KROMATOGRAFI

LAPIS TIPIS (KLT)

•  Kromatografi lapis .pis (KLT) adalah metoda
kromatografi cair yg paling sederhana
•  Pemisahan senyawa organik, organik
sinte.k,komplek organik-anorganik bahkan ion
anorganik dapat dilakukan dlm waktu singkat
KLT dipakai untuk dua tujuan:
1.  Untuk tujuan kualita.f (iden.fikasi), kuan.ta.f
(penetapan kadar) atau prepara.f (pemisahan)
sebagaimana layaknya metode kromatografi
2.  Untuk menjajaki pelarut atau sistem penyangga yg
akan dipakai dalam kromatografi kolom atau KCKT
Pada hakikatnya KLT melibatkan dua perubah:
1.  Sifat fasa diam atau sifat lapisan. Fase diam dapat
berupa serbuk halus yg berfungsi sebagai permukaan
penjerap atau berfungsi sebagai penyangga pada
lapisan zat cair. Fase diam pada KLT sering disebut
penjerab. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai
sebagai penjerap pada KLT. Empat penjerap yg paling
umum dipakai adalah :
- silika gel (asam silikat)
- alumina (aluminium oksida)
- kiselgur (tanah diatomae)
- selulosa
2. Sifat fasa gerak atau campuran pelarut pengembang
Parameter pada KLT
Garis depan
(batas atas) = B

Rf = jarak yg ditempuh bercak = A

jarak yg ditempuh pelarut B
A

Titik awal
(batas bawah)
 2.0 cm
Rf (A) = = 0.40
5.0 cm
Solvent Front

Rf (B) = 3.0 cm = 0.60

5.0 cm
Distance solvent
migrated = 5.0 cm
4.0 cm
Distance A
migrated = 3.0 cm Rf (C) = 0.8 cm = 0.16
5.0 cm

Distance B
migrated = 2.0 cm 3.0 cm Rf (D) = 4.0 cm = 0.80
5.0 cm
Distance C
migrated = 0.8 cm
0.8 cm
Rf (U1) = 3.0 cm = 0.60
Origen
x x x x x 5.0 cm
A B U C D
0.8 cm
Rf (U2) = = 0.16
5.0 cm
Persamaan Van Deemter pada TLC

•  Tinggi plat (H) dalam TLC adalah harga rata2.

•  Nilai H sangat bergantung pada Rf
•  Pada TLC kapiler, H meningkat dengan meningkatnya konstanta
difusi zat dan waktu pegembangan
•  Nilai H meningkat dengan meningkatnya ketebalan plat (2% antara
0,1 dan 0,4 mm)
Cara Penilaian KLT
•  Resolusi
Rs = (A1—A2)
2 (σ1 -σ2)
•  Separation Number (Bil Pemisahan) atau Kapasitas
Bercak (SN)
adalah jumlah bercak yang dapat dipisahkan antara Rf =
0 dan Rf = 1 dengan resolusi 4 σ.
SN adalah jumlah maksimum komponen sampel yang
dapat dipisahkan oleh sistem. Angka Pemisahan tidak
dipengaruhi oleh Rf
Harga Rf menyatakan harga numerik mengenai posisi
bercak dalam kromatogram dan tidak menyatakan
kondisi2 yang membatasi Rf itu
Harga Rf dapat digunakan untuk tujuan identifikasi suatu
senyawa dengan membandingkannya terhadap
senyawa standar.
Nilai Rf bukanlah konstanta fisika dan perbandingan
senyawa yg diidentifikasi dan senyawa standar harus
dilakukan pada pelat yg sama dan dikembangkan pada
waktu yg sama.
Jika dua senyawa menunjukkan harga Rf yg sama
kemungkinan senyawa itu identik, sebaliknya jika harga
Rf berbeda berarti tidak identik
TLC Sorbent calssification

classifica6on General Class Typical representa6ves

Sorbent
I Polar inorganic (hydrophilic) Silica, alumina, magnesia
II Non-polar inorganic Graphite, charcoal
III Polar bonded phases Aminopropyl, cyanopropyl
IV Non-polar bonded phases C18 bonded phases
V Polar organic Celllulose, chi.ne, polyamida
Solvent
N Non polar, moderatly polar Heptane(,01), butyl chloride (0,26),
benzene (0,32), CHCl3 (0,4)

