KROMATOGRAFI KOLOM

•  Disebut juga Kromaografi Cair Prepara4f (KCP)

•  Merupakan metoda terbaik untuk memisahkan
campuran dlm jumlah besar (>1 g).
•  Pada KK, campuran yg akan dipisahkan diletakkan
berupa pita pada bagian atas kolom penjerap dalam
tabung kaca, logam atau plas4k
•  Pelarut (fase gerak ) dibiarkan mengalir melalui
kolom karena gaya gravitasi atau didorong dengan
tekanan
 Istilah Defenisi

Mobile liquid phase with no affinity to the stationary phase

Solvent
(i.e. inert towards it) & no effect on solutes.

Any liquid with more affinity to the stationary phase than

Developer the solvent but less than solutes and just capable to move
them through the column.

Any liquid that has lesser affinity to the stationary phase

Eluent
than solutes but is capable to move them out of the column.

Eluate Fraction of eluent containing a required specific substance.

(or retardation volume): Volume of mobile phase that
Retention
passes out of the column, before elution of a specific
volume (VR)
substance.
 KK KLASIK (TERBUKA)
Kolom
Karakteris4k kolom yg digunakan:
-  Netral (gelas, logam, plas4k)
-  Perbaningan panjang:diameter (10:1; 30:1 dan 100:1)
Penjerap (Adsorben)
Penjerap untuk KK harus memenuhi kriteria berikut:
1.  Bentuknya seragam
2.  Stabilitas 4nggi
3.  Tidak bereaksi secra kimia baik dg linarut ataupun
pelarut
4.  Dapat memisahkan berbagai macam senyawa
5.  Mudah didapat dan murah

Penjerap yg banyak digunakan untuk KK adalah:
1.  Silika gel atau asam silikat (SiO2)
silika gel merupakan penjerap serbaguna, dapat dipakai dgn
semua pelarut
2. Alumina
Alumina dan silika berinteraksi dengan solut dg adanya
gugus OH yg ada pada permukaannya. Molekul yg lebih
polar akan teradsorbsi lebih kuat dan dgn demikian akan
terelusi lebih lambat
Kekuatan adsorbsi solut pada permukaan adsorben mengiku4
urutan berikut:
-C=C- < O-CH3 < -COOR < >C = O < -CHO < -NH2 < -OH < -COOH
Olefins < Ethers < Esters < Lactones < Aldehydes < Amines < Phenols < Acids.


 Sta4onary Phase: Silica (SiO2)

OH
OH
OH
OH
OH Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si Si
O O
Si
Si O O O
Si O O
O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
 Sta4onary Phase: Alumina

O OH OH OH OH

Al Al Al Al Al
O O O O O O

Acidic: -Al-OH
Neutral: -Al-OH + -Al-O-
Basic: -Al-O-
Ada dua cara penyiapan kolom:
1. Cara kering
2. Cara basah
Ø  pada cara kering, penjerap dimasukkan kedalam kolom
dalam keadaan kering sedkit demi sedikit kemudian
dipadatkan memakai alat pemampat, setelah semua penjerap
dimasukkan, bagian atas penjerap diletakkan kertas saring
dan ditambahkan selapis pasir. Kemudian pelarut dibiarkan
mengalir sampai terjadi kese4mbangan. Cuplikan
ditambahkan sebagai larutan pekat atau setelah dikeringkan
bersama sedikit penjerap.
Ø  Pada cara basah, adsorben atau penjerab dibuat bubur
(lumpuran)dalam beker glass kemudian dituangkan kedalam
kolom. Keran dibuka dan pelarut dibiarkan mengalir agar
adsorben jadi padat. Harus dipas4kan bhw kolom 4dak
mengandung gelembung udara atau retak.
Memilih pelarut pengelusi
Ada 4ga pendekatan untuk memilih pelarut pengelusi:
1. Penelusuan pustaka
2. Mencoba menerapkan data KLT
3. Pemakaian elusi landaian umum
Prosedur elusi :
1. Sis4m isokra4k, cuplikan dielusi dengan satu macam
pelarut yang sama
2. Sis4m gradien, cuplikan dielusi dengan pelarut mulai
dari yg non polar-semi polar – polar
Principles of Separa4on on a column
Principles of Separa4on
Principles of Separa4on
Principles of Separa4on
Principles of Separa4on
Principles of Separa4on
Principles of Separa4on
INGAT…

•  Fase stasioner (penjerap) adalah POLAR

•  Komponen yg bersifat polar akan berinteraksi
lebih kuat dg fase stasioner atau fase diam
atau penejerab.
•  Komponen yg lebih polar akan bergerak lebih
lambat (keluar belakangan dari kolom).
•  Komponen yg non-polar akan bergerak lebih
cepat dan keluar lebih duluan dari kolom.
Mendeteksi senyawa yg telah dipisahkan:
Ø Untuk senyawa yg berwarna dapat langsung
diseteksi dg melihat kromatogram
Ø Untuk senyawa yg 4dak berwarna, dimonitor dg
lampu UV atau pereaksi penampak bercak.

