TUGAS MERANGKUM JURNAL

PATHOGENS

Isolation, Characterization, and Application of a Bacteriophage

Infecting the Fish, Pathogen Aromonas hydrophila.

Isolasi, karakterisasi, dan Aplikasi dari Subuah Bakteriofag

yang menginfeksi ikan, patogen Aromonas hydrophila.

Oleh kelompok 3 (Tiga)

Anders Parlindungan 05051281722018

Anita Ogara 05051281924066
Fahri Ageng Kiwi 05051381924039
Fransiska Mailanda 05051181722005
M. Rizki Khatami 05051381924043
Toni Susanto 05051181924004
Reza Mahendra 05051381924040
Valencia Aff Neka 05051181924015
Veronitta Hodifa 05051181924007

PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN

JURUSAN PERIKANAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
2021
Kata Kunci : Aeromonas hydrophila, budidaya, bakteriofag, terapi fag, genomik
fag.

Akuakultur adalah sektor produksi makanan dengan pertumbuhan tercepat

di dunia. Pada tahun 2014, akuakultur menghasilkan hampir 74 juta ton ikan,
sekitar 45% dari produksi global makanan berbasis ikan. Karena meningkatnya
permintaan protein makanan dan stagnasi atau pengurangan tangkapan liar,
produksi ikan melalui budidaya meningkat, dengan tingkat pertumbuhan melebihi
8% per tahun. Namun peningkatan budidaya perikanan telah mengakibatkan
beberapa permasalahan, diantaranya rusaknya ekosistem alam, pencemaran air,
pencemaran hayati, dan munculnya beragam penyakit ikan. Penyakit bakteri ikan
biasanya diobati dengan antibiotik, dan ini merupakan penyebab kebocoran ke
lingkungan dan pemilihan resistensi. Aeromonas spp. adalah bakteri yang paling
umum di habitat air tawar dan sering dikaitkan dengan infeksi parah pada spesies
ikan budidaya. Aeromonas hydrophila, bakteri gram negatif berbentuk batang,
merupakan penyebab utama penyakit motil Aeromonas septicemia, juga dikenal
sebagai busuk ekor dan sirip.
Bakteri ini menyebabkan infeksi serius pada berbagai spesies ikan air
tawar, termasuk loach (Misgurnus anguillicaudatus), lele saluran (Ictalurus
punctatus), dan ikan mas (Cyprinus carpio), dan menginfeksi beberapa spesies
ikan laut pada tingkat yang lebih rendah. Tanda-tanda klinis dari infeksi ini
meliputi bisul, perut kembung, penumpukan cairan, anemia, dan pendarahan,
mengakibatkan kematian massal pada ikan di seluruh dunia. Dalam praktik
bertani, berbagai metode seperti vaksinasi, klorinasi air, dan kemoterapi antibiotik
telah terbukti dapat mengurangi terjadinya infeksi Aeromonas. Namun,
penggunaan antibiotik yang berlebihan telah mengakibatkan munculnya strain A.
hydrophila yang resisten terhadap beberapa obat.
Beberapa penelitian telah menunjukkan efek terapeutik fag sebagai
pengganti antibiotik pada masalah kesehatan manusia dan hewan. Loach (M.
anguillicaudatus) dibudidayakan secara luas di Korea Selatan karena tingginya
permintaan sebagai ikan pakan dan penggunaannya yang luas dalam pengobatan
tradisional dan upacara Buddha.
 Isolasi dan Karakterisasi Bakteriofag. Dari total 300 sampel tanah dan air
yang diuji, dua bakteriofag diisolasi dari satu sampel air yang dikumpulkan dari
Pantai Wahyeon menggunakan inang A. hydrophila (KCTC 2358). Plak dengan
ukuran berbeda dipilih, dan strain murni dibuat dengan tiga siklus isolasi plak.
Ukuran plak merupakan karakteristik yang melekat pada kedua fag ini dan
menunjukkan sedikit variasi dalam setiap langkah isolasi plak. Di antara 30 galur
yang diuji, Akh-2 hanya melisiskan empat galur A. hydrophila tetapi tidak dapat
melisis tiga galur A. hydrophila lainnya atau sisa 23 bakteri yang diuji (Tabel1).
Bakteri Strain ID Lysis oleh Sumber
Akh-2 *
KTCC 2358 IYA 1
KCCM 32586 TIDAK 2
AH-A6 IYA 3
Aeromonas AH-A8 TIDAK 3
hydrophila
AH-20 IYA 3
AH-21 TIDAK 3
AH-Juwah IYA 3
pectobacterium 35, 48, 63, 92, E42, E44 TIDAK 4
spp.
Streptococcus S75, S86, S103, S106 TIDAK 4
aureus
Basil spp. B1, B2, B3, B4, B5, B6, B8, B11, TIDAK 4
B12, B13, B87, B97
Escherichia coli CJY H7 TIDAK 4
* 1: Koleksi Korea untuk Jenis Budaya, 2: Pusat Budaya Mikroorganisme Korea, 3:
Universitas Nasional Seoul, 4: Divisi Keamanan Mikroba, Institut Nasional Ilmu
Pertanian, Administrasi Pembangunan Pedesaan, Wanju-gun, Jeollabuk-do, Republik
Korea ..

