LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DAN BIOTEKNOLOGI TANAH

(TSL 641)

Bakteri Penambat Nitrogen Bebas (Azotobacter) dan

Cendawan Penghasil Antibiotik (Penicillium)

KELOMPOK III :
Deni Pratama (A154130141)
Herlina Puji Cahya Lestari (A154130081)
Ricky Trinanda (A154130021)
Winda Ika Susanti (A154130091)

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI TANAH DAN LINGKUNGAN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR ISI .................................................................................................... ii
DAFTAR TABEL ............................................................................................ iii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... iv
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... v

I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ............................................................................... 1
1.2. Rumusan Masalah .......................................................................... 2
1.3. Tujuan ............................................................................................ 3

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Morfologi dan Fisiologi Azotobacter ............................................. 3
2.2. Keunggulan Bakteri Azotobacter ................................................... 3
2.3. Pemanfaatan Azotobacter di Bidang Pertanian .............................. 5
2.4. Penicillium dan Kemampuannya dalam Menghasilkan
Zat Antimikroba ............................................................................. 5

III. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. Tempat dan Waktu ......................................................................... 7
3.2. Alat dan Bahan ............................................................................... 7
3.3. Pelaksanaan Praktikum .................................................................. 7

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil ............................................................................................... 11
4.2. Pembahasan .................................................................................... 16

V. SIMPULAN
5.1. Simpulan ........................................................................................ 19

DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

ii
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

DAFTAR TABEL

Halaman
1. Jumlah kloni Azotobacter sp. pada masing – masing
sampel tanah dari rizosfer alang – alang .................................................... 11
2. Uji Patogenitas Azotobacter pada tanaman tembakau ............................... 12
3. Pertumbuhan benih padi yang diinokulasikan Azotobacter sp.
dan yang tidak diinokulasikan Azotobacter sp. ......................................... 13
4. Daya hambat Penicillium digitatum ........................................................... 16

iii
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1. Koloni Azotobacter sp. pada media NFM .................................................. 11
2. Grafik Pertumbuhan Azotobacter sp. ......................................................... 12
3. Grafik Pertumbuhan Tinggi kecambah Padi .............................................. 14
4. Grafik Pertumbuhan Panjang akar Padi ..................................................... 14
5. Koloni Penicillium digitatum ..................................................................... 15
6. Zona bening yang dihasilkan ..................................................................... 16
7. a) Pengambilan tanah dari rhizosfer alang – alang,
b) sampel tanah dari lahan pertanian,
c) sampel tanah dari lahan disekitar hutan ................................................. 23

8. a) Suspensi tanah yang dishaker,

b) Pengenceran sampel tanah (metode pengenceran),
c) Penuangan media tumbuh (metode tuang),
d) perhitungan jumlah koloni bakteri Azotobacter .................................... 24

9. a) Penicillium digitatum, b) Azotobacter sp. ............................................. 25

10. Kenampakan Mikroskopis, a) Azotobacter sp.,

b) Penicillium digitatum ............................................................................ 25

11. a) Injeksi isolat Azotobacter sp. pada daun tembakau,

b) hasil injeksi Azotobacter sp. yang berasal dari tanah
disekitar hutan pada daun tembakau umur 0 hari,
c) hasil injeksi Azotobacter sp. yang berasal dari tanah pertanian
pada daun tembakau umur 0 hari ............................................................... 26

12. a) Injeksi isolat Azotobacter sp. pada daun tembakau,

b) hasil injeksi Azotobacter sp. yang berasal dari tanah
disekitar hutan pada daun tembakau umur 3 hari setelah aplikasi,
c) hasil injeksi Azotobacter sp. yang berasal dari tanah pertanian
pada daun tembakau umur 3 hari setelah aplikasi ...................................... 26

13. Pengaruh Azotobacter sp. terhadap perkecambahan benih

kacang hijau umur 5 hari setelah perkecambahan...................................... 27

iv
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1. Sampel Tanah yang akan Diisolasi ............................................................ 23
2. Teknik Isolasi Azotobacter dan Penicillium .............................................. 24
3. Penicillium dan Azotobacter yang berhasil dikulturkan ............................ 25
4. Penampakan Mikroskopis Azotobacter dan Penicillium digitatum
pada Pembesaran 1000x ............................................................................. 25

5. Aplikasi Azotobacter sp. pada daun tembakau untuk uji patogenitas ........ 26

6. Perkecambahan benih kacang hijau umur 5 hari setelah perkecambahan . 27

v
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Tanah merupakan faktor lingkungan yang penting, sebab selain

