Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Perbatasan dalam Zoologi bioMedPusat

Riset Akses terbuka

Kinerja komparatif gen 16S rRNA dalam kode batang DNA amfibi

Miguel Vences*1, Meike Thomas2, Arie van der Meijden3, Ylenia Chiari3dan
David R Vieites4

Alamat:1Institut Dinamika Keanekaragaman Hayati dan Ekosistem, Museum Zoologi, Universitas Amsterdam, Mauritskade 61, 1092 M
Amsterdam, Belanda,2Institut Genetika, Genetika Evolusioner, Universitas Cologne, Weyertal 121, 50931 Köln, Jerman,
3Departemen Biologi (Biologi Evolusioner), Universitas Konstanz, 78457 Konstanz, Jerman dan4Departemen Biologi Integratif, Museum
Zoologi Vertebrata, 3101 Valley Life Sciences Bldg., University of California, Berkeley, CA 94720-3160, AS
Email: Miguel Vences* - vences@science.uva.nl ; Meike Thomas - meike.thomas@uni-koeln.de ; Arie van der
Meijden - frog@arievandermeijden.nl ; Ylenia Chiari - ylenia.chiari@uni-konstanz.de ; David R Vieites - vieites@berkeley.edu
* Penulis yang sesuai

Diterbitkan: 16 Maret 2005 Diterima: 25 Oktober 2004

Diterima: 16 Maret 2005
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5 doi:10.1186/1742-994-2-5

Artikel ini tersedia dari: http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5

© 2005 Vences dkk; pemegang lisensi BioMed Central Ltd.

Ini adalah artikel Akses Terbuka yang didistribusikan di bawah persyaratan Lisensi Atribusi Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), yang
mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan karya aslinya dikutip dengan benar.

Abstrak
Latar belakang:Mengidentifikasi spesies organisme dengan urutan pendek DNA telah menjadi pusat diskusi
yang sedang berlangsung di bawah istilah barcode DNA atau taksonomi DNA. Fragmen C-terminal dari gen
mitokondria untuksitokrom oksidase subunit I(COI) telah diusulkan sebagai penanda universal untuk tujuan
ini di antara hewan.

Hasil:Di sini kami menyajikan bukti eksperimental bahwa mitokondria16S rRNAgen memenuhi persyaratan
untuk penanda barcode DNA universal pada amfibi. Dalam hal universalitas situs priming dan identifikasi
clades vertebrata utama yang dipelajari16Sfragmen lebih unggul dari COI. Keberhasilan amplifikasi adalah
100% untuk16Sdalam subset sampel katak Madagaskar yang segar dan terawetkan dengan baik, sementara
berbagai kombinasiCOIprimer memiliki tingkat keberhasilan yang lebih rendah.COIsitus priming
menunjukkan variabilitas yang tinggi di antara amfibi baik pada tingkat kelompok dan spesies yang
berkerabat dekat, sedangkan16Ssitus priming sangat dilestarikan di antara vertebrata. Berpasangan
interspesifik 16Sdivergensi dalam kelompok uji katak Madagaskar berada pada tingkat yang sesuai untuk
penetapan tahap larva untuk spesies (1-17%), dengan derajat rendah divergensi haplotipe berpasangan
dalam populasi (0-1%).

Kesimpulan:Kami sangat menganjurkan penggunaan16S rRNAsebagai penanda barcode DNA standar untuk
vertebrata untuk melengkapiCOI, terutama jika sampelsebuah prioritasbisa termasuk dalam berbagai taksa
yang jauh secara filogenetik dan negatif palsu akan menjadi masalah besar.

Latar belakang
Penggunaan sekuens DNA pendek untuk identifikasi standar
organisme baru-baru ini mendapat perhatian di bawah istilah
DNA barcoding atau taksonomi DNA [1-3]. Di antara aplikasi
yang menjanjikan dari metode ini adalah penugasan tahap
sejarah kehidupan yang tidak diketahui kepada orang dewasa
organisme [4,5], identifikasi organisme skala besar dalam studi
ekologi atau genomik [1,6] dan, yang paling kontroversial, studi
eksploratif untuk menemukan spesies "kandidat" yang
berpotensi belum terdeskripsikan [4,7,8]. Meskipun ini bukan
teknik baru yang fundamental [9], DNA barcode menjanjikan
karena kemajuan teknis telah membuat