Gambar 2. Kurva pertumbuhan satu langkah dari fag Akh-2

Kurva Pertumbuhan Satu Langkah dan Stabilitas Phage. Berdasarkan

kurva pertumbuhan satu langkah (Gambar2), periode laten dan ukuran ledakan
dihitung sebagai ~ 50 ± 5 menit dan 139 ± 5 PFU / sel yang terinfeksi. Hasilnya
adalah rata-rata tiga ulangan dengan simpangan baku berupa garis vertikal. Fag
dipertahankan dari -8080C sampai 37◦C menunjukkan 99% infektivitas setelah
tiga hari inkubasi. Ketika dipertahankan pada suhu 45 dan 50◦C untuk periode
yang sama, titer fag menurun masing-masing sebesar 15% ± 5% dan 47% ± 5%.
Ketika disimpan pada suhu 55 atau 60◦C, tidak ada fag aktif yang diamati setelah
tiga hari. Tingkat kelangsungan hidup fag adalah 100% antara 4 dan 37◦C
(Gambar3).

Gambar 3. Stabilitas fag Akh-2 pada temperatur yang berbeda. Phage Akh-2 (107 PFU /
mL) dipertahankan pada suhu yang ditunjukkan selama tiga hari, dan kemudian titer
ditentukan dengan uji plak. Hasilnya adalah rata-rata tiga ulangan dengan simpangan
baku berupa garis vertikal.

Fag dipertahankan dari pH 4 sampai 11 selama tiga hari untuk menguji

stabilitas pHnya. Penurunan signifikan pada titer fag diamati pada pH 5 dan 10
setelah tiga hari; tidak ada infektivitas fag yang diamati pada pH 4 atau 12
(Gambar4).

Gambar 4. Stabilitas fag Akh-2 pada tingkat pH yang berbeda. Phage Akh-2 (107 PFU /
mL) dipertahankan pada tingkat pH yang ditunjukkan selama tiga hari, dan kemudian
titer ditentukan dengan uji plak. Hasilnya adalah rata-rata tiga ulangan dengan simpangan
baku berupa garis vertikal.

Analisis Genomik Pengurutan Akh-2 menghasilkan total pembacaan

16.820.356 dan 1.070 Gbp dengan konten G + C 45,22%. Ukuran genom yang
ditentukan dengan perakitan de novo menggunakan Platanus adalah 114.901 bp.
Sebanyak 254 ORF dihasilkan menggunakan pencari ORF, 114 di antaranya
dikodekan oleh untai plus dan 141 dengan untai minus. Menggunakan BLAST
dan RAST, 187 ORFs diperkirakan untuk mengkode protein hipotetis, 31 untuk
mengkode tRNA, dan 36 untuk mengkode protein dengan berbagai fungsi (Tabel
S1). Sebagian besar prediksi berhubungan dengan protein struktural yang berbeda
(yaitu, serat ekor, kapsid utama, dan protein fag), ligase DNA (memperbaiki DNA
baru), dan protein yang terlibat dalam replikasi virus. hydrophila dan Aeromonas
dari famili Siphoviridae yang terdaftar oleh Bai et al. [13], fag Akh-2
menunjukkan homologi tertinggi untuk AhSzw-1, dengan identitas urutan

nukleotida keseluruhan 74% (Gambar5).

Gambar 5. Perbandingan genom fag Akh-2 dan fag A. hydrophila referensi AhSzw-1
(GenBank No. MG676225.1), dibuat menggunakan EasyFigure. Panah mewakili ORF.
Tingkat identitas ditunjukkan dengan bayangan abu-abu.