mempunyai hubungan timbal balik dengan tanaman yang tumbuh di
atasnya, tanah juga memiliki hubungan timbal balik dengan mikroba tanah
yang ada di dalamnya. Tanah umumnya mengandung berbagai unsur hara
yang diperlukan oleh tanaman, tetapi kandungan hara pada lahan pertanian
semakin lama semakin berkurang karena terserap oleh tanaman untuk
memenuhi kebutuhan pertumbuhannya (Sutejo et al. 1991 dalam Mujiyati
dan Supriyadi 2009)
Tanah berperanan dalam siklus mineral terutama siklus nitrogen,
fosfor, sulfur dan siklus karbon. Bakteri yang berperanan dalam siklus
nitrogen salah satunya adalah Azotobacter. Bakteri ini bersifat non-
simbiosis yang mampu mengikat Nitrogen bebas dari udara dan hidup di
daerah rizhospere yang bersifat heterotrofik. Bakteri ini berfungsi sebagai
pengikat N2 bebas yang mempunyai pengaruh terhadap sifat fisik dan
kimia tanah sehingga mampu meningkatkan kesuburan tanah. Populasi
bakteri nitrifikasi dalam tanah akan mempengaruhi rasio konsentrasi
nitrogen dalam tanah, sehingga populasi mikroba merupakan indikator
tingkat kesuburan tanah (Allen dan Allen 1981).
Azotobacter merupakan bakteri yang berman faat bagi tanaman
karena berdasarkan penelitian Wedhastri (2002) menyebutkan bahwa
beberapa strain hasil isolasi dan seleksi mikroba penambat N non
simbiotik yaitu Azotobacter pada tanah masam, yang merupakan spesies
A. chroococcum mempunyai kemampuan dalam menambat nitrogen dari
udara, dan juga sebagai penghasil zat pengatur tumbuh.
Terlepas dari bakteri Azotobacter yang dapat menabat nitrogen
bebas dari udara dan dapat menghasilkan ZPT, mikroba penghasil
antibiotik juga perlu mendapat perhatian untuk dikembangkan. Salah satu
mikroba yang dapat menghasilkan antibiotik adalah cendawan dari genus
Penicillium.

1
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Telah diketahui bahwa cendawan Penicillium adalah cendawan

yang dapat menghasilkan zat antibiotic yang dinamai penisilin.
Penicillium dapat menghasilkan zat antibiotik yang dapat menghambat
pertumbuhan mikroba kain. Cendawan Penicillium ini telah banyak
digunakan dalam bidang pertanian khususnya sebagai agen hayati untuk
menghambat pertumbuhan patogen padaa tanaman.
Penelitian Soenartiningsih (2010) membuktikan bahwa cendawan
dari genus Penicillium dapat menghambat Perkembangan Cendawan
Rhizoctonia solani pada Jagung Secara Invitro. Selain itu, penelitian yang
dilakukan oleh Hardaningsih (2011) menyebutkan bahwa cendawan dari
genus Penicillium juga mampu menghambat pertumbuhan dari cendawan
pathogen Sclerotium rolfsii.
Adanya potensi mikroba tanah yang berguna seperti bakteri
penambat nitrogen bebas dari udara yaitu Azotobacter, dan cendawan
pnghasil antibiotic yaitu Penicillium. Diperlukanlah usaha untuk
mengembangkan dan mengetahui lebih lanjut sifat dari mikroba tersebut
untuk dapat lebih mengoptimalkan manfaat dari mikroba tersebut.

1.2. Rumusan Masalah

1. Bagaimanakah teknik isolasi Azotobacter di Laboratorium ?
2. Apa pengaruh pemberian inokulasi Azotobacter terhadap
perkecambahan benih kacang hijau ?
3. Bagaimanakah teknik isolasi Penicillium di Laboratorium ?
4. Bagaimana pengaruh Penicillium sebagai agen antimikroba dalam
menghambat pertumbuhan mikroba lain ?

1.3. Tujuan
1. Mengetahui teknik isolasi Azotobacter di Laboratorium.
2. Mengetahui pengaruh pemberian inokulasi Azotobacter terhadap
perkecambahan benih kacang hijau.
3. Mengetahui teknik isolasi Penicillium di Laboratorium.
4. Mengetahui pengaruh Penicillium sebagai agen antimikroba dalam
menghambat pertumbuhan mikroba lain.

2
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Morfologi dan Fisiologi Azotobacter

Azotobacter sp. merupakan bakteri non-simbiotik yang rmasuk
dalam famili Azotobacteriaceae. Yang paling banyak diketahu adalah
bakteri Azotobacter terdiri dari empat spesies, yaitu A. crhoococcum, A.
beijerinkii, A. vinelandii dan A. paspali (Hamdi 1982).
Azotobacter dicirikan dengan sel berbentuk batang, gram negatif,
bersifat aerobik obligat dan mempunyai ukuran sel yang lepih panjang dari
prokariot lainnya dengan diameter sel 2 – 4 μm atau lebih. Beberapa strain
motil dengan flagel peritrikha. Pada media yang mengandung karbohidrat,
bekteri ini membentuk kapsul yang berfungsi melindunginya dari
lingkungan luar. Selain itu bakteri ini juga memiliki struktur khusus yang
disebut kista. Kista ini bersifat seperti endospora, yakni tubuh berdinding
tebal, sangat reaktif dan resisten, tahan terhadap proses pengeringan,
pemecahan mekanik, ultraviolet dan radiasi ionik (Brock et al. 1994 dalam
Nurhayati 2006).
Suhu optimum bagi pertumbuhan Azotobacter chroococum adalah
300C, jumlahnya dapat mencapai beberapa ratus per g-tanah. Walaupun
penyebaran populasi bakteri ini tidak begitu luas, namun spesies ini
merupakan kontributor penting bagi penambatan nitrogen. A. beijerinckii
lebih dominan pada tanah masam, dengan pH di bawah 3,0. Penyebaran
spesies ini cukup luas, banyak ditemukan di tanah tropik bahkan juga
ditemukan pada daerah tempera dan antartik. Demikian pula Derxia
gummosa yang banyak ditemukan di wilayah tropis Amerika Utara,
mampu tumbuh dengan baik pada pH 4,5 - 6,5 (Tate 2000).