P Non-amproteric polar Methyl ethyl ketone (0,51),
tetrahydrofuran (0,57), ethylacetate
(0,58), acetonitril (0,71)

AB Ampgoteric polar N-propanol (0,82)methanol (0,95),
water
Silika Gel, merupakan penjerap yg paling banyak yg
digunakan dalam KLT dan KCKT. Karena sebagian
besar silika gel bersifat sedikit asam, maka asam
sering agak mudah dipisahkan untuk meminimalkan
reaksi asam basa antara penjerap dan senyawa yg
akan dipisahkan
Silika dibuat melalui polimeriasi spontan dan dehidasi
larutan asam silikat yang dibuat dengan
penambahan asam kedalam larutan Na silikat.
Secara kimia permukaan silika mengandung gugus
siloksan (Si-O-Si) atau gugus silanol bebas (-Si(OH)-
Si(OH)-
Alumina, bersifat sedikit basa dan sering dipakai untuk
pemisahan basa untuk meminimumkan reaksi asam basa.
Alumina dipersiapkan melalui penghilangan air dari alumina
hidroksida hidrat. Fariasi bentuk kristal alfa, beta, gamma
oksida, tegantung dari material awal dan proses dehidrasi.
Kieselgur dan selulosa, merupakan bahan penyangga lapisan zat
cair. Penjerap ini sering dipakai untuk memisahkan senyawa
polar seper. asam amino, karbohidrat atau nukle.da
Kieselgure atau tanah diatomae adalah asam silikat alam
berpori.
•  Ada atau .daknya air dalam penjerap atau
penyangga sangat pen.ng. Silika atau alumina yg
dipakai pada KLT harus mengandung sesedikit
mungkin air oleh karena itu pelat harus diak.^an dg
pemanasan 110oC selama 1-3 jam sebelum
digunakan.
•  Sebaliknya selulosa atau kiselgur yg akan digunakan
pada KCC harus mengandung lapisan zat cair
•  Untuk melekat dan mengikatkan lapisan .pis
penjerap pada pelat digunakan pengikat kalsium
sulfat anhidrat 10-15% atau pa. 3%
•  Optimasi Solvent dan selektifias
•  Untuk meningkatkan resolusi, lebih baik meingkatkan selektifitas
daripada efsiensi pemisahan. Oleh karena itu solven sebagai alat
untuk memodifikasi selektifitas, memainkan peranan penting dalam
kolom dan TLC
•  Selektifitas pelarut dapat dtingkatkan dengan mengganti suatu
pelarut yang kekuatannya sama dengan pelarut lain .
•  Bila pelarut murni digunakan dalam range Rf yang cocok gagal
memisahkan senyawa yang berdekatan, biasanya digunakan
campuran berbagai pelarut untuk meningkatkan selektifitas. Untuk
campuran sampel seederhana biasanya sovent biner sangat
berguna tapi jika lebih omplek dapat digunakan ternery atau
kuaterner solvent.
•  Perubahan solvent dapat mengakibatkan perubahan ikatan
hidrogen antara solut dan solvent dan biasanya mengakibatkan
perubahan selektifitas
Langkah langkah teknis dalam KLT
1.  Membuat pelat
2.  Menotolkan cuplikan
§  Campuran yg akan dipisahkan harus dilarutkan dlm
pelarut yg atsiri (mudah menguap)
§  Cuplikan harus ditotolkan sekecil mungkin (dapat
menggunakan pipa kapiler)
§  Cuplikan harus ditotolkan 8-10 mm dari ujung pelat
atau kaca,
§  sebelum dikembangkan,
pelarut cuplikan harus benar
benar hilang agar pita cuplikan
.dak melebar
3. Memilih pelarut pengembang
•  pelarut untuk KLT dapat dipilih berdasarkan acuan pusatka
atau dapat juga dipilih berdasarkan coba coba.
4. Mengembangkan lapisan pada pelat atau kaca
•  Lapisan yg sudah ditotoli cuplikan dikembangkan dalam
sebuah bejana kromatografi yg berisi pelarut pengembang
yg sudah dipilih sebelumnya
•  Tinggi pelarut dalam bejana .dak boleh melebih garis dasar
penotolan cuplikan
•  Sebelum proses pengembangan, bejana harus dijenuhkan dg
pelarut yaitu dg meletakkan selembar kertas saring pada
salah satu dinding bejana atau menutup bejana beberapa
menit sebelum pengambangan dilakukan

