UJIAN PENGEMBANGAN OBAT

Judul Artikel Isolation and characterization of bacteriophages active against

methicillinresistant Staphylococcus pseudintermedius
Pengarang Arshnee Moodleya , Witold Kotb , Sofia Nälgårda , Dziuginta
Jakociunea , Horst Nevec , Lars Hestbjerg Hansenb , Luca
Guardabassia , Finn K. Vogensen
Nama Jurnal Research in Veterinary Science
Volume, issue, tahun, Volume 122, tahun 2019, halaman 81-85
halaman, nomor doi https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2018.11.008
Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi
bakteriofag (fag) dengan aktivitas preferensi terhadap Staphylococcus
pseudintermedius (MRSP) yang resisten methicillinresistant (MRSP),
patogen kanine yang resistan terhadap berbagai obat.
Material (bahan) Lima belas MRSP (ST71, n = 7; ST68, n = 5; ST lainnya, n = 3) dan 43
S. pseudintermedius (MSSP) yang rentan terhadap methicillin diisolasi
dari spesimen klinis anjing di Italia, Swedia, Belanda, Denmark, AS,
Kanada, dan Hong Kong. Strain dipilih berdasarkan apa yang tersedia
di waktu penelitian dan untuk mewakili garis keturunan klon MRSP
dominan menyebabkan infeksi. Singleton MRSP ST71 yang berasal
dari manusia dan sapi juga dimasukkan untuk melihat apakah fag akan
memiliki efek litik, yang berpotensi dapat digunakan untuk
dekontaminasi pembawa MRSP manusia atau untuk mengobati mastitis
bovine. Untuk mengevaluasi rentang inang fag yang lebih luas,
staphylococci non S. pseudintermedius berikut digunakan: S. aureus
yang resisten methicillin FPR3757 (USA300, ST8) dan PM84
(EMRSA-15, ST22), yang mewakili dua klon MRSA paling umum
yang diisolasi dari anjing; S. schleiferi subsp. koagulan (n = 1), S.
schleiferi subsp. schleiferi (n = 1) yang diketahui menyebabkan infeksi
kulit pada anjing, dan S. epidermidis (n = 1), S. warneri (n = 1), dan S.
haemolyticus (n = 1), yang diisolasi dari swap hidung anjing Semua
strain yang digunakan dalam penelitian ini tercantum pada Tabel 1.
Prosedur A. Isolasi bakteriofag
1. Kotoran segar diperoleh dari sepuluh anjing dengan penyakit
yang tidak diketahui . 10 gram tinja dihomogenisasi selama 3 menit
dengan 90 mL 0,25 mol L-1 NaCl ditambah dengan 3,6 mmol L-1
CaCl2 (akhir konsentrasi).
2. Campuran ini disentrifugasi pada 4000 g selama 10 menit, dan
supernatan digunakan untuk mendeteksi keberadaan fag dengan
melihat 3 μL supernatan yang tidak diencerkan pada agar berlapis
ganda; lapisan bawah yang terdiri dari Tryptic Soy Broth (TSB, Oxoid)
ditambah dengan agarose 0,8% (Invitrogen Ultrapure agarose) dan
konsentrasi akhir 0,5 mmol L-1 CaCl2 dan lapisan atas yang
mengandung TSB ditambah dengan agarose 0,4%, konsentrasi akhir
0,5 mmol L −1 CaCl2 dan 100 μL biakan semalam dari 11 MRSP
berbeda (ST71, n = 6 dan ST68, n = 5).
3. Fag yang diisolasi pada E045 dan E133 dari sampel feses 1, 5-
7, yang memiliki titer fag tertinggi (> 105 PFU mL − 1) ditetapkan
vB_SpsS-SN7–13 dan dipilih untuk karakterisasi lebih lanjut.