2.2. Keunggulan Bakteri Azotobacter

Genus Azotobacter tumbuh dengan baik pada kondisi NH3 juga

pada berbagai jenis media seperti karbohidrat, alkohol dan asam organik.
Azotobacter bersifat aerob obligat, namun enzim nitrogenasenya sangat
sensitif terhadap O2 sama seperti nitrogenase lainnya, oleh kerena itu

3
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Azotobacter melakukan respirasi tingngi untuk melindungi nitrogenase

dari O2 sehingga konsentrasi O2 intraseluler pada Azotobacter relatif lebih
sedikit (Brock et al. 1994 dalam Nurhayati 2006).
Selain itu Brock et al. (1994) dalam Nurhayati 2006 kembali
mengemukakan bahwa Azotobacter chroococum mampu tumbuh dan
mereduksi N2 tanpa kehadiran molibdenum yang berfungsi dalam
pembentukan nitrogenase. Jika bakteri ini ditempatkan pada media yang
kekurangan amonia dan molibdenum tetapi mengandung logam vanadium,
maka bakteri ini akan menghasilkan vanadium nitrogenase menggantikan
posisi molibdenum yang berfungsi menstimulasi pengikatan nitrogen.
Seperti pada enzim molibdenum, vanadium nitrogenase juga terdiri dari
dua protein, pertama protein yang mengandung besi, kedua protein yang
mengandung besi dan vanadium yang dapat mereduksi N2 menjadi NH3,
H+ menjadi H2 dan H2C2 menjadi C2H4. Namun kemampuan reduksi
vanadium nitrogenase lebih lambat bila dibanding enzim molibdenum.
Salisbury dan Ross (1995) menyebutkan bahwa penambatan
nitrogen adalah reaksi reduksi N2 menjadi NH4+, dan diketahu sejauh ini
bahwa reaksi ini hanya dapat dilakukan oleh mikroorganisme prokariot.
Reaksi keseluruhan penambatan N adalah sebagai berikut:
N2 + 8e + 16ATP + H2O → 2NH3 + H2 + 16ATP + 16pi + 8H
Rao (1994) juga menambahkan bahwa dalam reaksi ini juga
diperlukan enzim nitrogenase yang berfungsi sebagai katalisator.
Nitrogenase terdiri dari dua protein, yakni protein Fe dan protein Fe-Mo.
Protein Fe mempunyai 4 atom besi di kelompok Fe4S4 , sedangkan protein
Fe-Mo mengandung 2 atom molybdenum dan 28 atom besi.
Selain dapat menambat nitrogen bebas dari udara, Azotobacter juga
dapat menghasilkan Zat Pengatur Tumbuh (ZPT). Penelitian Xenia (2010)
membuktikan bahwa Azotobacter mampu menghasilkan zat pengatur
tumbuh berupa asam indol asetat (AIA), sitokinin, giberelin dan
melarutkan fosfat.

4
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

2.3. Pemanfaatan Azotobacter di Bidang Pertanian

Kemampuan Azotobacter dalam menambat nitrogen bebas dari

udara dimanfaatkan manusia dibidang pertanian dengan cara membuat
pupuk hayati (Biofertilizer) yang agen hayati didalamnya adalah
Azotobacter. Penelitian yang dilakukan oleh Hamastuti et al. (2012)
mengemukakan bahwa mikroorganisme Azotobacter chroococcum yang
dibuat menjadi pupuk hayati dapat meningkatkan kadar nitrogen hingga
500% dan juga meningkatkan pertumbuhan tinggi tanaman terong 12,2%
dan cabai 21,6% serta kapasitas panen terong 44,2 gram/tanaman dan
cabai 11 gram/tanaman.

2.4. Penicillium dan Kemampuannya dalam Menghasilkan Zat

Antimikroba
Cendawan Penicillium masuk dalam kelompok Deuteromycetes
dan masuk pada kelas Trichocomaceae. Penicillium merupakan fungi
imperfect atau tidak sempurna karena tidak memiliki fase seksual yang
jelas. Morfologi khas dari kelas ini adalah struktur reproduksi berupa
konidia. Penicillium banyak terdapat ditanah, dan beberapa terdapat di
berbagai medium seperti makanan, tumbuhan, dan minuman.
Deuteromycetes dapat tumbuh secara optimum pada suhu 29 – 320C
(Alexopoulos dan Mims 1979).
Cendawan Penicillium memiliki ciri-ciri morfologi yang terbentuk
pada media ADK memiliki warna koloni hijau, teksturnya seperti bulu,
konidia hijau, jarak antar fialid cukup rapat, berbentuk seperti botol
dengan konidium di ujung-ujungnya, konidofor besekat.
Keistimewaan dari cendawan Penicillium ini adalah
kemampuannya dalam menghasilkan zat antimikroba. Penelitian Prihanto
(2012) membuktikan bahwa cendawan Penicillium notatum dapat
menghasilkan zat antibakteri dan menghambat pertumbuhan E. Coli dan S.
aureus. Selain kemampuan Penicillium dalam menghasilkan zat
antimikroba dibuktikan dari penelitian Arisanti et al. (2012) yang

5
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

menyebutkan bahwa cendawan Penicilliun yaitu spesies mampu

menghambat pertumbuhan bakteri E. coli dan B. subtilis.
Penicillium mampu menghasilkan antibiotik yang dinamai
penisilin yang dapat menghambat sintesis peptidoglycaan dinding sel
bakteri (Deacon, 2006; Cole dan Schweikert, 2003). Penisilin menghambat
sintesis dinding sel bakteri dengan cara menghambat sintesis enzim atau
inaktivasi enzim untuk mensintesis peptidoglycan yang merupakan
komponen penting dinding sel bakteri. Terhambatnya sintesis
peptidoglycan menyebabkan hilangnya viabilitas dan sering menyebabkan
sel bakteri lisis (Suwandi, 1992).
Makut dan Owolewa (2011) juga menyatakan bahwa Penicillium
sp. menghasilkan senyawa antimikroba griseofulvin yang bersifat
menghambat pertumbuhan fungi, diperkuat dengan pendapat dari
Panda et al. (2005) yang menyebutkan penghambatan pertumbuhan fungi
dilakukan oleh cendawan Penicillium dengan cara mengganggu fungsi
benang spindel dan mikrotubulus sitoplasma, sehingga menghambat
mitosis sel fungi.