Isolasi Produk (Isolat)

 Factors affecting solutes separation in CC
( Factors affecting column efficiency)
Factor Effect
Particle size of solid stationary Decrease of size improves separation (but very small
phase (or of support) particles need high pressure).
Column dimensions Efficiency increases as ratio length / width increases.
Non uniform packing results in irregular movement of
Uniformity of packing solutes through column & less uniform zone formation,
(i.e. band broadning or tailing).
Increase in column temperature results in speed of
Column temperature
elution but does not improve separation (tailing).
Solvents should be of low viscosity (to give efficient
Eluting solvent resolution) & h igh volatility (to get rapid recovery of the
substances).
Solvent flow rate Uniform & low flow rate gives better resolution.
Continuity of flow Discontinuous flow disturbs resolution
Condition of adsorbent Deactivation of adsorbent decreases separation.
Concentration of solutes Substances of high concentration move slowly.
Kromatografi kolom terbuka (klasik) mempunyai
beberapa keterbatasan:
1.  Pemisahan lambat
2.  Penjerapan linarut yg 4dak bolak balik
3.  Tidak dapat dipakai jika par4kel terlalu kecil
Untuk mengatasi kekurangan tersebut dicoba cara
pendekatan lain:
Ø  Kromatografi Cair Vakum
Ø  Kromatografi Cair Tekan
 Kromatografi Cair Vakum
•  Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan
vakum agar diperoleh kerapatan kemasan
maksimum
•  Ukuran par4kel adsorben lebih kecil dari KK gravitasi
(kualitas KLT 10-40μm)
•  Bagian atas penjerap diletakkan kertas saring.Pelarut
dg kepolaran rendah (biasanya n-heksana)
dituangkan pada permukaan penjerap lalu divakum
lagi sampai terbentuk kolom yg padat dan seragam.
•  Cuplikan dilarutkan dg sedikit pelarut yg cocok,
dimasukkan pd bagian atas kertas saring dan dihisap
perlahan lahan kedalam kemasan
•  Kolom dielusi dg pelarut, dimulai dari pelarut
yg kepolarannya rendah lalu kepolarannya
di4ngkatkan
•  Volume eluen untuk se4ap fraksi: untuk
cuplikan sampai 5 g (25 mL), untuk cuplikan
10-30 g (50 mL).
•  Se4ap fraksi yg keluar ditampung dalam labu
penampung dan dimonitor dg KLT untuk
mengetahui pemisahan telah terjadi
4-Vacuum Columns [Vacuum liquid chromatography (VLC)]:


Pada umumnya KCV digunakan untuk pemisahan
pendahuluan, diperoleh fraksi2 yg masih
mengandung beberapa komponen tetapi sebagian
pengotor telah dihilangkan.
Keuntungan Kromatografi Cair Vakum:
1.  Cepat
2.  Murah
3.  Cuplikan yg dipisah dapat lebih banyak
KROMATOGRAFI CAIR TEKAN PREPARATIF

Ø Adalah metoda kromatografi yg meyangkut

penggunaan tekanan pada kolom
Mencakup:
Ø  Kromatografi Cair Kilat ( sekitar 2 bar/30psi)
Ø KC tekanan rendah (5 bar/75 psi)
Ø KC tekanan menengah (5-20 bar/75-300 psi)
Ø KC Tekanan 4nggi (>20 bar)
•  Kromatografi biasa sering 4dak cukup efisien untuk
memisahkan senyawa yg struktur kimianya
berdekatan
•  Kee_e4fan kromatografi cair tekan didasarkan pada
kecepatan dan daya pisah
•  Pada penggunaan tekanan pada KK dapat terjadi hal
berikut:
Ø kecepatan aliran eluen lebih cepat, pemisahan
lebih cepat
Ø Dapat digunakan pengemas yg lebih halus, jadi
dapat membei resolusi 4nggi
Ø Karna waktu elusi yg pendek, mengurangi
dekomposisi syw yg peka
KOLOM
•  Bagian paling pen4ng dari KCTP adalah kolom
•  Ukuran kolom bergantung pada jumlah cuplikan yg akan
dipisahkan dan beban cuplikan