B. Pemurnian bakteriofag, perbanyakan skala besar, dan

kisaran inang
1. Dua strain MRSP ST71 (E133 dan E029) digunakan untuk fag
propagasi dan pemurnian.
2. Fage dimurnikan dengan minimum empat siklus isolasi plak
tunggal.
3. Propagasi skala besar dan CsClsentrifugasi gradien, Untuk
memeriksa khasiat lisis mereka dan kisaran inang,
4. 3 μL filter yang disterilkan (0,45 μM filter) tidak dilarutkan
supernatan dilakukan pada agar berlapis ganda yang mengandung strain
stafilokokus yang berbeda (Tabel S1), dan kemampuan pembentukan
plak dari fag diperiksa setelah inkubasi semalam. Khusus untuk kisaran
inang dengan staphylococci non S. pseudintermedius, tiga konsentrasi
fag yang berbeda (103 , 106 , dan 109 PFU mL – 1 ) telah dipakai untuk
membedakan antara lisis sejati dan lisis dari luar.
C. Konfirmasi aktivitas litik fag
1. Fag diperbanyak dan aktivitas litik mereka diuji pada E133
(MRSP, ST71, t06) dan E140 (MRSP, ST71, t02).
2. Lima puluh mikroliter dari tiga berbeda konsentrasi fag (109) ,
107 dan 105 PFU mL − 1) tercoret secara vertikal dalam satu baris ke
bawah agar Kedelai Tryptic (TSA, Oxoid) agar suplemen piring dengan
5 mmol L − 1 CaCl2 (konsentrasi akhir). Menggunakan sebuah usap
kapas steril, masing-masing kultur bakteri (disesuaikan dengan 108
CFU mL − 1) melesat secara horizontal melintasi garis fage.
3. inkubasi semalaman pada suhu 37 ° C, persimpangan fag-
bakteri diperiksa zona bening tanpa pertumbuhan bakteri, menunjukkan
lisis fage dari tesregangan. Plak ini diisolasi dan fag dimurnikan untuk
WGS.

D. Efisiensi pemasangan fag vB_SpsS-SN8 pada S.

pseudintermedius E133 dan E140
1. vB_SpsS-SN8 secara serial diencerkan dan dianyam secara
terpisah pada E133 dan E140. Dari setiap lempeng agar, satu plak
terisolasi tunggal dipilih dan fag tersebar dalam 300 μL SEM buffer,
2. setelah itu 100 μL dari fag difusi digunakan untuk propagasi
skala kecil pada E133 dan E140 dalam 10 mL TSB yang mengandung
5 mmol L-1 CaCl2 (konsentrasi akhir).
3. Setelah menghilangkan strain inang dengan penyaringan
melalui filter 0,45 μM, lisat fag secara serial diencerkan dan dianyam
pada E133 dan E140 untuk menentukan PFU mL − 1

E. Mikroskop elektron transmisi

1. Fag yang dimurnikan didialisis dengan buffer SM sebelum
negatif pewarnaan.
2. Sebuah film karbon diapungkan dari lembaran mika ke setetes
fag yang dihubungi,
3. dicuci dalam dH2O, dan diwarnai dengan 2% uranyl asetat.
4. Film bernoda diambil pada 400 grid tembaga mesh dan
diperiksa dalam TEM pada 80 kV pada 210000 × dan 165.000 ×