Pelindung Eff Efek dari Akh-2. Dalam uji tantangan uji dengan A.
hydrophila, loach direndam dalam larutan bakteri 1 × 106 (T1), 1 × 107 (T2), dan
1 × 108 (T3) CFU / mL selama 30 menit menunjukkan kematian 100% dalam 72,
48, dan 48 jam, masing-masing. (Gambar6).

Gambar 6. Efek protektif Akh-2 terhadap A. hydrophila di loach yang diinokulasi. Loach
yang dipotong-af direndam dalam PBS, A. hydrophila (1 × 107 CFU / mL), atau A.
hydrophila (1 × 107 CFU / mL), diikuti oleh Akh-2 (1 × 108 PFU / mL), dan tingkat
kelangsungan hidup diukur dalam 96 jam. Hasilnya adalah rata-rata dari tiga ulangan
dengan simpangan baku berupa garis vertikal (Tabel S2).
Gambar 7. Perlindungan ikan loach (M. anguillicaudatus) dari infeksi A. hydrophila oleh
bakteriofag Akh-2. (A) Kontrol negatif yang tidak terinfeksi. (B) Loach yang diinokulasi
dengan A. hydrophila menunjukkan bintik merah hemoragik. (C) Loach diobati dengan
fag Akh-2 setelah inokulasi dengan A. hydrophila menunjukkan bintik merah hemoragik
yang lebih sedikit dan lebih kecil (ditunjukkan dengan kotak merah). Ukuran ikan rata-
rata adalah 5 ± 2 cm.

Sebagian besar ikan yang bertahan hidup dalam kelompok ini tidak menunjukkan
gejala penyakit, tetapi bintik merah yang sangat kecil dapat diamati pada beberapa ikan
yang bertahan hidup dengan pemeriksaan yang cermat (Gambar7). Kelompok IV, diobati
dengan fag Akh-2 tanpa infeksi bakteri, menunjukkan kelangsungan hidup 100% tanpa
gejala, memastikan keamanan fag (data tidak ditampilkan). Pada akhir percobaan, A.
hydrophila diisolasi kembali dari ginjal ikan yang mati atau sakit, tetapi tidak dari ikan
yang masih hidup yang diobati dengan fag, mengkonfirmasikan bahwa kematian
disebabkan oleh A. hydrophila. Munculnya bakteri patogen yang resisten terhadap
antibiotik merupakan masalah yang parah dalam budidaya, terutama bila ada
sedikit pilihan pengobatan, seperti pada A. hydrophila infeksi cyprinid loach.

