PENENTUAN KADAR TRIGLISERIDA, HDL DAN LDL DALAM SAMPEL

DARAH

Nama : Sarah Tazkira

NIM : 20231010
Kelas : A
Asisten : Pipit Noviandri

I. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk menentukan:
1. Kadar trigliserida dalam darah dengan metode GPO-PAP
2. Kadar HDL Kolesterol dalam darah dengan metode CHOD-PAP
3. Kadar LDL Kolesterol dalam darah

II. Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini adalah mikropipet, sentrifuge, kuvet,
spektrofotometer dan alat gelas. Bahan yang digunakan pada penentuan trigliserida adalah
larutan reagen trigliserida, larutan standar trigliserida 200 Mg/dL dan sampel darah.
Reagen GPO-PAP terdiri dari :
1. Good’s buffer pH 7,2 dengan konsentrasi 50 mmol/L
2. 4-Chlorophenol dengan konsentrasi 4 mmol/L
3. ATP dengan konsentrasi 2 mmol/L
4. M𝑔2+ dengan konsentrasi 15 mmol/L
5. Glycerokinase dengan konsentrasi ≥ 4 𝑘𝑈/𝐿
6. Peroxidase dengan konsentrasi ≥ 2 𝑘𝑈/𝐿
7. Lipoprotein lipase dengan konsentrasi ≥ 4 𝑘𝑈/𝐿
8. 4-Aminoantipyrine dengan konsentrasi 0,5 mmol/L
9. Glycerol-3-phosphate-oxidase dengan konsentrasi ≥ 1,5 𝑘𝑈/𝐿
Bahan yang digunakan pada penentuan HDL Kolesterol adalah larutan reagen
Kolesterol, larutan
presipitasi dan larutan standar HDL 200 Mg/dL dan sampel darah. Reagen PEG/CHOD-
PAP terdiri dari :
1. phosphototungstic dengan konsentrasi 1,4 mmol/L
2. magnesium chloride dengan konsentrasi 8,6 mmol/L
III. Cara Kerja
a. Pengambilan sampel darah
Torniket dipasang pada lengan atas untuk membantu melihat pembuluh vena.Darah
diambil sebanyak ±2 𝑚𝐿. Torniket dilepaskan, kemudian kapas ditempelkan ditempat
penyuntikan lalu jarum suntik dicabut.Sampel yang diperoleh disentrifugasi selama 15
menit dengan kecepatan 1500 rpm hasilnya terbentuk dua lapisan pada sampel.Pada
lapisan atas yang berwarna kekuningan adalah plasma darah.

b. Penentuan kadar trigliserida dalam darah dengan metode GPO-PAP

Sampel darah dipersiapkan terlebih dahulu ± 2 mL, kemudian sampel disentrifuge.
Plasma darah yang dihasilkan dipipet sebanyak 0,010 mL menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam kuvet yang telah disiapkan, dengan ketentuan sebagai berikut :
Tabel 1. Jumlah blanko, standar, sampel dan reagen yang
digunakan untuk penentuan TG
Kuvet Blanko Standar Sampel
(μL) (μL) (μL)
Darah - - 10
Larutan standar - 10 -
Akuades 10 - -
Reagen 1000 1000 1000

Ketiga larutan dalam kuvet diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37⁰C atau 15 menit
pada suhu 25oC. Absorbansi sampel, blanko, dan standar reagen diukur pada panjang
gelombang 505 nm (Hg 546 nm) dalam 60 menit.

c. Penentuan kadar HDL Kolesterol dalam darah dengan metode PEG/CHOD-PAP

Sampel darah dipersiapkan terlebih dahulu ± 0,1 mL, kemudian sampel ditambahkan
0,1 mL reagen presipitasi dan campuran disentrifug pada 2500 – 3000 rpm selama 5
menit. Plasma darah yang dihasilkan dipipet sebanyak 0,050 mL menggunakan
mikropipet dan dimasukkan ke dalam kuvet yang telah disiapkan, dengan ketentuan
sebagai berikut:
 Tabel 2. Jumlah blanko, standar, sampel dan reagen yang
digunakan HDL Kolesterol
Kuvet Blanko Standar Sampel
(μL) (μL) (μL)
Darah - - 50
Larutan standar - 50 -
Akuades 50 - -
Reagen 1000 1000 1000

Ketiga larutan dalam kuvet diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37⁰C atau 15 menit
pada suhu 25oC. Absorbansi sampel, blanko, dan standar reagen diukur pada panjang
gelombang 505 nm (Hg 546 nm) dalam 60 menit.