F. Isolasi DNA, pencernaan pembatasan fag DNA dan WGS

Fase yang dimurnikan (vB_SpsS-SN8, vB_SpsS-SN10, vB_SpsS-
SN11, dan vB_SpsS-SN13) diurutkan termasuk fag yang diisolasi dari
uji litik konfirmasi sebelum dan setelah propagasi pada E133 dan E140.
Selain itu, galur S. pseudintermedius E133 yang disebarkan diurutkan.
S. pseudintermedius E140 sebelumnya telah diurutkan Secara singkat,
1. DNA fag diekstraksi menggunakan protokol yang.
2. Penangguhan fag dialisis tiga kali (dua kali selama satu jam dan
sekali semalam) dalam buffer dialisis yang mengandung konsentrasi
akhir 10 mmol L − 1 NaCl, 10 mmol L − 1 CaCl2, 10 mmol L − 1
MgCl2, 50 mmol L − 1 Tris- HCl pH 8.0.
3. DNA fag diisolasi menggunakan fenolkloroform-isoamil
alkohol (25: 24: 1), dan diendapkan menggunakan 3 mol L – 1 natrium
asetat dan etanol 96%.
4. Pelet fag DNA dicuci dengan 70% etanol dan diresuspensi
dalam buffer TE. DNA bakteri adalah diisolasi dari biakan semalam
menggunakan darah DNeasy dan Tissue kit (Qiagen) sesuai dengan
instruksi pabrik.
5. DNA fag dicerna dengan batasan endonuklease berikut: EcoRI,
EcoRV, Sau3AI dan HaeIII (New England Biolabs). Perpustakaan
 pengurutan DNA (fag dan bakteri) disiapkan menggunakan kit DNA
Nextera® XT (Illumina) sesuai dengan protokol pabrikan. Secara
individual perpustakaan yang ditandai diurutkan pada platform MiSeq
sebagai 2 × 250bp bacaan berpasangan berakhir.
6. Bacaan dipangkas (batas kualitas = 0,03) dan berkumpul
(ukuran kata = 64, ukuran gelembung otomatis, dengan perancah)
menggunakan CLC Genomic Workbench 6.0.4 (CLCbio, Aarhus,
Denmark).
7. Contigs diperiksa secara manual dan dijelaskan menggunakan
RAST pipa (Aziz et al., 2008). The Resfinder v.2.1 dan Virulence finder
v.1.5 jalur pipa digunakan untuk mencari urutan fag untuk keberadaan
dikenal virulensi yang diperoleh dan gen resistensi antibiotik.
8. Untuk mendeteksi keberadaan CRISPR, tiga alat bioinformatika
berbeda digunakan; Pengakuan CRISPR Tool (Bland et al., 2007),
CRISPRdetect (Biswas et al., 2016) dan Pencari CRISPR (Grissa et al.,
2007).

G. Nomor aksesi nukleotida

Urutan genom fag disimpan di NCBI dengan berikut ini
nomor aksesi: vB_SpsS-SN8 (MF428481); vB_SpsS-SN10
(MF428480); vB_SpsS-SN11 (MF428479); vB_SpsS-SN13
(MF428478).

