A.

PRAKTIKUM ISOLASI MIKROORGANISME

1. Tujuan :
- Dapat mengisolasi untuk mendapatkan biakan murni dari suatu campuran dengan
menggunakan cawan gores (penggoresan)
- Mengamati dan membandingkan bakteri yang timbul dari hasil isolasi
- Mengetahui cara melakukan isolasi dengan teknik cawan gores (streak plate)
2. Alat dan Bahan
a. Alat

No Nama Jumlah
1 Cawan petri 10 buah
2 Tabung reaksi 10 buah
3 Jarum Ose 1 buah
4 Erlenmeyer 1 buah
5 Gelas ukur 1 buah
6 Pengaduk 1 buah
7 Bunsen 1 buah
8 Autoklaf 1 buah
9 Magnetic stirrer 1 buah
10 Rak tabung reaksi 1 buah
11 Gelas beker 1 buah
12 Pipet tetes 4 buah
13 Timbangan analitik 1 buah
14 Hot plate 1 buah
15 Batang L 1 buah

b. Bahan

No Nama Jumlah
1 Serbuk NA Secukupnya
2 Serbuk NB Secukupnya
3 Alumunium foil Secukupnya
4 Kapas Secukupnya
5 Aquades Secukupnya
6 Karet gelang Secukupnya
7 Karet label Secukupnya
8 Alcohol 70% Secukupnya
9 Korek api Secukupnya
10 Kertas pembungkus Secukupnya
11 Plastic tahan panas Secukupnya
12 Tissue Secukupnya
13 Plastic wrap Secukupnya
 14 Sampel tanah Secukupnya

3. Cara Kerja
a. Pembuatan media Nutrient Agar
1. Menimbang NA bubuk sebanyak 3,5 gr menggunakan neraca analitis
2. Melarutkan bubuk NA dengan akuades sampai hampir memenuhi gelas beker besar
3. Menghomogenkan larutan NA dengan menggunakan magnetic stirrer
4. Memindahkan larutan NA ke dalam beberapa Erlenmeyer kemudian menutupnya
dengan kapas dan alumunium foil
5. Memasukkan Erlenmeyer tersebut ke dalam plastic tahan panas dan diikat dengan
karet gelang
6. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam.

b. Pembuatan Nutrient Broth

1. Menimbang NB bubuk sebanyak 7gr menggunakan neraca analitis
2. Melarutkan bubuk NB dengan akuades sampai hampir memenuhi gelas beker besar
3. Memindahkan larutan NB ke dalam beberapa Erlenmeyer kemudian menutupnya
dengan kapas dan alumunium foil
4. Memasukkan Erlenmeyer tersebut ke dalam plastic tahan panas dan diikat dengan
karet gelang
5. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam

c. Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah

1. Tanah seberat 1g dimasukkan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis,
selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8 (Tiga pengenceran
terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada media NA)
2. Suspensi cairan diambil sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian diteteskan di
atas permukaan agar cawan
3. Batang L atau batang drugalsky diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar
di atas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
4. Kemudian disebarkan dengan menggosokkannya pada permukaan agar supaya
tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar . Hal
yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel
mikroba dapat mati karena panas
5. Diinkubasi pada 37oC selama 124 jam. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan
tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni
yang mudah dikenali.
6. Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan
teknik streak kuadran.
 7. Diinkubasi selama 124 jam

B. PENGECATAN DIFFERENSIAL (GRAM)

1. Tujuan
- Mahasiswa dapat menunjukkan tatalaksana pengecatan differensiasi (Gram).
- Mahasiswa dapat membedakan struktur dalam bakteri, seperti dinding sel.

2. Alat dan Bahan

a. Alat

No Nama Alat Jumlah

1 Kaca benda (object glass) Secukupnya
2 Cover glass Secukupnya
3 Rak untuk pewarnaan Secukupnya
4 Bunsen/Lampu spritus Secukupnya
5 Mikroskop Secukupnya
6 Penjepit Tabung reaksi Secukupnya

b. Bahan
No Nama Bahan Jumlah
1 Biakan bakteri Secukupnya
2 Minyak emersi Secukupnya
3 Gram iodine Secukupnya
4 Crystal violet Secukupnya
 5 Methylene blue Secukupnya
6 Alkohon 96% Secukupnya

4. Cara Kerja
1. Membersihkan kaca benda dengan kertas saring dan melewatkannya di api untuk
menghilangkan kotoran dan lemak.
2. Membuat tanda lingkaran kira-kira berdiameter 2-3 cm di bagian bawah kaca benda
menggunakan pensil penanda dan beri label.
3. Membuat sediaan pada kaca benda, yaitu suspensi bakteri dipaparkan di atas kaca
benda sehingga merupakan lapisan tipis, keringkan, lalu sediaan ini direkatkan dengan
cara dilewatkan di atas nyala api dua atau tiga kali.
4. Meneteskan 2 ml crystal violet dan dibiarkan selama 1 menit.
5. Mencuci dengan air mengalir secara perlahan.
6. Meneteskan 2 ml cairan Gram’s iodine (lugol), dan dibiarkan selama 1 menit.
7. Mencuci dengan air mengalir secara perlahan.
8. Meneteskan 2 ml etil alkohol 95% beberapa detik sehingga tidak ada lagi zat warna
ungu yang mengaliri sediaan.
9. Mencuci dengan air.
10. Meneteskan 2 ml safranin selama 45 detik, mencuci dengan air dan dikeringkan di
udara.
11. Selanjutnya teteskan 1 ml minyak emersi pada sampel dan lihat di bawah mikroskop
dengan pembesaran 10 x 100.