IV. Hasil dan Pembahasan

a. Penentuan Trigliserida
Trigliserida merupakan senyawa yang terdiri dari gliserol dan asam lemak dimana
dalam darah merupakan jenis lemak non kolesterol. Penentuan trigliserida dalam
serum/plasma dapat menggunakan reaksi enzimatik dengan prinsip metode
penentuan trigliserida setelah pemisahan enzimatik dengan lipoprotein lipase.
Indikatornya adalah quinoneimine yang dihasilkan dari 4- aminoantipyrine dan 4-
chlorophenol oleh hidrogen peroksida dipengaruhi reaksi katalitik peroksidase.
Tahapanreaksi penentuan ini ada 3 tahap yaitu:
1. Reaksi hidrolisis TG
Triglycerides → Glycerol + fatty acid

2. Reaksi oksidasi gliserol

Glycerol + ATP → glycerol-3-phosphate + ADP

Glycerol-3-phosphate + O2 → Dihydroxyaceton phosphate +H2O2

3. Reaksi pembentukan kompleks berwarna

2 H2O2 + Aminoantiphyrine + 4-Chlorophenol → Quinoneimine + HCl + 4H2O

 Tabel 3. Tahapan penambahan reagen pada penentuan
TG
No Tahapan prosedur Pengamatan
1 Penambahan reagen Warna larutan menjadi kuning
2 Inkubasi pada suhu Penggunaan suhu 37oC karena proses enzimatik akan
37oC optimal pada suhu tubuh
selama 5 menit
3 Panjang gelombang Dibaca pada 505 nm
4 Blanko Fungsi penggunaan larutan blangko adalah untuk
menentukan Panjang gelombang maksimum
5 Pembacaan Pembacaan harus sesegera mungkin dilakukan karena
absorbans sampel reagen tidak stabil sehingg auntuk menjaga kualitas
i maksimal 60 menit sampel maka pembacaan tidak boleh lebih 60 menit jika
setelah sampel tidak disimpan di lemari pendingin
Inkubasi

Tabel 4. Hasil pengukuran spektrofotometri pada

penentuan TG
No Keterangan A1 A2 A3 A rata-rata Konsentrasi
1 Standar 0,671 0,671 0,671 0,670 0,6706
2 Sampel 1 0,267 0,267 0,267 0,267 0,267
3 Sampel 2 0,411 0,411 0,411 0,411 0,411

𝑚
𝑚

 Sampel 1

C sampel 1 = ( )

C sampel 1 =

 Sampel 2

C sampel 2 =

C sampel 2 =
Hasil analisis menunjukkan bahwa level TG dalam darah normal jika dibandingkan
dengan nilai ekspektasi TG pada orang dewasa adalah < 150 mg/L. Beberapa interferen
pada pemeriksaan ini adalah:
1. Ikterik: bila kada bilirubin terkonjugasi 16 mg/dL, bilirubin tidak terkonjugasi
14mg/dL.
2. Hemolisis bila konsentrasi haemoglobin 700 mg/dL.
3. Lipemi berhubungan dengan trigliserida.
4. Intosikasi asetaminofen menyebabkan hasil rendah palsu.

b. Penentuan HDL Kolesterol

HDL merupakan bagian dari komponen lipoprotein yang HDL disebut juga α-
lipoprotein adalah lipoprotein terkecil yang berdiameter 8-11 nm, namun
mempunyai berat jenis terbesar dengan inti lipid terkecil.20 Unsur lipid yang paling
dominan dalam HDL ialah kolesterol dan fosfolipid. Komponen HDL adalah 20%
kolesterol, Penentuan HDL kolesterol dalam darah dapat dilakukan dengan metode
enzimatik PEG/CHOD-PAP yang memiliki prinsip metode Chylomicrons,VLDL
dan LDL diendapkan dengan menambahkan asam fosfotungstat dan ion magnesium
ke sampel. Sentrifugasi hanya menyisakan HDL dalam supernatan yang
konsentrasinya yang ditentukan secara enzimatis dengan menggunakan DiaSys FS
Kolesterol.Tahapan reaksi pada penentuan ini ada 4 tahapan yaitu :
1. Reaksi blocking ApoB
Enzimatik homogen
2. Reaksi hidrolisis HDL kolesterol ester