6
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

III. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. Tempat dan Waktu

Pelaksanaan praktikum Mikrobiologi dan Bioteknologi Tanah
dilakukan di Laboratorium Biologi Tanah Departemen ITSL IPB Pada
bulan Oktober 2013 s/d Januari 2014. Pengambilan sampel tanah
dilakukan di dua lokasi yaitu tanah dilahan pertanian disekitar daerah
Babakan Lebak, Bogor dan tanah disekitar hutan di lingkungan
Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan untuk praktikum Mikrobiologi dan
Bioteknologi Tanah adalah cangkul, timbangan analitik, Laminar Air Flow
(LAF), autoclave, incubator, tabung reaksi dan rak tabung reaksi, pipet
ukur 1 ml, cawan petri, erlenmeyer 250 ml, spatula, alat suntik 1 ml, jarum
ose, bunsen, pinset, centrifuge, Sepektrofotometer Uv-visible, dan kuvet.
Bahan yang digunakan adalah sampel tanah (tanah disekitar hutan
dan tanah pertanian), Media Martin Agar (Rose Bengal), Media
Azotobacter (Nitrogen Free Medium) , akuades steril, alkohol 90 %, kertas
saring, tissue, kertas label, dan plastic..

3.3. Pelaksanaan Praktikum

3.3.1. Pengambilan Sampel Tanah
Pengambilan sampel tanah dilakukan dengan mengambil
tanah didaerah rizosfir tanaman alang – alang baik di lokasi tanah
dilahan pertanian maupun di lokasi sekitar hutan Fakultas
Kehutanan IPB. Cara pengambilan sampel tanah yaitu dengan
mencabut tanaman secara langsung atau menggunakan alat bantu
sekop, kemudian tanah yang melekat di perkaran tanaman diambil
lalu dikompositkan kemudian dimasukkan kewadah plastik untuk
dijadikan sampel dan siap dibawa ke Laboratorium.

7
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

3.3.2. Isolasi Azotobacter dan Penicillium dari Sampel Tanah

Isolasi Azotobacter dari sampel tanah (tanah disekitar hutan
dan tanah pertanian) dilakukan deangan tahapan sebagai berikut :
1. Untuk pengenceran 10-1Sampel tanah yang telah dtimbang
secara steril, sampel tanah (@ 10 gram) dan larutan NaCl
fisiologis (90 ml) dishaker supaya tanah tersuspensi dengan
baik.
2. Membuat serial pengenceran dalam tabung reaksi dengan
menggunakan larutan fisiologis 9 ml hingga pengenceran 10-4
dengan cara pipet sebanyak 1 ml dari suspensi tanah (100 ml)
pada pengenceran 10-1 kemudian diinokulasikan pada larutan
fisiologis (9 ml) yang merupakan tingkat pengenceran 10-2,
pengenceran dilakukan sampai 10-4. Shaker sebelum
penginokulasian larutan ke tingkat pengenceran berikutnya.
3. Untuk inokulasi dilakukan metode tuang dengan
menginokulasikan seri pengenceran 10-3 dan 10-4, masing-
masing 1 ml ke cawan petri kemudian tuangkan media NFM.
4. Inkubasi dalam incubator selama 2 hari pada suhu 290C – 310C,
bakteri Azotobacter ditandai dengan koloni bakteri berwarna
bening pada media NFM.
Isolasi Penicillium dari sampel tanah (tanah disekitar hutan
dan tanah pertanian) dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :
1. Sampel tanah yang telah dtimbang secara steril, sampel tanah
(@ 10 gram) dan aquades (90 ml) dishaker agar tanah
tersuspensi dengan baik dan merupakan pengenceran 10-1.
2. Membuat serial pengenceran dalam tabung reaksi dengan
menggunakan aquades 9 ml hingga pengenceran 10-4
3. Pipet sebanyak 1 ml dari suspensi tanah (100 ml) pada
pengenceran 10-1 kemudian diinokulasikan pada aquades (9 ml)
yang merupakan tingkat pengenceran 10-2, pengenceran
dilakukan sampai 10-4. Shaker sebelum penginokulasian larutan
ke tingkat pengenceran berikutnya.

8
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

4. Inokulasikan seri pengenceran 10-3 dan 10-4, masing – masing

1 ml ke cawan petri kemudian tuangkan pula media Martin
Agar (Rose Bengal) (Metode tuang).
5. Inkubasi selama 7 hari, cendawan Penicillium ditandai dengan
cendawan yang tumbuh, hifa koloninya berwarna hijau muda
ditengah dan dikelilingi oleh hifa putih dipinggirnya.

3.3.3. Pengamatan Pertumbuhan Bakteri Azotobacter

1. Bakteri di media NFM padat diremajakan pada media NFM
cair
2. Hasil peremajaan kemudian diukur dengan spektrofotometer
Uv-visible dengan panjang gelombang 600 Nm secara bertahap
setiap 2 jam selama 30 jam
3. Catat nilai absorbansi, dan buat grafik pertumbuhan bakteri
Azotobacter

3.3.4. Pengujian Patogenitas Bakteri Azotobacter

1. Isolat cair Azotobacter diambil dengan suntik sebnayak 1 ml
2. Injeksikan Isolat tersebut ke daun tembakau secara hati – hati
dan perlahan.
3. Amati perubahan yang terjadi pada daun tembakau, jika spot
yang disuntikkan berubah menguning maka isolat Azotobacter
mempunyai kemungkinan bersifat patogen.