Dalam beberapa kasus, 50% kematian diamati bahkan dengan penggunaan

antibiotik, menunjukkan adanya strain spesies Aeromonas yang resisten terhadap
antibiotik. Bakteriofag telah digunakan untuk mengendalikan infeksi bakteri sejak
penemuannya. Efek terapeutiknya telah dikonfirmasi pada hewan, manusia,
tanaman, dan akuakultur. Beberapa penelitian telah melaporkan isolasi fag
Aeromonas dan memeriksa efek perlindungannya terhadap penyakit. Dalam
penelitian ini, kami mengisolasi bakteriofag Akh-2 yang menginfeksi A.
hydrophila (KTCT 2358) dari air laut yang dikumpulkan dari Pulau Geoje, Korea
Selatan, dan menganalisis potensinya sebagai agen terapi fag.
Di antara 60 virus yang menginfeksi spesies Aeromonas, termasuk
sembilan fag baru yang dilaporkan baru-baru ini, hanya enam yang termasuk
dalam famili Siphoviridae, dan hanya 3 (AhSzq-1, AhSzw-1, dan 4L372X) yang
menginfeksi A. hydrophila. Meskipun kemungkinan penerapan virus ini dalam
pengendalian penyakit ikan telah disarankan, namun belum diuji.
fag, inang, dan kondisi lingkungan. Periode laten yang pendek
dikombinasikan dengan ukuran ledakan yang lebih tinggi membuat Akh-2
menjadi kandidat yang cocok untuk terapi fag dan dapat digunakan dalam
kombinasi dengan fag lain sebagai kombinasi untuk efek kontrol yang lebih baik.
Banyak faktor yang dapat mempengaruhi proses normal infeksi fag, terutama
perlekatan, penetrasi, dan perkalian, tetapi suhu dan pH juga memainkan peran
penting [25]. Selama budidaya spesies ikan air hangat, kisaran suhu optimal
adalah 25 hingga 37◦C. Tingkat kelangsungan hidup fag Akh-2 adalah 100%
antara -80◦C dan 37◦C, membuatnya lebih cocok untuk pelestarian jangka panjang
dan jalur pertanian (Gambar2). Dengan tingkat kelangsungan hidup tertinggi yang
diamati pada pH 7, Akh-2 menunjukkan stabilitas yang wajar di sekitar pH netral,
yang merupakan kisaran optimal untuk budidaya ikan air hangat.
Beberapa penelitian telah melaporkan isolasi fag Aeromonas dan
penyelidikan efek perlindungannya terhadap Aeromonas salmonicida dan A.
hydrophila. Meskipun hasil penelitian ini menunjukkan efek perlindungannya
terhadap infeksi Aeromonas, tingkat perlindungannya berbeda. Metode inokulasi
bakteri dan pemberian fag, seperti injeksi intraperitonea, injeksi intramuskular,
selain air, dan memberi makan pakan yang diresapi fag, dapat mempengaruhi
tingkat perlindungan. Misalnya, dalam percobaan melawan terapi fagA.
hydrophila Pada cyprinid loach (M. anguillicaudatus). Faktor lain seperti jenis
ikan, strain bakteri, urutan inokulasi bakteri, dan pemberian fag serta kondisi
lingkungan juga dapat mempengaruhi tingkat perlindungan.
Salah satu pertimbangan dalam terapi fag adalah munculnya bakteri inang
yang resisten terhadap fag. Meskipun mekanisme pasti dari resistensi, seperti
resistensi oleh sistem CRISPR-CAS, belum ditentukan, kejadian mutan yang
resistan terhadap fag telah dilaporkan dalam terapi fag terhadap Aeromonas. Telah
disarankan bahwa resistensi fag dapat diatasi oleh fag karena ko-evolusi fag dan
inang. Selain itu, pertumbuhan lambat dari strain yang resisten terhadap fag telah
diamati, yang dapat membatasi populasi bakteri ke tingkat yang dapat dikontrol
oleh sistem imun inang. Salah satu metode yang mungkin untuk mengatasi
keberadaan atau kemunculan strain tahan fag adalah penerapan koktail fag
daripada isolat fag tunggal, seperti yang ditunjukkan oleh Chen et al. Setelah
inkubasi pada suhu 37◦C selama 24 jam, plak fag bening diambil menggunakan
ujung pipet yang dipotong steril dan disimpan pada suhu 4◦C dalam buffer 1M
SM (100 mM NaCl, 8 mM MgSO4 • 7H2O, dan 50 mM Tris-Cl (pH 7,5)).
Pemurnian fag dilakukan seperti yang dilaporkan oleh Gencay et al.
Kisaran Inang Spesifik dan Morfologi Bakteriofag, sebanyak 30 strain,
termasuk tujuh strain A. hydrophila (Tabel1), digunakan untuk tes spot untuk
mengonfirmasi kisaran inang fag. Partikel fag yang dimurnikan (109 unit
pembentuk plak [PFU] / mL) yang diawetkan dalam buffer SM diadsorpsi ke
jaringan tembaga berlapis karbon dan diwarnai negatif dengan 2% uranyl asetat.