Halaman 1 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5
skala, aplikasi otomatis layak [3,6] yang dapat
mempercepat kemajuan taksonomi [10].
Meskipun tidak harus di bawah konsep khusus DNA barcode
dan taksonomi DNA, diagnosis dan bahkan definisi taksa
oleh urutan DNA mereka adalah kenyataan di banyak
bidang dan kelompok organisme, seperti prokariota, jamur,
dan invertebrata tanah [1,6]. Untuk menggunakan
pendekatan ini dalam skala besar dan formal, konsensus
komunitas ilmiah sangat penting sehubungan dengan gen
yang paling cocok yang memungkinkan amplifikasi dan
pengurutan yang kuat dan berulang, dan yang memberikan
resolusi tegas untuk mengidentifikasi spektrum organisme
yang luas. Sementara D. Tautz dan rekan kerja [3]
mengusulkan gen RNA ribosom nuklir untuk tujuan ini, PDN
Hebert dan rekan sangat mendukung fragmen 5' dari gen
mitokondria untuk sitokrom oksidase, subunit I (COIatau
COXI) [2,11]. Fragmen gen ini telah terbukti memberikan
resolusi dan ketahanan yang cukup pada beberapa
kelompok organisme, seperti arthropoda dan, baru-baru ini,
burung [2,4,7,11].
Penanda genetik yang cocok untuk barcode DNA harus
memenuhi sejumlah kriteria [2]. Pertama, dalam kelompok
studi, itu perlu cukup bervariasi untuk membedakan di antara
sebagian besar spesies, tetapi cukup dilestarikan agar tidak
terlalu bervariasi di dalam daripada di antara spesies. Kedua,
lokasi priming perlu dilestarikan secara memadai untuk
memungkinkan amplifikasi yang andal tanpa risiko negatif palsu
ketika tujuannya adalah analisis sampel yang dikumpulkan,
misalnya ketika total invertebrata dari sampel tanah akan
dipelajari tanpa memisahkan individu, atau DNA lingkungan
seperti DNA subfosil tetap dari tanah [12,13]. Ketiga, gen harus
menyampaikan informasi filogenetik yang cukup untuk
menetapkan spesies ke taksa utama menggunakan pendekatan
fenetik sederhana. Keempat, amplifikasi dan pengurutannya
harus sekuat mungkin, juga di bawah kondisi lab variabel dan
protokol. Kelima, penyelarasan urutan harus dimungkinkan juga
di antara taksa yang terkait jauh.
Di sini kami mengeksplorasi kinerja fragmen gen RNA
ribosom 16S (16S) dalam barcode DNA amfibi. Sebagai
kontribusi untuk diskusi tentang penanda standar yang
sesuai, kami menyediakan data eksperimen tentang
keberhasilan amplifikasi komparatif dari16SdanCOIpada
amfibi, data empiris tentang pelestarian situs priming,
dan contoh dari16S- Identifikasi stadium larva amfibi.
Hasil
Eksperimen amplifikasi
Kami melakukan eksperimen amplifikasi independen
dengan satu set16Sprimer dan tiga set terbitan COI
primer [2,7] berfokus pada perwakilan dari genus katak,
salamander, dan caecilian yang berbeda. Eksperimen
http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5
sesuai dalam menghasilkan amplifikasi yang lebih andal dan
universal untuk16SdibandingkanCOI. Dalam satu set sampel
segar dan diawetkan dengan baik dari katak mantellid yang
relatif terkait erat dari Madagaskar (Tabel 1, File tambahan 1),
16Skeberhasilan amplifikasi selesai, sedangkan tiga setCOI
primer menghasilkan tingkat keberhasilan hanya 50-70%. Dilihat
dari ketiga kombinasi primer, terdapat dua spesies katak (10%)
yang tidak melakukan amplifikasi untuk COIsama sekali (
Boophis septentrionalisdanB. tephraeomystax).
Situs priming
Variabilitas situs priming disurvei menggunakan sembilan
sekuens mitokondria amfibi lengkap dari Genbank (Gbr. 1), dan
59 mt genom ikan, reptil, burung, dan mamalia (Gbr. 2). Sebuah
variabilitas tinggi ditemui untukCOI. Urutan beberapa spesies
sebagian besar konsisten dengan primer:Xenopusmemiliki dua
mutasi hanya di masing-masing daerah priming. Namun, urutan
lainnya sangat berbeda, dengan hingga tujuh mutasi, semuanya
pada posisi kodon ketiga. Tidak ada pola khusus yang dapat
dikenali untuk kelompok besar mana pun yang akan
memfasilitasi perancangan COIprimer khusus untuk katak,
salamander atau caecilian. Menariknya, variabilitas di antara
sekuens amfibi yang tersedia sama besar atau lebih besar
daripada di antara set lengkap vertebrata di banyak posisi
nukleotidaCOIsitus priming (Gbr. 2), menunjukkan kemungkinan
variabilitas yang lebih tinggi dari rata-rata gen ini pada amfibi.
Sebaliknya,16Ssitus priming sangat konstan baik di antara
amfibi dan di antara vertebrata lainnya (Gbr. 1, 2). Sebuah
survei yang lebih luas dari situs priming, yaitu, situs priming
terbalik alternatif yang digunakan dalam studi arthropoda
dan burung [2,7], menegaskan variabilitas tinggi dariCOI
pada amfibi, dan pada vertebrata pada umumnya (Gbr. 2).
Pemutaran 800 bp pertama dari bagian terminal-C gen pada
sembilan amfibi di mana gen mitokondria lengkap tersedia
tidak mengungkapkan satu fragmen pun 20 bp di mana
kesembilan spesies akan setuju dalam 80% atau lebih
nukleotida mereka.
Pemulihan kelompok besar
Analisis penggabungan tetangga fenetik menggunakan16S
fragmen menghasilkan pohon yang berisi delapan
kelompok utama yang sesuai atau sesuai dengan klasifikasi
dan filogeni saat ini (Gbr. 3): ikan bertulang rawan,
salamander, katak, kura-kura, mamalia eutherian, mamalia,
squamates, burung. Dari jumlah tersebut,COIpohon (Gbr. 4)
hanya menemukan garis keturunan ikan dan burung
bertulang rawan. ItuCOIanalisis tidak memulihkan garis
keturunan utama tambahan.
Barcoding 16S rDNA berudu
Dari proyek yang sedang berlangsung yang melibatkan identifikasi skala
besar kecebong katak Madagaskar [5] kami di sini menyediakan data dari
spesies katak larva dan dewasa dari dua lokasi
Halaman 2 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5 http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5

V iaRBeilit1y situs priming di amfibi

fiSebuahGRkamu

Variabilitas situs priming pada amfibi.Variabilitas situs priming untuk16S rRNAdanCOIpada amfibi.

Halaman 3 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5 http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5

V iaRtiedi2dari
FSebuahaku gRkamu situs priming vertebrata
Variasi situs priming vertebrata.Variasi di situs priming dari16S rRNA(a, F-primer; b, R-primer) danCOI(c, Burung-F1, LCO1490; d, HCO2198;
e, Fragmen Bird-R1, Bird-R2) dipelajari di sini. Nilai adalah variabilitas nukleotida yang dihitung menggunakan program DNAsp. Batang abu-
abu menunjukkan nilai untuk sembilan amfibi, batang hitam menunjukkan nilai untuk satu set 59 vertebrata lainnya (lihat Bahan dan
Metode, dan Gambar 3-4).

