Lajur2:
produk PCR
Proses amplifikasi berhasil dilakukan ditandai dengan adanya fragmen
DNA pada gel agarosa, dapat dilihat pada Gambar 5. Panjang fragmen DNA
28
tersebut berada pada kisaran 1500 bp. Hal ini sesuai dengan panjang gen 16S
rRNA yaitu yang mempunyai panjang sekitar 1500 bp (Clarridge 2004). Hasil
amplikon yang telah dielektroforesis, kemudian diberi label dan dibungkus
dengan parafilm untuk mencegah kebocoran pada saat pengiriman. Sampel
selanjutnya dikirim ke Lembaga Biologi Molekuler EIJKMAN Jakarta, Indonesia.
G. Analisis Hasil Sekuensing Gen 16S rRNA
Sekuensing adalah teknik yang digunakan untuk mengurutkan basa
nukleotida dalam fragmen DNA. Proses sekuensing dilakukan dengan
menggunakan jasa Lembaga Biologi Molekuler Eijkman Jakarta, Indonesia. Hasil
pengolahan data sekuens dianalisa menggunakan program nBLAST secara online
pada website NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis tersebut dilakukan
dengan tujuan untuk membandingkan data sekuen yang dimiliki (query) dari hasil
penelitian dengan sekuen-sekuen DNA dari berbagai penjuru dunia yang
didepositkan dan dipublikasikan pada databae.
Hasil analisis penyejajaran sekuen dengan program nBLAST akan
menampilkan description merupakan keterangan nama spesies yang paling
mendekati, max score merupakan nilai sekuen yang paling mendekati pada sekuen
hasil penelitian. Semakin tinggi nilai score yang tertera (paling atas), maka
semakin mendekati pula urutan sekuen DNA yang didapat dengan sekuen spesies
tersebut, query coverage adalah tingkat kedekatan sekuen yang dianalisis dengan
sekuen yang dimiliki spesies, % identification yaitu persentase homologi DNA
hasil sekuen dan E-value atau nilai dugaan statistik terhadap kedua sekuen,
visualisasi grafik penyejajaran sekuen dan tampilan penyejajaran sekuen query
dengan sekuen database.
29
Gambar 6. Deskripsi Hasil Nucleotide BLAST Gen 16S rRNA Isolat Bakteri
Endofit dari Daun Sirsak
Kriteria yang memenuhi persyaratan taksonomi dikatakan spesies yang
sama apabila sekuen database yang memiliki persen identitas di antara 95% -
99% dan dapat didefinisikan kemiripannya pada tingkat spesies apabila persen
identitasnya ≥99% (Clarridge 2004). Gambar 6 merupakan hasil analisis
alignment sekuen dengan program nBLAST. Hasil data tersebut didapatkan
bahwa sampel isolat BW-1LM memiliki nilai E-value nol dan persen kemiripan
yang sama yaitu 99% pada spesies bakteri Bacillus licheniformis strain DSM 13.
Nilai nol menyatakan tingkat kepercayaan yang semakin tinggi bahwa sekuen
query memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan sekuen database. Bacillus
licheniformis DSM 13 memiliki ciri morfologi sebagai berikut: termasuk bakteri
Gram positif, berbentuk batang, termasuk bakteri anaerobik fakultatif, koloni
bakteri berwarna putih kekuningan, hasil ini sesuai dengan data yang ada pada
karakterisasi morfologi pada isolat BW-1LM.
30
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Isolat bakteri endofit BW-1LM memiliki aktivitas antibakteri terhadap
Bacillus subtilis dan Salmonella typhi dan berhasil diidentifikasi secara molekuler
dengan teknik PCR dengan tingkat kemiripan 99% terhadap Bacillus
licheniformis strain DSM 13.
B. Saran
Untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan skrining fitokimia metabolit
sekunder dari daun sirsak (Annona muricata L.) yang memiliki aktivitas
antibakteri.
31
DAFTAR PUSTAKA
Artini NPR, Wahjuni S, Sulihingtyas WD. 2012. Ekstrak Daun Sirsak (Annona
muricata L.) sebagai Antioksidan pada Penurunan Kadar Asam Urat Tikus
Wistar. Jurnal Kimia. 6(2): 127-137.
Bartlett JMS, Stirling D. 2003. PCR Protocols. Humana Press Inc. Totowa NJ.
Hlm. 90-91.
Bintang M, Safira UM, Kusumawati DE, Pasaribu FH, Sidharta T. 2014. Analysis
of 16S rRNA Sequence of Endophytic Bacteria Isolate BS1 from Piper
betle (L.) Stem. International Conference on Agricultural, Environmental
and Biological Sciences (AEBS-2014). Phuket Thailand
Brown TA. 1991.Pengantar Kloning Gen. Terjemahan: Soemiati AM, Praseno.

Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta. Hlm. 182.
Bushell C, Burns M. 2012. Feasibility Study into the Use of DNA Sequencing for
the Identification of Probiotic Bacteria. Journal of the Association of Public
Analysts. 40: 28-38.
Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for
Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious
Diseases. Journal Clinical Microbiology Reviews. 17(4): 840-859.
Departemen Kesehatan RI. 2001. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (I). Jilid I.
Departemen Kesehatan dan Kesejahteraan Sosial RI. Jakarta. Hlm. 23.
Fatchiyah, Arumingtyas EL, Widyarti S, Rahayu. 2011. Biologi Molekular

(Prinsip Dasar Analisis). Erlangga. Jakarta. Hlm. 8, 18, 22-24, 35, 48-55,
112-113.
Firmansyah D, Bachri MS, Nurkhasanah. 2016. Pengaruh Pemberian Ekstrak

Etanol dan Kloroform Daun Sirsak terhadap Kolesterool Total dan
Trigliserida pada Tikus yang Diinduksi Aloksan. Pharmaciana. 6(1): 47-
54.
Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase

Chain Reaction (PCR). Pusat Studi Bioteknologi - Universitas Surabaya.
9(1): 17-29.
Haro G, Utami NP, Sitompul E. 2014. Study of The Antibacterial Activities of

Soursop (Annona muricata L.) Leaves. International Journal of
PharmTech Research. 6: 575-581.
Hidayatun N, Susilowati DN, Mulya K. 2011. Identifikasi 26 Isolat Bakteri

Endofit dan Filosfer Padi dengan Analisis Sekuens 16S RDNA. Berita
Biologi. 10(4). Hlm.1-7
32
Kumala S. 2014. Mikroba Endofit: Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang
Farmasi. PT. ISFI Penerbitan. Jakarta. Hlm. 15-47.
Meisyayati S, Dewiwaty M. 2015. Efektifitas Antiinflamasi Ekstrak Daun Sirsak

Sebagai Komplemen Natrium Diklofenak pada Tikus Putih Jantan Galur
Wistar. Kartika Jurnal Ilmiah Farmasi. 3(2): 18-21.
Muhartono, Windarti I, Busman H, Tarigan H, Putra BDJ. 2014. Ekstrak Etanol

Daun Sirsak (Annona muricata) Berpotensi Memiliki Efek Kemoterapi
pada Kanker Payudara Tikus Putih. Jurnal Kedokteran Brawijaya. 28(2):
97-100.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika Edisi Kedua. IPB Press. Bogor.
Hlm. 18, 27-30, 61.
Mulyanti D, Rismawati E, Maulana IT, Febriani D, Dewi YN. 2015. Uji Aktivitas
Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) pada Bakteri
Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, dan Staphylococcus
epidermidis. Prosiding Seminar Nasional. 1(1): 2477-2356.
Pratiwi ST. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta. Hlm. 129-130, 143-
144, 188-191.
Promega Corporation. 2014. Wizard Genomic DNA Purification Kit. USA. Hlm.
1-19.
Promega Corporation. 2012. Protocols Go Taq Hot Start Green PCR Master Mix
(2X). USA. Hlm. 1-2.
Putri RNA. 2012. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Sirsak (Annona
muricata L.) dengan Metode DPPH. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan Universitas Islam Negeri Syrif Hidayatullah, Jakarta. Hlm. 24.
Radji M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan

Obat Herbal. Dalam: Majalah Ilmu Kefarmasian. Laboratorium
Mikrobiologi Departemen Farmasi, FMIPA-UI. Depok. Hlm. 1-14.
Radji M. 2010. Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan

Kedokteran. EGC. Jakarta. Hlm. 99.
Radji M. 2011. Rekayasa Genetika Pengantar Untuk Profesi Kesehatan. CV

Sagung Seto. Jakarta. Hlm. 27-28, 18-71.
Resti Z, Habazar T, Prima DP, Nasrun. 2013. Skrining dan Identifikasi Isolat
Bakteri Endofit Untuk Mengendalikan Penyakit Hawar Daun Bakteri pada
Bawang Merah. Jurnal HPT. Tropika. 13(2): 167-178.
33
Rosita A. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit dari Umbi Tanaman
Kentang (Solanum tuberosum L.) menggunakan Primer PCR-RAPD.
Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri, Malang.
Hlm. 62-68.
Rohadi D, Bachri MS, Nurani LH. 2015. Aktivitas Antikonsulvan Fraksi Etil
Asetat dan Fraksi Tidak Larut Etil Asetat Daun Sirsak (Annona muricata
L.) pada Mencit. Farmasains. 2(5): 1-4.
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold

Spring Harbor Laboratory Press. New York. Hlm. 5-6.
Strobel G, Daisy B. 2003. Biosprospecting for Microbial Endophytes and Their

Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Review. 67(4):
491-502.
Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites.
Natural Product Reports. 18: 448-459.
34
Lampiran 1. Hasil Determinasi dari Daun Sirsak
35
Lampiran 2. Skema Kerja Isolasi Bakteri Endofit dari Daun Sirsak
Daun sirsak segar
Cuci daun sirsak dengan air

mengalir
Potong daun menjadi bentuk dadu
Rendam dengan alkohol 75%

selama 1 menit
Rendam dengan NaoCl 5,3% selama

5 menit
Rendam kembali dengan

alkohol 75% selama 30 detik
Diinokulasikan daun sirsak pada medium

NA yang telah steril
Diinkubasi selama 1-2 hari pada suhu 37 oC

dan diamati pertumbuhan bakteri endofit
36
Lampiran 3. Skema Kerja Karakterisasi Koloni Bakteri Endofit Daun Sirsak
Isolat Bakteri Endofit
Makroskopik Mikroskopik
Parameter : Parameter :
• Bentuk koloni • Bentuk sel

• Pigmentasi koloni • Warna sel
• Konsistensi koloni
• Elevasi koloni
• Tepian koloni
37
Lampiran 4. Skema Kerja Proses Fermentasi Bakteri Endofit Daun Sirsak
Dimasukkan NB ke dalam beaker glass

250 ml, panaskan sampai homogen
Dimasukkan 10 ml NB ke dalam tabung

reaksi besar lalu sterilisasi
Diinokulasikan ke dalam NB steril bakteri

endofit 1 ose
Rotary shaker dengan kecepatan 145 rpm

selama 7 x 24 jam
Diambil 1 ml supernatan setiap 1 x 24 jam

dan masukkan ke dalam microtube
Sentrifugasi supernatan selama 3 menit

5.000 rpm
Pisahkan supernatan dengan pelet yang

terbentuk
38
Lampiran 5. Skema Kerja Peremajaan dan Pembuatan Kultur Biakan
Bakteri Uji Bacillus subtilis dan Salmonella typhi
Biakan Bacillus subtilis

dan Salmonella typhi
1 ose biakan B.subtilis dan S.typhi

diinokulasikan dalam medium slant
NA, diinkubasi selama 1 x 24 jam
B.subtilis dan S.typhi

dalam slant NA
1 ose isolat bakteri B.subtilis dan

S.typhi diinokulasikan dalam 10 ml
medium NB, inkubasi selama 2 x 24
jam
B.subtilis dan
S.typhi dalam
medium NB
Hitung %
transmitan
39
Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Bakteri Endofit Secara Kualitatif
terhadap Bakteri Uji Bacillus subtilis dan Salmonella typhi
Supernatan
Uji Aktivitas
Bacillus subtilis dan Salmonella typhi
Inkubasi pada suhu 37oC selama 1-2 hari
Hasil positif : adanya Hasil negatif : tidak

zona bening adanya zona bening
Isolat bakteri endofit dengan zona bening

terbesar yang akan digunakan selanjutnya
pada identifikasi molekuler
40
Lampiran 7. Skema Kerja Peremajaan Isolat Bakteri Endofit BW-1 LM
1 ose isolat bakteri endofit BW-1 LM

diinokulasikan pada medium slant
NA, inkubasi selama 1x24 jam

dalam slant NA
1-2 ose isolat bakteri endofit BW-1

LM diinokulasikan dalam 5 ml
medium NB, inkubasi selama 1x24
jam

dalam medium NB
41
Lampiran 8. Skema Kerja Identifikasi Molekuler Bakteri Endofit BW-1 LM
dari Daun Sirsak
Isolasi DNA genom bakteri endofit daun

sirsak dengan Wizard Genomic DNA
Purification Kit
Analisis hasil isolasi DNA dengan

elektroforesis gel agarosa
Amplifikasi DNA hasil isolasi dengan

teknik PCR
Analisis Amplikon dengan elektroforesis

gel agarosa
Sekuensing
Analisis data hasil sekuensing
42
Lampiran 9. Skema Kerja Isolasi DNA Bakteri Endofit BW-1 LM dari
Daun Sirsak
1ml kultur isolat bakteri

endofit
• Dipipet ke dalam mikrotube steril

• Disentrifugasi 13.000 x g selama 2
menit
• Supernatan dibuang
Pelet sel bakteri
• + 480 µl EDTA 50mM

• Ditambahkan lysozim 120 µl, pipeting to
mix
• Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit
Campuran larutan
• + 600 µl Nuclei Lysis Solution

pipeting ad homogen, inkubasi suhu
80 oC selama 5 menit
• + 3 µl RNAse Solution, bolak-
balikkan tube 2-5 kali, inkubasi suhu
37 oC selama 30 menit
• + 200 µl Protein Praecipation
Solution, vortex sealama 20 detik,
inkubasi pada suhu dingin selama 5
menit
• Sentrifugasi 13000 x g selama 2
menit
43
Hasil sentrifugasi
• Dipindahkan ke microtube 2 ml
baru,, masukkan supernatan
kedalam tube baru berisi 600 µl
Isopropanol , bolak-balikkan
sampai terlihat helaian pita DNA
• Sentrifugasi 13.000 x g selama 3
menit, buang supernatan dan
keringkan tube
• + 600 µl etanol 70% dibolak-
balikkan tube
• Sentrifugasi 13000 x g selama 3
menit, keringkan tube selama 10-15
menit
Hasil isolasi DNA • + 100 µl DNA Rehydration solution
o
disimpan pada suhu 2-8oC • Inkubasi suhu 65 C selama 1 jam
• Simpan DNA pada suhu 2-8oC
44
Lampiran 10. Skema Kerja Analisa DNA Genom Isolat Bakteri Endofit dari
Daun Sirsak dengan Elektroforesis
Konsentrasi gel agarosa 1 %
• Tuang dalam cetakan gel, dipasang sisir hingga

membeku
• Sisir diangkat, gel dipindah ke alat
elektroforesis
Gel agarosa padat yang direndam

dengan TAE 1X
• + 2 µl DNA ladder 1 kb
Campuran larutan pada sumur

pertama
• + 10 µl Hasil isolasi DNA genom

• + 2 µl Loading dye 6X
Campuran larutan pada sumur kedua
• Elektroforesis dinyalakan pada

tegangan 100 V
Alat dijalankan hingga Brompenol

blue mencapai 1 cm dari tepi bawah
gel
• Direndam dalam EtBr 15 menit

• Dibilas dengan akuades 5 menit
Hasil diamati pada UV

transiluminator, hasil positif terlihat
adanya pita-pita DNA
45
Lampiran 11. Skema Kerja Proses Amplifikasi DNA Isolat Bakteri Endofit
dari Daun Sirsak Menggunakan PCR
Dimasukkan sebanyak 12,5 µl Go Taq green

master mix (2X) ke dalam microtube 0,2 ml
• + primer forward dan primer

reverse masing-masing sebanyak
2,5 µl, lalu dihomogenkan.
• + 3 µl template DNA dengan
nuclease free water untuk
memperoleh volume total 25 µl
lalu dihomogenkan
Campuran larutan dalam microtube 0,2 ml
• Masukkan ke dalam mesin PCR
Jalankan mesin PCR dengan setting:

Denaturasi awal : 95ºC selama 5 menit
Denaturasi : 95ºC selama 1 menit
Annealing : 56ºC selama 1 menit
Ekstensi : 72ºC selama 1 menit
Ekstensi akhir : 72ºC selama 10 menit
Sebanyak 30 siklus
Amplikon dianalisis menggunakan

elektroforesis gel agarosa 1 % sisa amplikon
disimpan pada suhu -20ºC
46
Lampiran 12. Perhitungan Pembuatan Bahan-Bahan yang Digunakan untuk
Isolasi Bakteri Endofit dan Fermentasi
1. Medium NA
Bahan : Lab-Lemco powder 1,0 g
Yeast extract 2,0 g
Peptone 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Air Suling 1000 ml
Cara : Bahan NA dilarutkan dalam 1000 ml air suling dipanaskan sampai
bahan larut. Sterilisasi medium pada suhu 121oC, 2 atm, selama 15 menit.
Medium : Pembenihan mikroba uji.
2. Medium NB
Bahan : Lab-Lemco powder 1,0 g
Yeast extract 2,0 g
Peptone 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Air suling 1000 ml
Cara : Bahan dilarutkan dalam air suling dipanaskan sampai bahan larut.
Sterilisasi medium pada suhu 121oC, 2 atm, selama 15 menit.
Medium : Perbenihan mikroba uji.dan medium fermentasi.
3. Medium MHA
Bahan : Beef Extract 2.00 g
Acid Hydrolysate of Casein 17.5 g
Starch 1.50 g
Agar 17.0 g
Destilled Water 1000 ml
47
Lampiran13. Perhitungan Pembuatan Bahan-Bahan untuk Identifikasi
Molekuler Bakteri Endofit BW-1 LM dari Daun Sirsak
1. Perhitungan Pembuatan Lysis Buffer
a. Sediaan yang dibutuhkan 20 mM Tris HCl pH 8

M = dibuat stok 0.01 M Tris HCl pH 8 dalam volume 20 ml
0.01M = , ,
,
X = = 0,31528 g
= 3,1528 mg untuk mencapai pH 8

b. Sediaan yang dibutuhkan 50 mM EDTA
m= ×v
⬚
0,05= × 50
,
= 372,24 × 0,05 = 50.
= 0,37724 ! "#$%&"' (' "' )*$" (+%
c. Sediaan yang dibutuhkan lyzozyme 10 mg/ml

Diambil = = 10 mg/ml
,
Jadi yang ditimbang 100 mg lysozyme

2. Perhitungan Agarosa
A. Konsentrasi 1 %
1 x 50 ml = 0,5 gram
100
3. Dapar Tris Asetat (TAE) 1x
Sebanyak 50 ml dapar TAE 10x dilarutkan dalam akuabides steril hinga tepat
500 ml.
48
4. Perhitungan Campuran PCR menggunakan cetakan DNA
PCR Master Mix 2x 12,5 µl
DNA template 3,0 µl
Nuclease Free Water 4,5 µl
Primer forward 2,5 µl
Primer reverse 2,5 µl +
Volume reaksi total 25 µl
49
Lampiran 14 . Perhitungan Pembuatan Primer 27f dan Primer 1492r
1. Spesifikasi Primer
A. 27f ( Integrated DNA Tecnologies, Singapore)
a. Sekuens : 5’-AGA GTT TGA TCA CTG GCT CAG-3’
b. Skala sintesis : 25 nmol
c. Panjang basa : 21 basa
d. Berat molekul : 6461,2
e. Tmº : 54,5ºC
f. GC content : 47,6%
B. 1492r (Integrated DNA Tecnologies Singapore)
a. Sekuens : 5’-TAC GGC TTA CCT TGT TAC GA-3’
b. Skala sintesis : 25 nmol
c. Panjang basa : 20 basa
d. Berat molekul : 6083
e. Tmº : 53,2ºC
f. GC content : 45,0%
C. Pengenceran Primer
i. Primer 27f
38,6 nmol primer ditambahkan 386 µl ddH2O untuk
mendapatkan konsentrasi 100 µm
ii. Primer 1492r
23,1 nmol primer ditambahkan 231 µl ddH2O untuk
mendapatkan konsentrasi 100 µm
D. Pembuatan primer dengan konsentrasi 10 µM untuk stok kerja
sebanyak 100 µl
M1 x V1 = M2 x V2
10 µM x 100 µl = 100 µM x V2
V2 = 10 µM x 100 µl
100 µM
= 10 µl
50
Lampiran 15. Hasil Isolasi Bakteri Endofit dari Daun Sirsak
Isolat BW-1 LM
Isolat BW-2 LP
Isolat BW-3 LK
51
Lampiran 16. Hasil Karakteristik Makroskopik Isolat Bakteri Endofit dari
Daun Sirsak
Isolat Murni Bakteri Endofit BW-1 LM
Isolat Murni Bakteri Endofit BW-2 LP
Isolat Murni Bakteri Endofit BW-3 LK
52
Lampiran 17. Hasil Karakteristik Mikroskopik Isolat Bakteri Endofit dari
Daun Sirsak
BW-1 LM
BW-2 LP
BW-3 LK
53
Lampiran 18. Hasil Fermentasi Isolat Bakteri Endofit dari Daun Sirsak
a. Isolat bakteri endofit BW-1LM, BW-2LP, BW-3LK
b. Supernatan isolat bakteri endofit BW-1LM, BW-2LP, BW-3LK

hari ke-1 sampai hari ke-7
54
Lampiran 19. Isolat Bakteri Endofit BW-1LM dari Daun Sirsak
Isolat Bakteri Endofit BW-1

LM dalam Slant NA
Isolat Bakteri Endofit BW-1

LM dalam Slant NB
55
Lampiran 20. Hasil Isolasi DNA dan Hasil Amplifikasi DNA Isolat Bakteri
Endofit BW-1LM
a. DNA Isolat Bakteri Endofit BW-1 LM
b. Amplikon Isolat Bakteri Endofit BW-1 LM
56
Lampiran 21. Hasil Sekuensing dalam Bentuk Elektroforegram
57
Lampiran 22. Hasil Konsensus Primer 27f dan Primer 1492r dari Sampel
Isolat Bakteri Endofit BW-1LM Daun Sirsak
58
Lampiran 23. Hasil nucleotide BLAST Gen 16S rRNA Isolat Bakteri Endofit
dari Daun Sirsak
59
Lampiran 24. Alat-Alat yang Digunakan Selama Penelitian
(a) Peltier Thermal Cycler (b) Microsentrifuge iefrigrator
(c) UV Transilluminator (d) Deep freezer
(e) iotary Shaker (f) Elektroforesis
60
(a) Collection tube (b) Mikropipet
(c) Laminar Air Flow (d) Inkubator
(e) Waterbath (f) Autoklaf
61
Lampiran 25. Bahan-Bahan yang Digunakan Selama Penelitian
(a) EthidiumBromida b) Buffer TAE 1X
(c) Nutrient Broth (d) Nutrient Agar
(e) Agarose
62
(f) Wizard Kit Genomic DNA Purification (g) Primer 27f & 1492r
(h) DNA Loading dye (i) GoTaq Green Master Mix
(j) iNAse A Solution (k) DNA ladder
63

File

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Deskripsi Asli:

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

File

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DAUN SIRSAK

(Annona muricata L.) PENGHASIL ANTIBAKTERI

PROGRAM STUDI FARMASI

IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DAUN SIRSAK

Kata kunci: bakteri endofit, daun sirsak, pcr, sekuensing dna.

Jakarta, November 2016

Gambar 1. Tanaman Sirsak (Annona muricata L.) Sumber: Pribadi

BW-1 Tidak Putih Tidak

BW-1LM BW-2LP BW-3LK

BW-1LM BW-2LP BW-3LK

Gambar 3. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Sekunder Bakteri

Kode Aktivitas Antibakteri

Gambar 4. Fragmen DNA Genom Isolat Bakteri Endofit BW-1LM dari

Gambar 5. Hasil Elektroforesis Amplikon DNA Isolat Bakteri Endofit

Brown TA. 1991.Pengantar Kloning Gen. Terjemahan: Soemiati AM, Praseno.

Fatchiyah, Arumingtyas EL, Widyarti S, Rahayu. 2011. Biologi Molekular

Firmansyah D, Bachri MS, Nurkhasanah. 2016. Pengaruh Pemberian Ekstrak

Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase

Haro G, Utami NP, Sitompul E. 2014. Study of The Antibacterial Activities of

Hidayatun N, Susilowati DN, Mulya K. 2011. Identifikasi 26 Isolat Bakteri

Meisyayati S, Dewiwaty M. 2015. Efektifitas Antiinflamasi Ekstrak Daun Sirsak

Muhartono, Windarti I, Busman H, Tarigan H, Putra BDJ. 2014. Ekstrak Etanol

Radji M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan

Radji M. 2010. Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan

Radji M. 2011. Rekayasa Genetika Pengantar Untuk Profesi Kesehatan. CV

Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold

Strobel G, Daisy B. 2003. Biosprospecting for Microbial Endophytes and Their

Daun sirsak segar

Cuci daun sirsak dengan air

Potong daun menjadi bentuk dadu

Rendam dengan alkohol 75%

Rendam dengan NaoCl 5,3% selama

Rendam kembali dengan

Diinokulasikan daun sirsak pada medium

Diinkubasi selama 1-2 hari pada suhu 37 oC

Isolat Bakteri Endofit

• Bentuk koloni • Bentuk sel

Dimasukkan NB ke dalam beaker glass

Dimasukkan 10 ml NB ke dalam tabung

Diinokulasikan ke dalam NB steril bakteri

Rotary shaker dengan kecepatan 145 rpm

Diambil 1 ml supernatan setiap 1 x 24 jam

Sentrifugasi supernatan selama 3 menit

Pisahkan supernatan dengan pelet yang

Biakan Bacillus subtilis

1 ose biakan B.subtilis dan S.typhi

B.subtilis dan S.typhi

1 ose isolat bakteri B.subtilis dan

Bacillus subtilis dan Salmonella typhi

Inkubasi pada suhu 37oC selama 1-2 hari

Hasil positif : adanya Hasil negatif : tidak

Isolat bakteri endofit dengan zona bening

Isolat Bakteri Endofit

1 ose isolat bakteri endofit BW-1 LM

Isolat Bakteri Endofit

1-2 ose isolat bakteri endofit BW-1

Isolat Bakteri Endofit

Isolasi DNA genom bakteri endofit daun

Analisis hasil isolasi DNA dengan

Amplifikasi DNA hasil isolasi dengan

Analisis Amplikon dengan elektroforesis

Analisis data hasil sekuensing