Pemisahan Φ 2 mm Φ 8 mm Φ 23 mm
Sukar (α<1,2) 1 mg 20 mg 100 mg
Tidak dapat membebani
kolom berlebihan
Mudah (α>1,2) 10-50 mg 200-1000 1-5 g
Dapat membebani kolom mg
berlebihan
•  Parameter kolom lain yg pen4ng untuk pemisahan adalah
•  Penjerap (sifat dan ukuran par4kel penjerap)
•  Wadah (panjang kolom, diameter kolom, bahan kolom)

Adsorben (fase diam)

•  Ukuran op4mum par4kel agar pemisahan efisien adalah
sekitar 20μg.
•  Memperkecil ukuran par4kel berar4 meningkatkan efisiensi
pemisahan tapi pada saat yg sama menimbulkan kesulitan
pengemasan-----tekanan kerja harus lebih 4nggi----biaya
besar
Kromatografi Kilat (Flash chromatography)

Kromatografi kilat sangat sederhana

Dan mudah dilakukan serta
lebih ekonomis,dipublikasikan
th 1978 dan dipatenkan th 1981
•  Pada kromatografi kilat, pelarut pengelusi didorong
dg cepat (dgn tekanan gas, biasanya nitogen) melalui
katup pada kolom
•  Ukuran par4kel adsorben lebih kecil dari KK klasik
(40-60μm)
•  Kolom dilengkapi dg sistem katup jarum dan
pengendali aliran, tekanan dapat diperoleh dari pipa
udara atau tangki gas nitrogen
•  Ukuran kolom bergantung pada jumlah cuplikan yg
akan dipisahkan, yg umum berkisar pada diameter
3-10 cm dan panjang 7-15 cm

•  Kolom kaca yg panjangnya sesuai, diisi secara kering
atau lumpuran dg adsorben yg cocok.
•  Harus disediakan ruang yg cukup diatas penjerap
agar dapat diisi pengelusi secara berulang ulang
•  Cuplikan dimasukkan ke kolom dan kolom ditutup dg
penutup yg dilengkapi lubang masukan udara dan
katup untuk mengendalikan pasokan udara
bertekanan. Dengan cara ini dapat dicapai tekanan 1
bar diatas tekanan atmosfer untuk mengelusi
cuplikan.
•  Jumlah cuplikan 0,01-10,0 g dapat dipisahkan dalam
waktu 15 menit
 Kromatografi Cair Tekanan Rendah (KCTR)
•  Kolom prakemas telah tersedia dg berbagai fase diam
dan dapat digunakan ulang
•  Ukuran par4kel 40-60μm , untuk silika KLt, kolom disebut
kolom lobar
•  Pemasukan cuplikan dg penyun4kan
•  Pompa harus dapat memberi tekanan sampai 6 bar, bila
diperlukan resolusi lebih 4nggi, kolom lobar
digandengkan
•  Eluen umumnya isokra4k
•  Cuplikan dipisahkan 4dak lebih dari 5 g
•  Aplikasi: pemisahan flavon glikosida, re4noid, kumarin,
hidrokuinon, pep4da.
 Kromatografi Cair Tekanan Medium
(MPLC)
•  Beban yg dipisah dapat lebih 4nggi dari KCTR
•  KCTM menggunakan kolom lebih panjang dan diameter lebih
lebar dari KCTR serta tekanan yg lebih besar
•  Memberi resolusi 4nggi dan waktu pemisahan lebih pendek
•  Adsorben/penyangga silika gel dapat diregenerasi setelah
bbrp kali pakai
•  Daya pisah KCTM jauh lebih baik dari KK terbuka dan flash KK
serta kapasitas bebannya 4nggi
•  Pengemasan kolom bisa kering atau basah, tapi pengemasan
kering menghasilkan kerapatankemasan > 20% daripada cara
lumpuran.
•  Pemantauan eluat dg KLT
Kromatografi Cair Tekanan Tinggi (KCKT)
•  KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas
(KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek
pemisahan yang sama baiknya. Bila deriva4sasi diperlukan
dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang 4dak dideriva4sasi
masih dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada
pemanasan atau 4dak menguap, KCKT adalah pilihan utama.
•  Keunggulan metoda ini dibanding metoda pemisahan lainnya
terletak pada ketepatan analisis dan kepekaan yang 4nggi
serta cocok untuk memisahka senyawa-senyawa nonvola4le
yang 4dak tahan pada pemanasan.
•  Di samping itu, kinerja 4ngginya dalam analisis didukung
dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan
4nggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem
kromatografinya.