Halaman 4 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5 http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5

Reig3pohon
1F6aku gSkamun yang bergabung dengan hbor dari taksa vertebrata terpilih
16S Pohon yang bergabung dengan tetangga dari taksa vertebrata terpilih.Pohon tetangga yang bergabung dari taksa vertebrata terpilih
berdasarkan fragmen gen 16SrRNA yang diamplifikasi oleh primer 16SaL dan 16SbH. Angka dalam lingkaran hitam menunjukkan clades utama yang
ditemukan oleh analisis ini: (1) ikan bertulang rawan, (2) salamander, (3) katak, (4) kura-kura, (5) mamalia eutherian, (6) mamalia, (7) squamate , (8)
burung.

Halaman 5 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5 http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5

C
fiHAI pohon yang bergabung dengan ighbor dari taksa vertebrata terpilih
gusayaRnee4

Pohon yang bergabung dengan COI dari taksa vertebrata terpilih.Pohon tetangga yang bergabung dari taksa vertebrata terpilih
berdasarkan fragmen dariCOIgen yang diamplifikasi oleh primer LCO1490 dan HCO2198. Angka-angka dalam lingkaran hitam menunjukkan
clade utama yang ditemukan oleh analisis ini, sesuai dengan penomoran dalam Supp. material D. Hanya dua dari clade yang ditemukan oleh
16Sanalisis juga monofiletik di sini: (1) ikan bertulang rawan, (8) burung.

Halaman 6 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5
keanekaragaman anuran yang tinggi di Madagaskar timur,
Andasibe dan Ranomafana. Kedua wilayah ini dipisahkan
oleh jarak geografis ca. 250 km. Hasilnya akan disajikan
secara lebih rinci di tempat lain.
Kami memilih spesies target yang keseragaman morfologi dan
bioakustiknya menunjukkan bahwa populasi dari Ranomafana
dan Andasibe adalah sejenis. Semua spesies ini milik keluarga
Mantellidae. Kami kemudian menganalisis haplotipe di dalam
dan di antara populasi ini. Selain itu kami menilai perbedaan di
antara spesies saudara dari katak mantellid (Tabel 2-4, File
tambahan 1). Ini didefinisikan sebagai spesies yang secara
morfologis mirip yang secara filogenetik bersaudara satu sama
lain, atau berada dalam klad 3-5 spesies yang terdefinisi dengan
baik tetapi secara filogenetik tidak terselesaikan dengan baik.
Hasil mengungkapkan variasi intrapopulasi yang rendah dari 0–
3% jarak berpasangan yang tidak dikoreksi di16Sgen,
diferensiasi yang sangat besar di antara populasi sejenis dari
0-5,1%, dan berbagai diferensiasi di antara spesies, mulai dari
1-16,5% dengan mode pada 7- 9% (Gbr. 5). Beberapa spesies
yang dipisahkan oleh jarak genetik yang rendah terdistribusi
secara alopatrik. Divergensi interspesifik lebih tinggi pada
pasangan spesies di mana kemunculan sintopik telah dicatat
atau kemungkinan besar (2,7–16,5% divergensi, rata-rata 8,5%)
dibandingkan dengan mereka yang sejauh ini hanya ditemukan
dalam alopatri (1,0–12,9%, rata-rata 6,9%).
Analisis filogenetik dan fenetik (gabungan Bayesian dan
Tetangga) dari ini dan banyak sekuens tambahan (akan
diterbitkan di tempat lain) sebagian besar mengelompokkan
sekuens spesimen dari Ranomafana dan Andasibe yang apriori
telah dianggap sejenis (pengecualian adalahMantidactylus
boulengeri, tidak dipertimbangkan dalam perbandingan
intraspesifik di sini, danM. blommersae). Ini menunjukkan
bahwa kasus di mana haplotipe suatu spesies lebih mirip
dengan spesies lain daripada individu atau populasi sejenis
lainnya, jarang terjadi pada katak ini. Berbagi haplotipe identik
di antara individu-individu yang termasuk dalam spesies
berbeda, dalam dataset kami, terbatas pada tiga pasangan
spesies yang terkait erat dengan divergensi genetik rendah:
Boophis douliotidanB. tephraeomystax,B. goudotdanB. lihat
periegetes,Mantella aurantiacadanM.crocea. Bergantung pada
skema taksonomi yang digunakan, kumpulan data lengkap kami
berisi 200–300 spesies katak Madagaskar. Oleh karena itu,
pembagian haplotipe ditunjukkan pada 2-3% dari jumlah total
spesies saja.
Untuk mengeksplorasi keandalan identifikasi kecebong
menggunakan16Sgen kami menggunakan pencarian BLAST lokal
terhadap database yang berisi sekitar 1000 urutan katak dewasa
dari pengambilan sampel yang luas di seluruh Madagaskar. 138
kecebong dari wilayah Andasibe dan 84 kecebong dari wilayah
Ranomafana dibandingkan dengan urutan dewasa dalam database.
Dalam 77% kasus, skor tertinggi
http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5
adalah orang-orang dari perbandingan dengan orang dewasa dari
situs yang sama dengan kecebong. Dalam sebagian besar
perbandingan yang gagal, urutan dewasa dari spesies yang sesuai
tidak tersedia dari situs kecebong (21%). Hanya dalam 5 kasus (2%)
orang dewasa sejenis yang dikumpulkan dari situs yang berbeda
dari kecebong menghasilkan skor BLAST yang lebih tinggi meskipun
urutan dewasa dari situs yang sama ada di database.
Kesimpulan
Pengkodean DNA pada amfibi
Kode batang DNA memiliki daya tarik yang besar sebagai alat yang dapat
diterapkan secara universal untuk identifikasi spesies dan varian
organisme, bahkan mungkin dalam perangkat genggam otomatis [14].
Namun, tidak diragukan lagi ada batasan ketat untuk penerapannya
secara universal [9]. Beberapa taksa, misalnya ikan cichlid di Danau
Victoria, telah menyebar begitu cepat sehingga peristiwa spesiasi tidak
meninggalkan jejak dalam genom mitokondria mereka [15];
mengidentifikasi spesies ini secara genetik hanya akan mungkin melalui
pemeriksaan beberapa penanda nuklir, seperti yang telah dilakukan
untuk menilai filogeni mereka [16]. Beberapa siput dicirikan oleh
keragaman haplotipe intraspesifik yang tinggi, yang dapat melumpuhkan
upaya untuk mengidentifikasi dan membedakan spesies menggunakan
penanda tersebut [17].
Berbagi haplotipe karena penyortiran garis keturunan yang
tidak lengkap atau introgresi juga dikenal pada amfibi [18]
meskipun tidak umum pada katak mantellid dalam kumpulan
data kami. Namun, sejumlah spesies menunjukkan berbagi
haplotipe dengan spesies lain, atau haplotipe non-monofiletik,
memerlukan diskusi yang lebih luas. Di dalamMantidactylus
boulengeri, spesimen dari Andasibe dan Ranomafana memiliki
panggilan iklan yang sama dan (setidaknya secara dangkal)
morfologi yang serupa, tetapi mereka16Shaplotipe bukan
kelompok monofiletik (data tidak dipublikasikan). Spesies ini
termasuk dalam kelompok katak yang berkembang secara
langsung, seperti NeotropicalEleutherodactylus[19] dapat
dicirikan oleh tingkat spesiasi samar yang tinggi. Data lebih
lanjut diperlukan untuk memutuskan apakah populasi dari
Ranomafana dan Andasibe memang sejenis. Sebaliknya, ada
sedikit keraguan bahwa populasiMantidactylus blommersae dari
dua situs ini adalah sejenis, namun haplotipe Ranomafana lebih
dekat dengan spesies yang jelas berbedaM. domerguei.
Pasangan spesies di mana berbagi haplotipe telah diamati (lihat
Hasil) semuanya tampak terdistribusi secara alopatrik hingga
parapatrik dan tidak menunjukkan atau hanya perbedaan
rendah dalam panggilan iklan, yang menunjukkan bahwa
hibridisasi sesekali di sepanjang zona kontak dimungkinkan
[misalnya, [20]]. Haplotipe dari masing-masing pasangan
spesies ini selalu membentuk kelompok atau klad yang sangat
didukung, dan memiliki divergensi di bawah 3%, menunjukkan
bahwa berbagi haplotipe di mantellid hanya dapat
menimbulkan masalah ketika individu ditugaskan ke spesies
saudara yang terkait erat.
Halaman 7 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5 http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5