•  Pengembangan dilakukan sampai pelarut mencapai batas
atas, kemudian pleat diangkat dan dikeringkan
•  Jika bercak mempunyai Rf yg kecil dari 0,5 dapat dilakukan
kromatografi kembali setelah pelat dikeringkan.
5. Deteksi/visualisasi hasil pemisahan
•  Jika senyawa yg dipisahkan berwarna, pola bercak mudah
dilihat tetapi bila senyawa tak berwarna, pola bercak harus
dilihat dengan pereaksi penampak bercak atau bantuan
lampu UV
•  Dragendorrf : untuk alkaloid
•  FeCL3 : untuk fenol
•  2,4-dinitrofenilhidrazin : untuk aldehid dan keton
Untuk memperbaiki pemisahan bercak dg jarak Rf yg berdekatan
dapat dilakukan:
•  Pengembangan berganda, bertujuan untuk memperbaiki dua
bercak yang saling tumpang .ndih atau kepolrannya
berdekatan. Pada cara ini plat dikembangkan satu kali,
diangkat lalu dikeringkan dan dikembangkan kembali dengan
pelarut yg sama
•  Pengembangan dua arah, cara ini memungkinkan pemakaian
lapisan penjerap untuk memisahkan campuan yg
mengandung banyak kompnen.Pada cara ini, cuplikan
ditotolkan pada satu sudut pelat yg berbentuk bujursangkar
dan dikembangkan dg satu sistem pelarut sampai batas atas,
lalu pelat diangkat dan dikeringkan. Selanjutnya pelat diputar
90o lalu dikembangkan dg sistem pelarut kedua.
 One compound

.
Two closely related compounds
.
5. Mengumpulkan hasil pemisahan
•  pelat yg sudah dideteksi dg penampak noda dapat
dikerok lalu dilarutkan dalam pelarut yg cocok
untuk mengeskstraksi senyawa hasil pemisahan.
Kemudian pelarut diuapkan untuk mendapatkan
senyawa yg terpisah.
•  Jika fraksi yg terpisah belum murni, dapat dilakukan
kromatografi ulang

 Gangguan pada KLT

•  Tailing pada TLC:

Dlm bbrp kasus spot yg
diperoleh 6dak berbentuk
bulat tapi terbentuk ekor
atau nosa spt comet yg
terjadi karna overlap spot
spot atau resolusi yg 6dak Tailed or comet like spot