3.3.3. Pengujian Azotobacter sp. terhadap Perkecambahan Benih Kacang

hijau
1. Siapkan benih kacang hijau yang akan dikecambahkan.
2. Isolat Azotobacter sp. yang diisolasi di media padat,
diremajakan ke media NFM cair, dan diinkubasi sambil
dishaker selama 2 hari, buat mendajadi 3 perlakuan yaitu
kontrol (tanpa isolat), isolate Azotobacter sp. tanah pertanian,
dan Azotobacter sp. tanah disekitar hutan.

9
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

3. Benih kacang hijau yang telah disiapkan direndam kedalam

tiap perlakuan selama 6 jam.
4. Benih yang telah direndam kemudian ditumbuhkan pada media
kapas yang telah dibasahi oleh masing – masing perlakuan.
5. Amati pertumbuhan panjang akar dan tinggi kecambah selama
7 hari.

3.3.5. Pengujian Kemampuan Menghasilkan Antibiotik pada Cendawan

Penicillium
1. Penicillium yang telah berhasil diisolasi dimedia padat
diremajakan ke dalam media Rose Bengal cair sebanyak 30 ml,
kemudian diinkubasi selama 5 hari.
2. Cendawan yang telah berhasil tumbuh di media Rose Bengal
cair kemudian dimasukkan kedalam tube untuk centrifuge.
3. Centrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm, ambil
supernatan hasil centrifuge.
4. Kertas cakram dicelupkan ke dalam supernatan dan diletakkan
diatas media NA (Nutrien Agar)
5. Media NA yang telah diletakkan dengan kertas cakram
kemudian di biarkan di udara terbuka dengan tujuan agar
mikroba udara masuk dan berkembang di media NA.
6. Amati zona bening yang tampak di sekitar kertas cakram
kemudian hitung daya hambatnya dengan rumus,

Diameter total
Daya Hambat =
Diameter kertas cakram

10
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil
4.1.1. Isolasi Azotobacter sp.
Azotobacter sp. yang berhasil diisolasi pada media NFM
dari dua jenis sampel tanah menunjukkan pertumbuhan koloni
berwarna bening pada media tumbuh (Gambar 1), selain itu pada
tiap – tiap sampel tanah yang berbeda menunjukkan jumlah koloni
yang berbeda pula (Tabel 1).
Tabel 1. Jumlah koloni Azotobacter sp. yang berhasil diisolasi pada
masing – masing sampel tanah dari rizosfer
alang – alang
Jumlah Koloni/gram tanah
Bakteri
Tanah Pertanian Tanah Sekitar Hutan
Azotobacter sp. 1,45 x 105 2,05 x 105

Gambar 1. Koloni Azotobacter sp. dilihat dari koloni yang

berwarna bening pada media NFM

Grafik pertumbuhan Azotobacter sp. ditunjukkan dengan

pertumbuhan yang konstan, fase lag diawali mulai jam ke-1 sampai
ke-6, kemudian pada jam ke-6 memasuki eksponensial sampai jam
ke-18. Fase stasioner diawali mulai jam ke-18 sampai jam ke-28,
setelah itu pada jam ke-30 jumlah koloni mulai menurun secara
konstan memasuki fase kematian (Gambar 2).

11
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

2
Grafik Pertumbuhan Azotobacter
1.8 Pertanian
Sekitar Hutan
1.6
mulai
1.4 fase memasuki
Absorbansi
fase
1.2 stasioner kematian
1
0.8 fase
0.6 eksponensial
0.4
0.2 fase lag
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Jam ke-

Gambar 2. Grafik Pertumbuhan Azotobacter sp.

Selain itu pengujian terhadap patogenitas Azotobacter tidak

meunjukkan sifat patogen, karena setiap isolat Azotobacter baik
yang berasal dari tanah sekitar hutan maupun tanah pertanian, tidak
menyebabkan klorosis pada daun tembakau.
Tabel 2. Uji Patogenitas Azotobacter pada tanaman tembakau
Isolat Klorosis Keterangan Sifat
Azotobacter pada daun Patogenitas
Daun tetap
berwarna hijau
tanpa adanya
Pertanian - -
bercak coklat yang
merupakan gejala
klorosis daun.
Daun tetap
berwarna hijau
Sekitar tanpa adanya
- -
Hutan bercak coklat yang
merupakan gejala
klorosis daun.

12
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Karena tidak ditemukannya sifat patogen dari isolat

Azotobacter, maka pengujian dapat dilakukan ke tahap selanjutnya,
yaitu pengujian isolat Azotobacter terhadap perkecambahan benih
tanaman.