ter5- dan variasi genetik intraspesifik pada katak Malagasi

1F6aku gSkamudi dalamulang

Variasi genetik antar dan intraspesifik 16S pada katak Malagasi.Variasi dalam fragmen gen 16S rRNA (ca. 550 bp) dipelajari di sini, (a)
dalam populasi, (b) di antara populasi sejenis dan (c) di antara spesies saudara katak dalam famili Mantellidae dari Madagaskar. Nilai-nilai
tersebut adalah jarak p yang tidak dikoreksi dari perbandingan berpasangan dalam kategori masing-masing. Hanya satu nilai (rata-rata) per
spesies yang digunakan dalam (a) dan (b), bahkan ketika banyak individu dibandingkan. Batang abu-abu pada (a) dan (b) menunjukkan nilai
rata-rata dari semua kemungkinan perbandingan individu dalam suatu spesies, batang hitam adalah divergensi maksimum yang ditemui
antara dua urutan individu.

Halaman 8 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5
Meskipun data kami menunjukkan bahwa kode batang DNA
dalam mantellid adalah pendekatan yang sebagian besar valid
ketika urutan referensi dan uji berasal dari situs yang sama,
terjadinya haplotipe non-monofiletik dan sangat berbeda dalam
spesies mencirikan ini dan amfibi lainnya sebagai kelompok
yang menantang untuk teknik ini. . Tentu saja, kode batang DNA
tidak dapat memberikan identifikasi spesies yang dapat
diandalkan sepenuhnya pada amfibi, terutama jika urutan
referensi tidak mencakup seluruh variabilitas genetik dan
distribusi geografis suatu spesies. Namun, hal yang sama
berlaku untuk metode identifikasi morfologis atau bioakustik
lainnya. Studi kasus diperlukan untuk memperkirakan lebih
tepat margin kesalahan identifikasi molekuler spesies amfibi.
Untuk banyak pendekatan, seperti survei molekuler
perdagangan kaki katak untuk konsumsi manusia [21], margin
kesalahan mungkin dapat diterima. Sebaliknya, tumpang tindih
yang luas dari divergensi intraspesifik dan interspesifik (Gbr. 5)
memperingatkan terhadap diagnosis sederhana dari spesies
amfibi yang mungkin baru hanya dengan divergensi DNA saja.
Sebagian besar spesies biologis dan evolusioner akan
terlewatkan oleh inventarisasi yang mencirikan spesies kandidat
oleh divergensi DNA di atas ambang batas yang ditentukan
sebelumnya.
Kinerja komparatif penanda kode batang DNA pada
amfibi
Fenomena berbagi haplotipe atau haplotipe sejenis non-
monofiletik akan mempengaruhi setiap pendekatan barcode
DNA yang menggunakan gen mitokondria, dan juga diharapkan
dengan gen nuklir [misalnya, [22]]. Namun demikian, beberapa
gen tentu mengungguli yang lain dalam hal kekuatan
diskriminatif dan penerapan universal, dan karakteristik ini juga
dapat bervariasi di antara kelompok organisme. Mitokondria
tumbuhan dicirikan oleh pola evolusi yang sangat berbeda dari
hewan, termasuk seringnya translokasi materi genetik ke dalam
dan dari nukleus [23], yang membatasi penggunaannya untuk
tujuan pengkodean DNA. DNA ribosom inti (18Sdan28S),
diusulkan sebagai penanda standar [3], memiliki potensi tinggi
dalam pengkodean DNA invertebrata tetapi amplifikasi
throughputnya yang tinggi menghadapi kesulitan pada
vertebrata.
Akibatnya, meskipun perlu konsensus tentang penanda untuk
penerapan universal barcode DNA, penggunaan gen yang
berbeda dalam kelompok organisme yang berbeda tampaknya
masuk akal. Telah dihipotesiskan bahwa universalCOI primer
dapat memungkinkan amplifikasi fragmen terminal 5 'dari
perwakilan sebagian besar filum hewan karena ketahanannya
[2]. Keberhasilan dalam pengkodean DNA lepidopteran dan
burung menunjukkan bahwa fragmen gen ini memang dapat
digunakan sebagai standar untuk banyak taksa hewan yang
lebih tinggi [2,4,7].
Dalam percobaan kami, kami membandingkan16Sprimer yang biasa
digunakan pada amfibi untukCOIprimer yang telah dikembangkan
http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5
terbuka untuk vertebrata lain [7] atau invertebrata [2]. Mungkin
saja, dengan beberapa upaya, untuk merancang primer yang
lebih berhasil dan konsisten dalam penguatanCOI dari amfibi.
Namun, hasil kami dari katak mantellid (Tabel 1, File tambahan
1) menunjukkan keberhasilan amplifikasi primer yang sangat
baik untuk beberapa spesies, tetapi kegagalan untuk spesies
lain yang terkait. Ini dan hasil kami pada variabilitas situs
priming memprediksi kesulitan besar dalam merancang satu
pasang primer yang andal akan memperkuat fragmen gen ini di
semua vertebrata, semua amfibi, atau bahkan semua
perwakilan dari setiap ordo amfibi. Satu set satu maju dan tiga
mundurCOIprimer telah berhasil digunakan untuk memperkuat
dan mengurutkan sejumlah besar spesies burung [7], tetapi
burung adalah clade yang jauh lebih muda daripada amfibi
dengan variabilitas mitokondria yang mungkin lebih rendah.
Optimalisasi lebih lanjut dariCOIamplifikasi juga dapat dicapai
mengenai protokol PCR. Di sini kami menggunakan protokol standar