bagus.
Solusi untuk masalah tailing:
1.  Karakter asam atau basa analit jika dipisahkan pada
kondisi netral.
Solusi : tambahkan asam atau basa kedalam sis.m
pengembang.
2.  Aplikas jumlah analit yg berlebihan
Solusi : mengurangi konsentrasi analit.
3. Kesalahan dalam pemilihan sis.m solvent
Solusi : merubah sis.m solvent.
•  Pencampuran Pelarut yang berbeda. Jika dua pelarut
berbeda dicampur untuk memperoleh sis.m elarut, sis.m ini
dapat memisah pada lapisan, membentuk dua lapisan garis
depan pelarut, bukan satu. Karena itu hanya pelarut yang
sifatnya hampir sama saya yang dapat dicampur.
•  Garis depan tak mendatar
Gais depan yang .dak datar disebabkan oleh ke.dakjenuhan
bejana atau suhu yang .dak sama pada lapisan. Bejana harus
dijenuhkan dan usahan agar .dak ditempatkan di tempat
yang beraliran udara.
 KROMATOGRAFI KERTAS (KKt)
•  Pada in.nya .dak berbeda dng KLT karna KKt adalah KLT pada
lapisan .pis kertas atau selulosa.
•  Metode ini merupakan metode KCC dgn fase diam cair,
biasanya air berada dalam serabut kertas, ( kertas saring
Whatman no 1)
•  Prinsip dasar kromatografi kertas adalah par.si mul.plika.f
suatu senyawa antara dua cairan yang saling .dak bercampur.
Jadi par.si suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air
dan fasa mobil yang melewa.nya berupa pelarut organik yang
sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.
Tahap tahap yg dilakukan pada KKT sama dengan tahap pada
KLT par.si
•  Pengembangan dapat dilakukan dengan cara menaik atau
menurun
•  Tahap tahap yg dilakukan pada KKT sama dengan tahap pada
KLT par.si
•  Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran
yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang
diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan
meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering,
kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan
satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup
dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan
sampai noda tercelup karena berar. senyawa yang akan
dipisahkan akan terlarut dari kertas).

•  Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan
menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan
jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah
bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang
telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari
permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan
kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat
sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa .dak berwarna
harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan
menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah
warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila
daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu
mengiden.fikasi .ap individu dari senyawa. Metoda iden.fikasi
yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda
rela.f terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.



 Tape – Label with marker

Pencil

Filter Paper

Ink
Mark
Kromatografi lapis .pis klasik mempunyai beberapa
kekurangan:
1. pengambilan senyawa dari pelat dan
pengekstraksian dari penjerap
2. memerlukan jangka waktu yg lama untuk pemisahan
3. kemungkinan adanya pencemar setelah
pengekstraksian pita yg mengandung senyawa yg
dipisahkan
Untuk mengatasi masalah itu dicoba pendekatan yg
melibatkan kromatografi sentrifugal
 KROMATOGRAFI SENTRIFUGAL (KROMATOTRON)

•  Pada prinsipnya kromatografi sentrifugal adalah

kromatografi klasik dengan aliran fase gerak yg
dipercepat oleh gaya sentrifugal.
•  Pelat berupa kaca Φ 24 cm yg dilapisi penjerap yg
cocok (silika dan alumina)
•  Pemasukan cuplikan diiku. dengan pengelusian pita
pita komponen baru lingkaran sepusat. Pada tepi
pelat pita pita terputar keluar dan ditampung dgn
tabung. Fraksi eluat yg diperoleh dianalisis dg KLT
•  Proses isolasi yang terjadi berdasarkan adsorpsi dan par.si.
•  Adsorpsi adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah
disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap .ap-.ap
komponen kimia .dak sama.
•  Sedangkan par.si adalah kelarutan .ap-.ap komponen kimia
dalam cairan pengelusi (eluen) .dak sama dimana arah
gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga
komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang
berbeda-beda yang menyebabkan terjadi pemisahan.
Kelebihan dan kekurangan kromatotron :
Kelebihan:
•  Cara kerjanya sederhana
•  Cepat-biasanya pemisahan selesai 30 menit
•  Tidak perlu mengerok pita
•  Pemakaian pelarut .dak boros
•  Rotor yg sudah dilapisi dapat diregenerasi
•  Pencemar yg terekstraksi lebih sedikit dibanding KLT prepara.f
•  Penotolan cuplikan mudah
•  Dapat dilakukan pengembangan landaian bertahap
•  Kemungkinan oksidasi senyawa yg peka lebih kecil daripada KLT
prepara.f
•  Perolehan kembali senyawa yg dipisah lebih besar dari KLT
prepara.f
Kekurangan
•  Fase diam yg dapat dipilih terbatas
•  Rotor yg sudah dilapisi .dak ada dalam
perdangangan
•  Daya pisahnya terbatas
•  Cara pendeteksian terbatas
•  Sistem pengumpul mungkin tercemari