Hasil dan Fag diisolasi dari semua 10 sampel tinja dengan melihat menyaring
Pembahasan homogenat pada pilihan 11 jenis MRSP milik ST71 dan ST68. Tujuh
sampel feses dengan titer fag tinggi (> 105 PFU / mL) dipilih untuk
analisis lebih lanjut, yang mengarah ke isolasi satu fag per sampel
(vB_SpsS-SN7–13). Berdasarkan transmisi elektron mikroskopi
(TEM), semua fag memiliki morfologi yang sama dan milik keluarga
Siphoviridae. Fag memiliki ekor panjang non-kontraktil ~ Panjang 180
nm dan lebar ~ 11 nm, pelat dasar yang menonjol dan kepala
icosahedral berdiameter ~ 60 nm (Gbr. 1)
 Analisis RFLP menunjukkan bahwa semua fag terkait erat
dengan perbedaan pita minor (data tidak ditampilkan). Empat fase
menampilkan pola RFLP unik (vB_SpsS-SN8, vB_SpsS-SN10,
vB_SpsS-SN11, dan vB_SpsS-SN13) dipilih untuk pengujian kisaran
inang dan sekuensing seluruh genom (WGS).
Rentang inang fag dipilih menggunakan koleksi 17 MRSP dan
43 galur MSSP. Keempat fase ditampilkan Spektrum inang yang sedikit
berbeda tetapi semuanya mampu menghasilkan plak yang jelas pada
masing-masing strain MRSP yang diuji. Pola lisis variabel diamati di
antara MSSP, dengan fag hanya mampu menghasilkan plak yang jelas
pada 16–28% isolat (Tabel S1). Aktivitas litik preferensial mereka
terhadap MRSP adalah properti yang menguntungkan untuk
pengobatan fag infeksi MRSP karena mengurangi dampak pada strain
MSSP komensal yang menjajah sabar. Selain S. pseudintermedius,
keempat fag terinfeksi dan Lysed dua strain S. schleiferi, sedangkan
mereka tidak memiliki infektivitas litik terhadap spesies stafilokokus
lainnya yang diuji, yaitu S. aureus, S. epidermidis, S. warneri, dan S.
haemolyticus.
Data ini menunjukkan bahwa empat fag dapat digunakan untuk
mengobati S. pseudintermedius dan S. infeksi schleiferi. Spesies yang
terakhir terdiri dari dua subspesies, subsp. schleiferi dan subsp.
koagulan, yang dibedakan dengan koagulase menguji dan pertama kali
dijelaskan pada manusia dan anjing, masing-masing Kedua subspesies
adalah anjing patogen yang terkait dengan infeksi kulit dan telinga, dan
sering ditampilkan resistensi antibiotik, termasuk resistensi metisilin
 Keempat fag memiliki genom DNA dengan ukuran mulai dari
39,8 hingga 40,5 kb, menyandikan 69–71 CDS, dan memiliki konten G
+ C% yang serupa dari 35,8%. Genom fag diijinkan secara siklis
menunjukkan mekanisme pengemasan DNA headful menjadi kapsid
virus. Semua fag mirip satu sama lain (93,8-99,7% identitas
nukleotida), dan menunjukkan kesamaan tinggi dengan S. aureus phage
187 (Nomor aksesi AY954948); 87% identitas nukleotida dalam 50%
genom tempat modul pengemasan dan morfogenesis
Berdasarkan WGS, semua fag berisi modul lysogeny yang
menyarankan bahwa Fag beriklim sedang umumnya tidak dianggap
cocok untuk digunakan dalam terapi fag karena mereka dapat memulai
siklus lisogenik dan karenanya bukan bakterisida. Selain itu, mereka
dapat mentransfer gen yang meningkatkan virulensi bakteri yang
terinfeksi, yang mengarah ke fenomena yang dikenal sebagai konversi
lisogenik.
Fag yang diteliti tampaknya tidak mengandung faktor virulensi
yang diketahui atau gen resistensi antibiotik berdasarkan inspeksi
manual anotasi genom RAST dan hasil dari jalur pipa bioinformatika
Penemu dan Virulensi. Namun, fag mengandung sejumlah protein
hipotetis dengan fungsi yang tidak diketahui. Apakah protein hipotesis
ini memberi keuntungan selektif pada bakteri inang tidak diketahui.
Untuk menghilangkan siklus lisogenik, vir mutan dapat dipilih
dengan mutasi spontan atau melalui modifikasi genetik. Penghapusan
gen atau mutasi terkait lysogeny yang secara negatif mempengaruhi
ekspresi penekan fag cI atau di situs pengikat penekan telah terbukti
menghancurkan siklus hidup lisogenik dan mencegah integrasi ke
dalam genom.
Fag sedang berperilaku sebagai fag litik bahkan pada lisogen.
Setelah pengujian konfirmasi litik tambahan, kami mengamati bahwa
semua fag mampu menghasilkan plak yang jelas pada dua galur MRSP
yang diuji (E133 dan E140), meskipun galur bakteri itu sendiri
mengandung ramalan yang hampir sama atau hampir identik dengan
vB_SpsS-SN8-13.
 Berdasarkan perbandingan seluruh genom dari fag yang
diperbanyak pada strain bakteri E133 dan E140 dan profag serupa yang
terdapat pada E133 dan E140, kami mengamati perbedaan dalam modul
lysogeny mereka (Gbr. 2).

Fag yang terisolasi berbagi tingkat kemiripan yang tinggi

dengan profag dari E140 (94.1–97.1%, Gambar. 2) termasuk modul
lysogeny. Namun, fag yang menyerang E140 memiliki modul lisogen
yang berbeda yang identik dengan modul yang ada dalam profag dalam
strain E133 (Gbr. 2), sehingga memungkinkan fag ini untuk mengatasi
kekebalan E140 yang disediakan oleh protein penekan fag cI.
Rekombinasi antara menginfeksi fag sedang dan profag telah dijelaskan
dalam Lactococcus lactis dan E. Coli
Ketika fag vB_SpsS-SN8 diperbanyak pada strain host bakteri
E133 dan E140 dalam kombinasi yang berbeda (misalnya dimurnikan
pertama kali pada E133 dan kemudian diperbanyak pada E133 atau
E140) dalam semua kasus menghasilkan titer fag lebih rendah pada
E140 daripada pada E133 (Tabel 2), menunjukkan bahwa E140
memiliki mekanisme resistensi fag tidak hadir di E133.
Sebagai titer fag tinggi yang tidak terlihat setelah melewati S.
pseudintermedius E140 saja, menunjukkan bahwa E140 memiliki
sistem infeksi yang gagal atau sistem CRISPR / Cas. Tidak ada CRISPR
yang ditemukan di S. pseudintermedius E140 oleh dalam analisis silico,
sedangkan strain memendam tujuh sistem racun / antitoksin yang
diduga, yang merupakan salah satu mekanisme untuk menengahi
infeksi abortif. Penelitian ini memberikan wawasan tentang keragaman
genetik dan biologi fag lisogenik pada S. pseudintermedius.
 Selain itu, ini memberikan dasar untuk studi di masa depan
untuk menciptakan vir mutan yang bisa menjadi alternatif untuk terapi
antibiotik sistemik atau topikal konvensional. Pendekatan alternatif ini
akan berguna untuk manajemen MRSP infeksi kulit dan luka karena
terbatasnya pilihan terapeutik yang tersedia terhadap bakteri yang
resistan terhadap beberapa jenis obat dan kemampuan untuk
menerapkan fag langsung ke lokasi infeksi

Kesimpulan E140 memiliki sistem infeksi yang gagal atau sistem CRISPR / Cas.
Tidak ada CRISPR yang ditemukan di S. pseudintermedius E140 oleh
dalam analisis silico, sedangkan strain memendam tujuh sistem racun /
antitoksin yang diduga, yang merupakan salah satu mekanisme untuk
menengahi infeksi abortif
Keunggulan Fag sedang berperilaku sebagai fag litik bahkan pada lisogen. Setelah
pengujian konfirmasi litik tambahan, diamati bahwa semua fag mampu
menghasilkan plak yang jelas pada dua galur MRSP yang diuji (E133
dan E140), meskipun galur bakteri itu sendiri mengandung ramalan
yang hampir sama atau hampir identik dengan vB_SpsS-SN8-13.
Kekurangan Fag yang diteliti tampaknya tidak mengandung faktor virulensi
(drawbacks) yang diketahui atau gen resistensi antibiotik berdasarkan inspeksi
manual anotasi genom RAST dan hasil dari jalur pipa bioinformatika
Penemu dan Virulensi.
Dalam penelitian ini fag mengandung sejumlah protein hipotetis
dengan fungsi yang tidak diketahui. Apakah protein hipotesis ini
memberi keuntungan selektif pada bakteri inang tidak diketahui
sehingga tidak dapat diketahui fungsi secara selektif terhadap
keuntungan pada bakteri inang
Saran Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kandungan protein
yang terkandung dala fag sehingga dapat mengetahui keuntungan
secara selektifnya.