yang hanya mengoptimalkan suhu anil, sedangkan protokol
touchdown yang lebih kompleks telah digunakan untuk burung dan
kupu-kupu [4,7]. Namun, satu persyaratan utama untuk penanda
kode batang DNA adalah ketahanannya terhadap kondisi lab yang
bervariasi. Jika kode batang DNA akan diterapkan sebagai standar di
banyak laboratorium yang berbeda, primer dan gen perlu dipilih
yang dapat memperkuat dengan andal di bawah kondisi yang
sangat berbeda dan di bawah protokol standar. Ini jelas berlaku
untuk16S, yang telah kami perkuat dengan suhu anil dan kondisi
PCR yang sangat berbeda dalam studi eksplorasi sebelumnya (hasil
tidak ditampilkan).
Penjajaran16Surutan rumit oleh prevalensi penyisipan dan
penghapusan, dan gen ini kurang bervariasi dariCOI[2]. Namun
demikian, hasil kami menunjukkan bahwa bahkan
menggunakan penyelarasan otomatis yang tidak kritis, gen ini
memiliki potensi yang lebih tinggi daripadaCOIuntuk
menetapkan urutan vertebrata ke tingkat kelas dan pesanan.
Itu16Sgen adalah penanda mitokondria yang sangat
terkonservasi tetapi mutasi umum terjadi di beberapa daerah
variabel, sesuai dengan loop dalam struktur RNA ribosom. Pada
amfibi, di mana banyak spesies adalah entitas yang relatif tua
[24], ini memastikan jumlah mutasi yang cukup di antara
spesies. Hasil kami untuk amfibi, dan pengalaman sebelumnya
dengan ikan, reptil, dan mamalia, menunjukkan bahwa16S
cukup bervariasi untuk secara jelas mengidentifikasi sebagian
besar spesies.
Gen mitokondria lebih lanjut yang telah banyak digunakan
dalam studi filogenetik dan filogenetik amfibi adalah
sitokrom b. Gen ini dapat dengan mudah diamplifikasi pada
salamander dan katak archaeobatrachian menggunakan
primer yang menyatu dengan gen tRNA yang berdekatan.
Namun, katak neobatrachian (sebagian besar spesies
amfibi) dicirikan oleh penataan ulang mitokondria
Halaman 9 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5
genom [25,26], dansitokrom bpada spesies ini berbatasan
langsung dengan wilayah kontrol. Meskipunsitokrom bprimer
tersedia yang bekerja di banyak neobatrachia [27,28], mereka
tidak sepenuhnya dapat diandalkan. Menurut pengamatan kami
sendiri pada katak mantellid, primer ini dapat mengamplifikasi
gen ini pada satu spesies tetapi gagal pada spesies lain yang
berkerabat dekat, mungkin karena mutasi di lokasi priming dan
mirip denganCOIprimer diuji di sini.
Sebaliknya,16Spasangan primer yang digunakan di sini dapat
dianggap benar-benar universal tidak hanya untuk amfibi tetapi
bahkan untuk vertebrata. Hal ini juga tercermin dari tingginya
jumlah amfibi16Surutan di Genbank (2620 hit untuk 16Svs. 483
hit untukCOI, sejak September 2004). Selain itu,16Sdan12Sgen
rRNA telah dipilih sebagai penanda standar untuk rekonstruksi
filogeni pada amfibi [29], yang akan mengarah pada kumpulan
data global yang hampir lengkap dari urutan 16S amfibi dalam
waktu dekat. Jika pengembangan perangkat genggam [14]
dipertimbangkan sebagai tujuan yang realistis, maka
universalitas dan ketahanan primer harus menjadi salah satu
karakteristik yang paling relevan dari gen untuk barcode DNA.
Ketika sampel yang dikumpulkan berisi perwakilan dari
berbagai taksa vertebrata yang lebih tinggi akan dianalisis,
risiko negatif palsu sangat meningkat dengan menurunnya
universalitas primer. Sebagai konsekuensinya kami
merekomendasikan penggunaan16Ssebagai penanda barcode
DNA standar tambahan untuk vertebrata, terutama untuk tetapi
tidak terbatas pada aplikasi yang melibatkan sampel yang
dikumpulkan.
Metode
Untuk menguji universalitas primer dan kondisi siklus, kami
melakukan eksperimen paralel di tiga laboratorium berbeda
(Berkeley, Cologne, Konstanz) menggunakan primer yang
sama tetapi produk biokimia dan thermocycler yang
berbeda, dan protokol yang sedikit berbeda.
Primer yang dipilih untuk16S[30] memperkuat fragmen ca.
550 bp (dalam amfibi) yang telah digunakan dalam banyak
studi filogenetik dan filogenetik dalam kelas ini dan kelas
vertebrata lainnya: 16SA-L, 5' - CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT
- 3'; 16SB-H, 5' - CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T - 3'.
UntukCOIkami menguji (1) tiga primer yang dirancang untuk
burung [7] yang memperkuat wilayah 749 bp di dekat ujung
5' gen ini: BirdF1, 5' - TTC TCC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC
- 3', BirdR1, 5 ' - ACG TGG GAG ATA ATT CCA AAT CCT G - 3',
dan BirdR2, 5' - ACT ACA TGT GAG ATG ATT CCG AAT CCA G -
3'; dan (2) sepasang primer yang dirancang untuk
arthropoda [2] yang mengamplifikasi fragmen 658 bp di
wilayah yang sama: LCO1490, 5' - GGT CAA CAA ATC ATA
AAG ATA TTG G - 3', dan HCO2198, 5'-TAA ACT TCA GGG TGA
CCA AAA AAT CA-3'. Urutan primer tambahan untukCOIyang
telah bekerja dengan baik pada mamalia dan
http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5