HDL-C + O2 → ∆4-cholestenone + H2O2

3. Reaksi oksidasi enzimatik

HDL-C ester + H2O → HDL-C + RCOOH

4. Pembentukan kompleks berwarna

2H2O2 + 4-aminoantiphyrine + HSDA + H+ → pigmen biru ungu + 4H2O

 Tabel 5. Tahapan penambahan reagen pada penentuan HDL Chol
No Tahapan prosedur Pengamatan
1 Presipitasi Warna larutan menjadi kekuningan
Reagen + presipitan
2 Penambahan reagen Serum mengalami presipitasi menjadi jernih sehingga
Reagen + serum pengukuran absorbansi dapat dilakukan dengan tepat.
3 Penambahan reagen Warna larutan menjadi biru ungu
CHOD-
PAP
4 Inkubasi pada suhu Penggunaan suhu 37oC karena proses enzimatik akan
37oC optimalpada suhu tubuh.
selama 5 menit
5 Panjang gelombang Dibaca pada 505 nm
6 Blanko Fungsi penggunaan larutan blangko adalah untuk
menentukan Panjang gelombang maksimum
7 Pembawaan absorbansi Pembacaan harus sesegera mungkin dilakukan karena
maksimal 60 menit setelah sampel reagen tidak stabil sehingga untuk menjaga kualitas
inkubasi sampel maka pembacaan tidak boleh lebih 60 menit jika
sampel tidak disimpan di lemari pendingin.

Tabel 6. Hasil pengukuran spektrofotometri pada penentuan HDL Chol

No Keterangan A1 A2 A3 A rata-rata Konsentrasi
1 Standar 0,825 0,826 0,826 0,826 0,8256
2 Sampel 1 0,463 0,463 0,463 0,463 0,463
3 Sampel 2 0,508 0,502 0,508 0,508 0,506

𝑚 = ……..
 Sampel 1
C sampel 1 =
 Sampel 2
C sampel 2 =
 Hasil analisis menunjukkan bahwa level HDL Chol dalam darah tinggi dibandingkan dengan
nilai ekspektasi HDL Chol pada orang dewasa adalah < 40 mg/dL. Beberapa interferen pada
pemeriksaan ini adalah:
1. Gangguan fungsi hati → gangguan metabolisme lipid → negative bias pada HDL.
2. Hemolisis, icterus, lipemia tidak berpengaruh
3. Peningkatan asam lemak bebas dan protein terdenaturasi, peningkatan immunoglobulin
→peningkatan palsu

c. Penentuan LDL Kolesterol

Pemeriksaan LDL Chol dilakukan dengan metode tidak langsung menggunakan data
konsentrasi kolesterol total, TG dan HDL Chol. Formula yang digunakan adalah formula
Fridewald :
𝐿 𝐿 𝑚 ( ) 𝑘 ( ) 𝑘 𝐿

𝑚𝑔 𝑚𝑔
𝐿 𝐿 𝑚 ( ) ( ) ( ) 𝑚𝑔

𝑚𝑔 𝑚𝑔
𝐿 𝐿 𝑚 ( ) ( ) ( ) 𝑚𝑔

LDL rerata = 133,6722 mg/dL

Hasil analisis menunjukkan bahwa sampel mengandung LDL Chol sebesar 133,6722
mg/dL dibandingkan dengan LDL Chol orang dewasa adalah < 100 mg/L. Nilai TG/5
mengekspresikan nilai lipoprotein melebihi nilai optimum Secara umum, kadar LDL Chol
direpresentasikan sebagai penyebab utama penyakit jantung coroner.
V. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang berjudul “Penentuan Kadar Trigliserida, HDL Dan LDL Dalam
Sampel Darah” dapat disimpulkan bahwa :
1. Hasil yang didapat pada penentuan trigliserida pada sampel 1 sebesar
mg/dL,sedangkan pada sampel 2 sebesar mg/dL.
2. Hasil yang didapat pada penentuan HDL, sampel 1 sebesar mg/dL, Sedangkan
pada sampel 2 sebesar mg/dL. Hal ini menunjukan bahwa level HDL Chol dalam
darah cukup tinggi karena Dibandingkan dengan nilai ekspektasi HDL Chol pada orang
dewasa < 40 mg/dL.
3. Hasil yang didapat dari penentuan LDL kolestrol sebesar 133,6722 mg/dL. Hal ini
menunjukan LDL Chol tidak baik jika dibandingkan dengan LDL orang dewasa yaitu < 100
mg/dL. Hal tersebut dapat beresiko menyebabkan penyakit jantung coroner.

VI. Daftar Pustaka

Hardisari, R., & Koiriyah, B. (2016). Gambaran Kadar Trigliserida (Metode Gpo-Pap) Pada
Sampel Serum dan Plasma EDTA. Jurnal Teknologi Laboratorium, 5(1), 27-31.

Kurniawati, Puji. Tatang Shabur J. 2019. Buku Panduan Praktikum Biokimia. Yogyakarta:
Universitas Islam Indonesia

Zuhroiyyah, S. F., Sukandar, H., & Sastradinanja, S. B. (2017). Hubungan aktivitas fisik
dengan kadar kolesterol total, kolesterol low-density lipoprotein, dan kolesterol high-density
lipoprotein pada masyarakat Jatinangor. Jurnal Sistem Kesehatan, 2(3).