Kurva Pertumbuhan Satu Langkah dan Analisis Stabilitas, analisis kurva
pertumbuhan satu langkah dilakukan menurut Verma et al. Dengan beberapa
modifikasi. Secara singkat, suspensi fag 11 mL (109 PFU / mL) ditambahkan ke
dalam kultur semalaman 20 mL dari bakteri inang untuk multiplisitas infeksi
(MOI) 0,001, dan campuran itu.
diinkubasi pada 37 37C selama 5 menit. Setelah sentrifugasi pada 35.000
× g selama 30 menit, supernatan dihilangkan dengan hati-hati, dan pelet
disuspensikan dalam 20 mL kaldu nutrisi. Analisis Genomik, Ekstraksi Genom
Fag untuk isolasi asam nukleat, 1 mL fag yang dimurnikan (109 PFU / mL)
dicampur dengan 0,5 µL DNase (1 U / µL) dan 1 µL RNase A (10 mg / mL) dan
diinkubasi selama 1 jam pada 37 ◦C untuk menghilangkan kontaminasi DNA
bakteri. Selanjutnya, 20 µL EDTA (0,5 M), 1,25 µL proteinase K (20 mg / mL),
dan 100 µL 10% SDS ditambahkan ke larutan fag, diikuti dengan inkubasi lebih
lanjut pada 60◦C selama 1 jam. Genom yang diperoleh dilarutkan dalam air
suling, diolah dengan DNase, RNase, dan eksonuklease II, dan dilakukan
elektroforesis pada gel agarosa untuk menentukan sifat genom.
Pengurutan, Perakitan, dan Anotasi Seluruh Genom, Pengurutan seluruh
genom dilakukan dengan menggunakan teknologi pengurutan generasi mendatang
pada pengurut Illumina Hiseq di Theragen Etex Bio Institute (Suwon, Korea
Selatan). Sampel DNA genom dari fag yang diisolasi diproses lebih lanjut untuk
persiapan perpustakaan dengan ID sampel V2 TN1809D0396. Pembacaan urutan
dirakit de novo menggunakan Platanus versi 1.2.2. Bingkai baca terbuka (ORF)
diprediksi menggunakan GeneMark.hmm, dan fungsinya dijelaskan menggunakan
server BLAST Pusat Nasional untuk Informasi Bioteknologi (NCBI) dan Anotasi
Cepat menggunakan Teknologi Subsistem (RAST) [37]. Genom Akh-2 dan
Ahszw-1 dibandingkan dengan menggunakan Easyfig [38].
Pelindung EffEfek dari Akh-2 di Ikan Loach yang Terinfeksi uji
Tantangan dan Estimasi Dosis Mematikan untuk mensimulasikan rute infeksi
yang lebih alami mirip dengan yang terjadi di lingkungan akuatik, metodologi
yang dijelaskan oleh Zhang et al. [29] diadopsi. Sebanyak 120 loach pangkas
adiposa sehat (Af-clipped) dengan berat badan rata-rata 10 g dibagikan ke dalam
empat kelompok (masing-masing kelompok terdiri dari tiga ulangan 10 ikan) di
empat tangki berukuran 30 L yang diisi dengan keran 15 L. air yang telah diangin-
anginkan semalaman yang diberi label kontrol, T1, T2, dan T3. A. hydrophila
(KCTC 2358) dikultur dalam medium NA, dipanen dengan sentrifugasi pada 3000
× g selama 20 menit, disuspensi kembali dalam larutan garam, dan dihitung
dengan pelapisan. Untuk menentukan dosis tantangan yang optimal, kelompok
T1, T2, dan T3 diinokulasi dengan konsentrasi akhir masing-masing 1 × 106, 1 ×
107, dan 1 × 108 unit pembentuk koloni (CFU) / mL. Tidak ada bakteri yang
diinokulasi pada kelompok kontrol.
Setelah 30 menit perendaman dengan perlakuan masing-masing, ikan
dipindahkan ke tangki percobaan dengan air ledeng dan diamati selama 96 jam
untuk penentuan tanda klinis dan kematian. Pengobatan Fag Ikan Yang Terinfeksi
Sebanyak 135 ekor ikan lele sehat dengan berat badan rata-rata 10 g dibagi
menjadi tiga kelompok (masing-masing terdiri dari tiga ulangan 15 ekor ikan) dan
ditempatkan di tangki berukuran 30 L berisi air 15 L. Af-clipping dan metode
perendaman yang dijelaskan di atas digunakan untuk inokulasi bakteri dan fag.
Kelompok I adalah kelompok kontrol dimana loach direndam dalam phosphate-
buffered saline (PBS) selama 30 menit. Kelompok II adalah kelompok tantangan
bakteri di mana loach direndam dalam air yang mengandung A. hydrophila
dengan konsentrasi 1 × 107 CFU / mL selama 30 menit, seperti dijelaskan di atas.
Kelompok III adalah kelompok perlakuan fag dimana loach direndam dalam air
yang mengandung A. hydrophila (1 × 107 CFU / mL) selama 30 menit, kemudian
segera direndam dalam air yang mengandung fag Akh-2 dengan konsentrasi akhir
1 × 108 PFU / mL selama 30 menit, mempertahankan MOI 10. Pada Grup IV,
loach direndam selama 30 menit dalam air yang mengandung fag Akh-2 (1,0 ×
108 PFU / mL) tanpa infeksi bakteri.