ikan disediakan dengan baik oleh PDN Hebert (komunikasi
pribadi pada tahun 2004) dan primer ini menghasilkan hasil
yang serupa (tidak ditampilkan).
Suhu anil optimal untukCOIprimer ditentukan
menggunakan thermocycler gradien dan ditemukan
49-50 °C; suhu anil 16S adalah 55 ° C. Fragmen yang
berhasil diamplifikasi diurutkan menggunakan berbagai
sequencer otomatis dan disimpan di Genbank. Nomor
aksesi untuk kumpulan data lengkap dari urutan
mantellid dewasa yang digunakan untuk penilaian
divergensi intra dan interspesifik (misalnya pada Gambar
5) adalah AY847959-AY848683. Nomor aksesi dari urutan
COI yang diperoleh adalah AY883978–AY883995.
Variabilitas nukleotida dinilai menggunakan perangkat lunak
DNAsp [31] diCOIdan16Ssitus priming dari genom
mitokondria lengkap berikut dari sembilan amfibi dan 59
vertebrata lainnya:Cephalochordata:AF098298,
Branchiostoma.Myxiniformes:AJ404477,Myxine.
Petromyzontiformes: U11880,Petromizon.Chondrichthyes:
AJ310140,Chimaera; AF106038,Raja; Y16067,Scyliorhinus;
Y18134,Squalus.Actinopterygii: AY442347,amia; AB038556,
Anguila; AB034824,Coregonus; M91245,Crossostoma;
AP002944,Gasterosteus; AB047553,Plecoglossus; U62532,
polipterus; U12143,Salmo.Dipnoi: L42813,Protopterus.
Coelacanthiformes: U82228,Latimeria.
Amfibi, Gymnophiona: AF154051,Typhlonectes. Amfibi,
Urodela: AJ584639,ambystoma; AJ492192, andrias;
AF154053,Mertensiella; AJ419960,ranodon. Amfibi,
Anura: AB127977,Buergeria; NC_005794, bufo;
AY158705;fejervarya; AB043889,rana; M10217, Xenopus.
Testudines: AF069423, NC_000886,Chelonia; krisemi;
AF366350,Dogania; AY687385,pelodiskus; AF039066,
Pelomedus.Squamata: NC_005958,abronia; AB079613,
Cordylus; AB008539,dinosaurus; AJ278511, iguana;
AB079597,Leptotyphlops; AB079242,Sceloporus;
AB080274,Shinisaurus.buaya: AJ404872,Caiman. Aves:
AF363031,jawaban; AY074885,Arenaria; AF090337,
Aythya; AF380305,Buteo; AB026818,Ciconia; AF362763,
Eudyptula; AF090338,Falco; AY235571,Gallus; AY074886,
hematpus; AF090339,Rhea; Y12025,kebenaran.mamalia:
X83427,Ornithorhynchus; Y10524,Makropus; AJ304826,
Vombatus; AF061340Artibeus; U96639,canis; AJ222767,
Cavia;AY075116,Dugong; AB099484,Echinops; Y19184,
Lama; AJ224821,Loxodonta; AB042432, Mus; AJ001562,
mioksus; AJ001588,Oryctolagus;
AF321050,Pteropus; AB061527,sakit tenggorokan; AF348159,
Tarsius; AF217811,tupai; AF303111,Ursus(untuk nama spesies,
lihat Genbank di bawah nomor aksesi masing-masing).
16Surutan sampel besar katak Madagaskar digunakan untuk
membangun database di Bioedit [32]. Urutan kecebong
dibandingkan dengan database ini menggunakan pencarian
BLAST lokal [33] seperti yang diterapkan di Bioedit.
Halaman 10 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5
kinerja dariCOIdan16Sdalam menetapkan taksa untuk clade
utama inklusif diuji berdasarkan fragmen gen yang homolog
dengan yang diperkuat oleh primer yang digunakan di sini
(lihat di atas), diekstraksi dari urutan mitokondria lengkap
dari 68 taksa vertebrata. Urutan disejajarkan dalam
Sequence Navigator (Biosistem Terapan) dengan algoritma
Clustal dengan penalti celah 50, penalti perpanjangan celah
10 dan pengaturan parameter ktup pada 2. PAUP* [34]
digunakan dengan algoritma tetangga-bergabung dan jarak
LogDet dan mengecualikan perbandingan berpasangan
untuk situs dengan celah. Kami memilih metode fenetik
sederhana ini daripada pendekatan kemungkinan
maksimum atau kekikiran maksimum karena mereka lebih
menuntut komputasi dan karena tujuan pengkodean batang
DNA adalah identifikasi taksa yang kuat dan cepat daripada
penentuan akurat dari hubungan filogenetik mereka.
Kontribusi penulis
MV merancang penelitian dan menyusun naskah. MT
melakukan bagian dari eksperimen PCR dan melakukan
identifikasi molekuler kecebong. AVDM dan DRV
melakukan bagian dari percobaan PCR. YC memberikan
hasil pada diferensiasi 16S di antara katak Madagaskar.
Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.
Material tambahan
File Tambahan 1
Ringkasan hasil percobaan amplifikasi, dan data rinci
divergensi antar dan intraspesifik pada katak mantellid.
Klik di sini untuk file [http://www.biomedcentral.com/content/
supplementary/1742-9994-2-5-S1.doc]
ucapan terima kasih
Untuk komentar, bantuan teknis dan/atau diskusi, kami berterima kasih
kepada Paul DN Hebert, Axel Meyer, Dirk Steinke, Diethard Tautz, dan David B.
Wake. Kami selanjutnya berhutang budi kepada Simone Hoegg, Pablo Orozco,
dan Mario Vargas yang memberikan bantuan di lab, dan kepada otoritas
Madagaskar untuk izin penelitian. Proyek pengkodean DNA pada berudu
Madagaskar didukung oleh hibah dari yayasan Volkswagen kepada MV dan
kepada Frank Glaw. DRV didukung oleh proyek AmphibiaTree (hibah NSF EF-
O334939).
Referensi
1. Floyd R, Eyualem A, Papert A, Blaxter ML:Barcode molekuler untuk