4.1.2. Pengujian Azotobacter sp. terhadap perkecambahan kacang hijau

Pengujian Azotobacter sp. pada perkecambahan kacang
hijau memberikan hasil yang berbeda terhadap kacang hijau yang
dikecambahkan dengan diinokulasikan Azotobacter sp.
dibandingkan kacang hijau yang dikecambahkan tanpa adanya
inokulasi Azotobacter sp.. Secara umum, kacang hijau yang
dikecambahkan dengan inokulasi Azotobacter sp. mempunyai
pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan kacang hijau yang
dikecambahkan tanpa inokulasi Azotobacter sp., terutama pada
parameter panjang akar dan tinggi kecambah (Tabel 2).
Tabel 3. Pertumbuhan benih kacang hijau yang diinokulasikan
Azotobacter sp. dan yang tidak diinokulasikan
Azotobacter sp. umur 5 hari setelah perkecambahan
Parameter Pengamatan
Jenis Tanah
Panjang akar Tinggi kecambah
(cm) (cm)
Kontrol 7,8 12
Tanah Pertanian 8 13,7
Tanah Disekitar Hutan 11,1 14,2

13
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

16

14

Tinggi kecambah (cm) 12

10

6 Kontrol
Sekitar Hutan
4
Pertanian
2

0
1 2 3 4 5
Hari ke-

Gambar 3. Grafik Pertumbuhan Tinggi kecambah Kacang hijau

12

10

8
Panjang akar (cm)

4 Kontrol
Sekitar Hutan
2 Pertanian

0
1 2 3 4 5 6 7
Hari ke-

Gambar 4. Grafik Pertumbuhan Panjang akar Kacang hijau

14
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

4.1.3. Isolasi Penicillium

Penicillium yang telah berhasil diisolasi ditunjukkan
dengan tumbuhnya koloni cendawan yang mempunya hifa
berwarna hijau muda ditengahnya dan hifa berwarna putih
dipinggiran koloni (Gambar 3). Berdasarkan analisa secara
morfologi diketahui bahwa spesies yang didapat adalah Penicillium
digitatum.

Gambar 5. Koloni Penicillium digitatum

4.1.4. Pengujian Kemampuan Menghasilkan Antibiotik pada Cendawan

Penicillium
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan,
diketahui bahwa cendawan Penicillium digitatum dapat
menghasilkan senyawa antibiotik. Hal ini diketahui dari zona
bening yang terbentuk disekitar kertas saring yang telah dicelupkan
oleh supernatan Penicillium digitatum (Gambar 4).
Hasil perhitungan memperlihatkan bahwa daya hambat
yang dihasilkan oleh Penicillium digitatum adalah sebesar…….
Yang membuktikan bahwa Penicillium digitatum mempunyai
kemampuan untuk mengahmbat pertumbuhan mikroba (Tabel 3).

15
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Tabel 4. Daya hambat Penicillium digitatum

Diameter (mm) Daya
Cendawan
Total Kertas cakram Hambat
Penicillium digitatum 12,5 5 2,5

Gambar 6. Zona bening yang dihasilkan

4.2. Pembahasan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan diketahui bahwa
jumlah koloni yang berasal pada rizosfer alang – alang yang berasal dari
lahan pertanian lebih banyak dibandingkan yang berasal dari tanah sekitar
hutan. Perbedaan jumlah koloni ini kemungkinan didasari oleh banyaknya
jumlah bahan organik tanah yang dapat dimanfaatkan oleh Azotobacter
sp.. Tanah pertanian lebih subur dan lebih banyak mengandung bahan
organik yang merupakan sumber makanan dari Azotobacter dibandingkan
tanah yang berasal dari daerah di sekitar hutan. Tanah yang berada di
daerah sekitar hutan (bukan daerah hutan) memiliki jumlah bahan organik
yang lebih sedikit dikarenakan selain tanahnya padat, juga populasi
tanaman di daerah tersebut juga tidak terlalu banyak.
Selain faktor bahan organik sebagai sumber makanan, Pandey
(2000) menyebutkan bahwa faktor lingkungan lain yang mempengaruhhi
pertumbuhan bakteri adalah derajat keasaman, tekanan osmotik, tingkat
aerasi, dan suhu. Faktor lingkungan penting untuk diketahui dikarenakan
menurut Afnani (2010), pertumbuhan dan aktivitas mikrobia sangat

16
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

dipengaruhi faktor-faktor lingkungan. Faktor lingkungan dapat

mengakibatkan perubahan sifat morfologi dan fisiologi mikrobia, juga
dapat mengakibatkan laju pertumbuhan menurun ataupun meningkat.
Grafik pertumbuhan dari bakteri Azotobacter menunjukkan
peningkatan pertumbuhan dari berbagai fase yaitu fase lag, fase
eksponensial, fase sstatsioner, dan fase kematian. Seharusnya nilai
absorbansi pada grafik pertumbuhan tidak boleh melebihi angka 1, tetapi
pada praktikum ini nilai absorbansi melebihi angka 1. Ada beberapa factor
yang mempengaruhi nilai absorbansi tersebu antara lain, kontaminasi,
metode kerja yang aseptik, tingkat ketelitian alat, dan kalibrasi alat.
Metode kerja yang aseptik berhubungan dengan kontaminasi
isolate, metode kerja yang kurang aseptik meningkatkan kemungkinan
isolat terkontaminasi dengan mikroba lain. Selain itu, tingkat ketelitian
dan kalibrasi alat juga mempengaruhi nilai absorbansi yang didapat,
semakin teliti tingkat ketelitian dan semakin sering alat tersebut
dikalibrasi, maka data yang didapat akan semakin baik.
Pengujian Azotobacter sp. pada benih kacang hijau menunjukkan
bahwa secara umum pertumbuhan benih kacang hijau yang diinokulasikan
dengan Azotobacter sp., pertumbuhannya lebih baik dibandingkan yang
tidak diinokulasiskan dengan Azotobacter sp. (kontrol). Pada hari ke-5,
benih kacang hijau yang diinokulasikan Azotobacter sp. yang berasal dari
tanah pertanian memiliki panjang akar8 cm dan tinggi kecambah 13,7 cm.
Benih kacang hijau yang diinokulasikan Azotobacter sp. yang berasal dari
tanah disekitar hutan memiliki panjang akar 11,1 cm dan tinggi kecambah
14,2 cm. Sedangkan, benih kacang hijau yang tanpa inokulasi Azotobacter
sp. memiliki panjang akar 7,8 cm dan tinggi kecambah 12 cm.
Azotobacter sp. dapat membatu dalam perkecambahan tanaman
kacang hijau dikarenakan meurut Hamastuti (2012), Azotobacter sp.
mampu mengubah nitrogen (N2) dalam atmosfer menjadi amonium (NH4+)
melalui proses fiksasi nitrogen dimana amonia yang dihasilkan diubah
menjadi protein untuk proses metabolisme tanaman.

17
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Menurut Widiastuti et al. (2010), selain dapat memfiksasi nitrogen

bebas dari udara, keunggulan lain dari Azotobacter sp. menurut adalah
dapat mensintesis hormon seperti IAA. Disebutkan dalam Patten dan
Glick (2002) bahwa sintesis IAA pada bakteri melalui jalur asam indol
piruvat. IAA yang disekresikan bakteri memacu pertumbuhan akar secara
langsung dengan menstimulasi pemanjangan atau pembelahan sel.
Berdasarkan percobaan yang dilakukan dengan menggunakan
supernatant hasil centrifuge dari cendawan Penicillium digitatum,
diketahui bahwa cendawan Penicillium digitatum dapat menghasilkan zat
antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, hal ini
dibuktikan dengan adanya zona bening pada kertas cakram yang telah
dicelupkan supernatan dari cendawan Penicillium digitatum (Gambar 6), dan
diketahui daya hambatnya sebesar 2,5.
Kemampuan Penicillium dalam menghambat mikroba lain
dikarenakan Penicillium dapat memproduksi zat antibiotic berupa penicillin
yang menghambat sintesis peptidoglycan. Penicilin menghambat sintesis
dinding sel bakteri dengan menghambat sintesis enzim atau menonaktivasi
enzim yang mensintesis peptidoglycan yang merupakan komponen penting
pada pembentukan dinding sel. Terhambatnya sintesis peptidoglycan
menyebabkan hilangnya viabilitas dan dapat menyebabkan dinding sel
menjadi pecah (lisis) (Arisanti et al. 2012). Kemapuan Penisilin dalam
menghambat pembentukan dinding sel dan merusak dinding sel mikroba lain,
menyebabkan mikroba lain tidak dapat tumbuh, otomatis menyebabkan
Penisilin sebagai zat antimikroba yang dapat akan pertumbuhan dari mikroba
lain.

18
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

V. SIMPULAN

5.1. Simpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, simpulan yang dapat diambil

adalah,
1. Teknik mengisolasi bakteri Azotobacter adalah dengan mengencerkan sampel
tanah menggunakan metode pengenceran, kemudian untuk mengisolasi bakteri
Azotobacter dilakukan dengan metode tuang (pour plate) menggunakan
media NFM padat dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 290C – 300C.
2. Azotobacter terbukti mampu meningkatkan perkecambahan benih kacang
hijau terutama pada panjang akat dan tinggi kecambah, secara tabulasi
menunjukkan bahawa bakteri Azotobacter yang berasal dari tanah disekitar
hutan memberikan respon tertinggi terhadap panjang akar dan tinggi
kecambah.
3. Teknik mengisolasi cendawan Penicillium adalah dengan mengencerkan
sampel tanah menggunakan metode pengenceran, kemudian untuk
mengisolasi cendawan Penicillium dilakukan dengan metode tuang (pour
plate) menggunakan media Martin Agar dan diinkubasi selama 7 hari pada
suhu 290C – 300C.
4. Penicillium digitatum terbukti mampu mengahambat pertumbuhan mikroba
lain dengan daya hambat sebesar 2,5 dibuktikan dari zona bening yang
terbentuk disekitar kertas cakram yang telah dicelupkan kedalam supernatan
hasil centrifuge dari cendawan Penicillium digitatum.

19
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

DAFTAR PUSTAKA

Afni, A. 2010. Daya Tumbuh Bakteri dari Limbah Cair Rumah Sakit yang
Berpotensi Mendegradasi Fenol Terhadap Variasi Konsentrasi Glukosa
Dan Fenol [skripsi]. Fakultas sains dan Teknologi Unversitas Islam Negeri
Sunan Kalijaga Yogyakarta
Alexopoulus CJ., Mims CW. 1979. Introductory Micology. New York: John
Wiley & Son’s.

Allen ON., Allen EK. 1981. The leguminosae: A source book of characteristics,
uses, and nodulation. University of Wisconsin Press. Madison, USA.
Arisanti S., ND. Kuswytasari, M. Shovitri. 2012. Antimicrobial Assay of Soil
Mold Isolates from Wonorejo Surabaya. The Journal for Technology and
Science 23 (4) : 111 – 117
Cole RJ., Schweikert MA. 2003. Handbook of Secondary Fungal Metabolites.
California : Academic Press Elsevier Science

Deacon JW. 2006. Fungal Biology. Malden: Blackwell Publishing.

Hamastuti H., Elysa DO., SR. Juliastuti, Nuniek H. 2012. Peran Mikroorganisme
Azotobacter chroococcum, Pseudomonas fluorescens, dan Aspergillus
niger pada Pembuatan Kompos Limbah Sludge Industri Pengolahan Susu.
Jurnal Teknik Pomits 1 (1): 1-5
Hamdi, YA. 1982. Application Of Nitrogen-Fixing Systems In Soil Improvement
And Management. Rome. Food And Agriculture Organization Of The
United Nation.

Hardaningsih S. 2011. Jenis Penyakit Kedelai Dan Efektivitas Jamur Antagonis

Yang Berasal Dari Kalimantan Selatan Terhadap Sclerotium rolfsii Di
Laboratorium. Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-
umbian.
Makut MD., Owolewa OA. 2011. Antibiotic-Producing Fungi Present In The Soil
Environment Of Keffi Metropolis, Nasarawa State, Nigeria. Trakia
Journal Of Sciences 9(2): 33-39.

Mujiyati, Supriyadi. 2009. Pengaruh pupuk kandang dan NPK terhadap populasi
bakteri Azotobacter dan Azospirillum dalam tanah pada budidaya cabai
(Capsicum annum). Bioteknologi 6 (2): 63-69
Nurhayati, H. 2006. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Non-Simbiotik
dari Lahan Kering Masam [skripsi]. Fakultas Sains Dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Malang

20
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Panda D., Rathinasamy K., Santra MK., Wilson L. 2005. Kinetic suppression of
microtubule dynamic instability by griseofulvin: Implications for its
possible use in the treatment of cancer. PNAS 102 (28): 9878-9883
Pandey, A. 2000. Advances in microbial amylases [review]. Biotechnol Appl
Biochem 31: 135 – 152

Patten CL., BR. Glick. 2002. Role of Pseudomonas putida indol acetic acid in
development of the host plant root system. Application Enviroment
Microbiologi 68: 3795 – 3801.

Prihanto AA. 2012. Perbandingan Aktivitas Antibakteri Penicillium notatum atcc

28089 dengan Penicillium sp. R1m yang Diisolasi dari Mangrove
Sonneratia caseolaris. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas
Brawijaya.

Rao, NS. Subba. 1994. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman.

Terjemahan dari Soil Organisms and Growth, oleh : Herawati Susilo.
Jakarta. UI-PRESS.

Salysbury, F. B dan Ross, C. W. 1995. Fisiologi Tumbuhan, jilid dua. Terjemahan

Plant Physiology, 4th edition, oleh : Diah R. Lukmana dan Sumaryono.
1992. Bandung. Penerbit ITB Bandung.

Soenartiningsih. 2010. Efektivitas beberapa Cendawan Antagonis dalam

Menghambat Perkembangan Cendawan Rhizoctonia solani pada Jagung
Secara Invitro. Prosiding Pekan Serealia Nasional.

Suwandi U. 1992. Mekanisme Kerja Antibiotik. Pusat Penelitian dan

Pengembangan P.T. Kalbe Farma: Jakarta.

Wedhastri, S. 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacter spp. Penghasil Faktor

Tumbuh dan Penambat Nitrogen dari Tanah Masam. Jurnal Ilmu Tanah
dan Lingkungan 3 (1) : 45-51

Tate RL. 2000. Soil Microbiology, second edition. New York. Jhon Wiley &
Sons, Inc.

Widiastuti H. Siswanto, Suharyanto. 2010. Karakterisasi dan Seleksi Beberapa

Isolat Azotobacter sp. untuk Meningkatkan Perkecambahan Benih dan
Pertumbuhan Tanaman. Buletin Plasma Nutfah 16 (2): 160 – 167
Xenia. 2010. Pengaruh Inokulasi Azotobacter sp. Terhadap Perakaran Jagung
pada Beberapa Tingkat Pemberian KNO3 di Media Padat Watanabe
[skripsi]. Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

21
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

LAMPIRAN

22
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Lampiran 1. Sampel Tanah yang akan Diisolasi

a b

c
Sampel
tanah yang
diambil
adalah yang
melekat pada
Rizosfer akar

Gambar 7. a) Pengambilan tanah dari rhizosfer alang – alang, b) sampel tanah dari
lahan pertanian, c) sampel tanah dari lahan disekitar hutan

23
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Lampiran 2. Teknik Isolasi Azotobacter dan Penicillium

a b

Gambar 8. a) Suspensi tanah yang dishaker, b) Pengenceran sampel tanah

(metode pengenceran), c) Penuangan media tumbuh (metode tuang),
d) perhitungan jumlah koloni bakteri Azotobacter

24
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Lampiran 3. Penicillium dan Azotobacter yang berhasil dikulturkan

a b

Gambar 9. a) Penicillium digitatum, b) Azotobacter sp.

Lampiran 4. Penampakan Mikroskopis Azotobacter dan Penicillium digitatum

pada Pembesaran 1000x

Gambar 10. Kenampakan Mikroskopis, a) Azotobacter sp., b) Penicillium

digitatum

25
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Lampiran 5. Aplikasi Azotobacter sp. pada daun tembakau untuk uji patogenitas

a b c

Gambar 11. a) Injeksi isolat Azotobacter sp. pada daun tembakau, b) hasil injeksi
Azotobacter sp. yang berasal dari tanah disekitar hutan pada daun
tembakau umur 0 hari, c) hasil injeksi Azotobacter sp. yang berasal
dari tanah pertanian pada daun tembakau umur 0 hari.

a b

Gambar 12. a) hasil injeksi Azotobacter sp. yang berasal dari tanah disekitar hutan
pada daun tembakau umur 3 hari setelah aplikasi, b) hasil injeksi
Azotobacter sp. yang berasal dari tanah pertanian pada daun
tembakau umur 3 hari setelah aplikasi. Daun masih terlihat segar
tanpa adanya gejala klorosis pada daun.

26
 Praktikum Mikrobiologi dan Biteknologi Tanah

Lampiran 6. Perkecambahan benih kacang hijau umur 5 hari setelah

perkecambahan

Gambar 13. Pengaruh Azotobacter sp. terhadap perkecambahan benih kacang

hijau umur 5 hari setelah perkecambahan

27