identifikasi nematoda tanah.Mol Ecol2002,11:839-850.
2. Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR:Identifikasi biologis
melalui barcode DNA.Proc R Soc Lond Ser B2003, 270:313-321.
(DOI 10.1098/rspb.2002.2218.)
3. Tautz D, Arctander P, Minelli A, Thomas RH, Vogler AP:Permohonan untuk
taksonomi DNA.Tren Ecol Evol2003,18:70-74.
4. Hebert PDN, Penton EH, Burns JM, Janzen DH, Hallwachs W:Sepuluh spesies
dalam satu: kode batang DNA mengungkapkan spesies samar pada
kupu-kupu nakhoda NeotropisAstraptes fulgerator.Proc Natl Acad Sci
USA2004,101:14812-14817.
http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5
5. Thomas M, Raharivololoniaina L, Glaw F, Vences M, Vieites DR:
Kecebong Montana di Madagaskar: identifikasi molekuler
dan deskripsi tahap larvaMantidactylus elegans,M.
madecassusdanBoophis laurentidari Andringitra Massif.
kopidi tekan.
6. Blaxter ML:Janji taksonomi DNA.Phil Trans Roy Soc Lond B2004,
359:669-679. (DOI 10.1098/rstb.2003.1447.)
7. Hebert PDN, Stoeckle MY, Zemlak TS, Francis CM:Identifikasi
burung melalui barcode DNA COI.PLoS Biologi2004,2:1-7.
8. Venter JC, Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D, Eisen JA,
Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson W, Fouts DE, Levy S, Knap AH,
Lomas MW, Nealson K, White O, Peterson J, Hoffman J, Parsons
R, Baden-Tillson H, Pfannkoch C, Rogers YH, Smith HO:Urutan
senapan genom lingkungan Laut Sargasso.Sains2004,304:
66-74.
9. Moritz C, Cicero C:Kode batang DNA: janji dan jebakan.PLoS
Biologi2004,2:1529-1531.
10. Wilson EO:Taksonomi sebagai disiplin dasar.Phil Trans R Soc
London B2004,359:739. (DOI 10.1098/rstb.2003.1440.)
11. Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR:Barcoding kehidupan hewan:
sitokrom c oksidase subunit 1 divergensi di antara spesies yang
berkerabat dekat.Proc R Soc Lond B (Pemasok)2003,270:S96-S99. (DOI
10.1098/rsbl.2003.0022.)
12. Rondon MR, PR Agustus, Betterman AD, Brady SF, Grossman TH, Liles
MR, Loiacono KA, Lynch BA, Macneil IA, Minor C, Tiong CL, Gilman
M, Osburne MS, Clardy J, Handelsman J, Goodman RM:Kloning
metagenom tanah: strategi untuk mengakses keragaman
genetik dan fungsional mikroorganisme yang tidak dikultur.
Appl Envir Mikrobiol2000,66:2541-2547.
13. Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, Merek TB, Gilbert MTP, Shapiro
B, Bunce M, Wiuf C, Gilichinsky DA, Cooper A:Catatan genetik
tumbuhan dan hewan yang beragam dari sedimen Holosen dan
Pleistosen.Sains2003,300:791-795.
14. Janzen DH:Sekarang saatnya.Phil Trans R Soc London B2004, 359:
731-732. (DOI 10.1098/rstb.2003.1444.)
15. Verheyen E, Salzburger W, Snoeks J, Meyer A:Asal usul ikan
cichlid superflock dari Danau Victoria, Afrika Timur.Sains
2003,300:325-329.
16. Albertson RC, Markert JA, Danley PD, Kocher TD:Filogeni dari clade
yang berkembang pesat: Ikan cichlid di Danau Malawi, Afrika
Timur.Proc Natl Acad Sci USA1999,96:5107-5110.
17. Thomas D, Guiller A, Clarke B:Divergensi ekstrim DNA
mitokondria dalam spesies siput tanah pulmonate.Proc R
Soc Lond Ser B1996,263:363-368.
18. DJ Funk, Omland KE:Paraphyly dan polyphyly tingkat spesies:
frekuensi, penyebab dan konsekuensi, dengan wawasan dari
DNA mitokondria hewan.Annu Rev Ecol Evol Syst2003,34:397-423.
19. Dubois A:Jalur perkembangan, spesiasi dan taksonomi
supraspesifik pada amfibi 1. Mengapa ada begitu banyak
spesies katak di Sri Lanka?Alytes2004,22:19-37.
20. Chiari Y, Vences M, Vieites DR, Rabemananjara F, Bora P, Ramilijaona
Ravoahangimalala O, Meyer A:Bukti baru untuk evolusi paralel
pola warna pada katak racun Malagasi (Mantella). Mol Ecol2004,
13:3763-3774.
21. Veith M, Kosuch J, Feldmann R:Uji kebenaran deklarasi spesies
kaki katak impor dari Indonesia ke Uni Eropa.Konservasi
Biodiv2000,9:333-341.
22. Machado CA, Hei J:Penyebab konflik filogenetik dalam klasik
Drosophilakelompok spesies.Proc Roy Soc London B2003,
270:1193-1202.
23. Palmer JD, Adams KL, Cho Y, Parkinson CL, Qiu YL, Song K: Evolusi
dinamis genom mitokondria tanaman: Gen dan intron seluler
dan tingkat mutasi yang sangat bervariasi.Proc Natl Acad Sci
USA2004,97:6960-6966.
24. Wilson AC, Maxson LR, Sarich VM:Dua jenis evolusi molekuler.
Bukti dari studi hibridisasi interspesifik.
Proc Natl Acad Sci USA1974,71:2843-2847.
25. Macey JR, Larson A, Ananjeva NB, Fang Z, Papenfuss TJ:Dua
pesanan gen baru dan peran replikasi untaian cahaya
dalam penataan ulang genom mitokondria vertebrataMol
Biol Evol1997,14:91-104.
26. Sumida M, Kanamori Y, Kaneda H, Kato Y, Nishioka M, Hasegawa
M, Yonekawa H:Urutan nukleotida lengkap dan penataan
ulang gen genom mitokondria katak kolam JepangRana
nigromaculata.Sistem Gen Gen2001, 76:311-325.
Halaman 11 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)
Perbatasan dalam Zoologi2005,2:5 http://www.frontiersinzoology.com/content/2/1/5

27. Bossuyt F, Milinkovitch MC:Radiasi adaptif konvergen di

Madagaskar dan katak ranid Asia mengungkapkan
kovariasi antara sifat larva dan dewasa.Proc Natl Acad Sci
USA2000, 97:6585-6590.
28. Vences M, Vieites DR, Glaw F, Brinkmann H, Kosuch J, Veith M, Meyer
A:Beberapa penyebaran luar negeri pada amfibi.Proc Roy Soc
London B2003,270:2435-2442.
29.Konsorsium Pohon Amfibi[http://www.amphibiatree.org ]
30. Palumbi SR, Martin A, Romano S, McMillan WO, Stice L, Grabowski G:
Panduan Orang Bodoh Sederhana untuk PCR, Versi 2.0.Diterbitkan
secara pribadi, Univ. Hawai; 1991.
31. Rozas J, Sánchez-DelBarrio JC, Messeguer X, Rozas R:DnaSP, analisis
polimorfisme DNA dengan metode penggabungan dan metode
lainnya.Bioinformatika2003,19:2496-2497.
32.Bioedit[http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html ]
33. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ:Alat pencarian
perataan lokal dasar.J Mol Biola1990,215:403-10.
34. Swofford DL:PAUP*. Analisis Filogenetik Menggunakan Parsimony (*
dan metode lainnya), versi 4beta10.Sunderland, MA: Sinauer; 2002.

Publikasikan denganbioMedPusatdan setiap

ilmuwan dapat membaca karya Anda secara gratis
"BioMed Central akan menjadi perkembangan paling signifikan
untuk menyebarluaskan hasil penelitian biomedis dalam hidup kita."
Sir Paul Nurse, Cancer Research UK

Makalah penelitian Anda akan:

tersedia gratis untuk seluruh komunitas biomedis yang ditinjau
dan diterbitkan segera setelah diterima
dikutip di PubMed dan diarsipkan di PubMed Central milik Anda —

Anda tetap memegang hak ciptanya

Kirimkan naskah Anda di sini: bioMedpusat

http://www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asp

Halaman 12 dari 12
(nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan)