LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA DASAR
MODUL 04
ANALISIS BIOINFORMATIKA PADA α-AMILASE Bacillus

Nama : Vergio Victorio E.

NIM : 10618064
Kelompok :5
Dosen : Sari Dewi
Tanggal Praktikum : 3 April 2020
Tanggal Pengumpulan : 10 April 2020

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2020
 ANALISIS BIOINFORMATIKA PADA α-AMILASE Bacillus

1.1. Tujuan Percobaan

Adapun tujuan yang ingin dicapai dari praktikum ini adalah:
1. Menentukan motif sekuens asam amino α-amilase dari Bacillus yang dianalisis.
2. Menentukan kekerabatan amilase baqA.
3. Menentukan primer untuk amplifikasi gen pengkode amilase baqA.

1.2. Teori Dasar

1.2.1. Bioinformatika
Pada zaman sekarang, data dihasilkan dalam jumlah besar dan diolah untuk
kepentingan riset dan informasi bagi publik. Salah satu data yang selalu diolah adalah
data-data terkait biologi molekuler. Bioinformatika menjadi suatu alat komputasi yang
dapat mengorganisasi, analisis, visualisasi, dan menginterpretasikan data-data tersebut
(Luscombe et al., 2001; Pevsner, 2015). Bidang-bidang yang terdapat di dalam
bioinformatika adalah penyejajaran sekuens, pemodelan homologi, filogenetika, studi
omik, biologi sistem, struktur, anotasi fungsional, dan prediksi struktur protein (Diniz &
Canduri, 2017)
1.2.2. Enzim α-Amilase
Enzim α-amilase (E.C.3.2.1.1) famili 13 (GH13) merupakan enzim dari golongan
hidrolase yang dapat menghidrolisis ikatan  α-D-1,4-glikosidik pada pati. Makna dari α
adalah konfigurasi dari gula yang dibebaskan dan bukan konfigurasi dari ikatan
glikosidik yang dihidrolisis. Enzim ini dapat ditemukan di mikroorganisme, tumbuhan,
bahkan hewan. Dalam proses hidrolisis pati, α-amilase adalah enzim yang menjadi
inisiator (van der Maarel et al., 2002). Ketika enzim ini menghidrolisis ikatan glikosidik
pada amilosa, produk yang dihasilkan adalah campuran oligosakarida dengan berbagai
panjang (6 – 8 unit glukosa) dalam konfigurasi α (Whitcomb & Lowe, 2007). Adapun
dalam campuran oligosakarida tersebut terdapat maltosa, glukosa, dan maltotetrosa.
Struktur tiga dimensi amilase dapat berikatan dengan substrat spesifik seperti pati
dan kofaktor dalam struktur tersebut adalah ion kalsium. Pada umumnya amilase
memiliki 512 asam amino dan memiliki massa 57,6 kDa. Pada enzim ini terdapat tiga
domain dengan motif tertentu. Domain dengan ukuran terbesar adalah A dengan motif
β/α. Domain B terletak di antara domain A dan C. Ikatan antara domain A dan B adalah
ikatan disulfida. Kofaktor enzim berupa ion kalsium terletak di antara domain A dan B
serta dapat bersifat sebagai gugus yang menstabilkan struktur enzim (Muralikrishna &
Nirmala, 2005).

Gambar 1. Struktur α-amilase, domain A: merah, domain B: kuning, domain C: ungu

1.2.3. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Prinsip kerja dasar PCR memanfaatkan proses siklus termal. Siklus perubahan
suhu tinggi dan rendah memampukan reaksi-reaksi tertentu terjadi pada suhu tertentu.
Pertama, akan terjadi denaturasi pada suhu 94°C atau lebih tinggi selama 15 detik sampai
2 menit. Denaturasi mengakibatkan untaian ganda pada DNA terbuka. Dengan
terbukanya untaian DNA, primer dapat menempel di DNA cetakan pada suhu 40 - 60°C
dan tahap ini kita sebut sebagai annealing. Setelah itu pada suhu 75°C DNA polimerase
akan mensintesis DNA sehingga terjadi elongasi. Hasil akhirnya adalah duplikasi DNA
cetakan secara eksponensial tergantung jumlah siklus termal yang ditentukan (Fermentas,
2019).
 Gambar 2. Diagram siklus termal PCR
Adapun di dalam metode ini digunakan beberapa bahan atau reagen dasar: DNA
template, nukleotida, PCR buffer, dan Taq polimerase. DNA cetakan adalah DNA yang
akan diamplifikasi dengan PCR. DNA cetakan ini dapat berbentuk plasmid, DNA genom,
atau bahkan jaringan. Kemudian primer adalah sebuah oligonukleotida pendek dengan
sekuens spesifik yang akan menjadi penanda daerah di DNA yang akan diamplifikasi.
Lalu nukleotida yang menjadi bahan dasar adalah dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP.
Selanjutnya PCR buffer diperlukan agar larutan berada dalam pH optimal untuk enzim
DNA polimerase dapat berfungsi. Sedangkan Taq adalah suatu DNA polimerase yang
diperoleh dari Thermus aquaticus karena mampu bertahan dalam suhu tinggi (Delong &
Zhou, 2017).
Walaupun replikasi DNA secara alami dan PCR memiliki kemiripan, yaitu sama-
sama perbanyakan DNA, tetapi tetap terdapat perbedaan. Perbedannya terdapat pada
mekanisme, suhu, tipe polimerase, dan panjang DNA. Mekanisme pada replikasi secara
alai dibantu oleh enzim helikase dan protein SSB sedangkan PCR memanfaatkan siklus
termal. Suhu untuk berlangsungnya replikasi DNA pada tubuh manusia adalah 37°C
sedangkan pada PCR suhu disesuaikan dengan tahapannya. Lalu tipe polimerase pada
replikasi secara alamiah adalah DNA polimerase, di PCR digunakan DNA polimerase
yang termostabil seperti Taq yang diperoleh dari archaebacteria (de Souza et al., 2013).

2.1. Software dan Situs Web

Berikut disajikan tabel berisi daftar alat dan situs yang digunakan untuk analisis.
Tabel 1. Alat dan bahan

Alat Situs Web

Laptop www.ncbi.nlm.nih.gov
Jaringan internet www.uniprot.org
Software SnapGene www.genome.jp/tools/clustalw
Software ClustalX/ClustalW www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

2.2. Cara Kerja

2.2.1. Penyejajaran Urutan Sekuens (MSA)
 Pertama, diunduh file FASTA sekuens asam amino dari baqA (GenbBank:
JN797599.1.). Kemudian dicari gen pengkode α-amilase dari genus Bacillus dengan
berbagai spesies, begitu juga dengan urutan asam amino baqA. Gunakan sebagai kata
kunci pencarian di website Uniprot. Diklik protein dan gen yang sesuai seperti pada
gambar dibawah, lalu simpan file fastanya (minimal 10 gen amilase dari spesies yang
berbeda). Lalu file FASTA disimpan di notepad. Selanjutnya dilakukan penyejajaran
dengan aplikasi ClustalW pada laman http://www.genome.jp/tools/clustalw/. File FASTA
yang telah dibuat di notepad di-copy dan di-paste ke kotak yang ada. Lalu proses
penyejajaran dilakukan dengan cara mengklik Execute Multiple Allignment.
2.2.2. Penentuan Kekerabatan Melalui Pendekatan Pohon Filogenetik
Setelah dilakukan penyejajaran, dibuat pohon filogenetik dengan cara mengklik
tab pada menu Setting. Setelah itu pertama dipilih opsi FasTree dan klik Exec untuk
mengeksekusi perintah. Kemudian akan keluar hasil seperti pohon filogenetik pada
umumnya. Sebagai perbandingan, dengan cara yang sama dipilih opsi phyML.
2.2.3. Desain Primer
Pertama dibuka laman https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
kemudian ke https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ dan dilakukan pencarian kode gen
amilase dari Bacillus aquimaris dengan kata kunci pencarian JN797559.1. Setelah itu
klik pPick Primers pada menu di samping kanan dan hilagkan tanda centang pada bagian
Specificity check. Lalu klik Get Primers untuk mendapatkan desain primer dan setelah
hasilnya keluar dapat dipilih sesuai dengan kebutuhan.
3. Hasil Pengamatan
3.1. Daftar Primer
Berikut adalah daftar primer yang diperoleh dari laman NCBI.
 Gambar 1 Analisis primer dengan SnapGene
3.2. Daftar Sekuens Asam Amino
Berikut adalah sekuens asam amino pengkode enzim α-amilase pada setiap organisme.
A. Bacillus aquamaris (baqA)
B. Paenibacillus polymyxa

C. Bacillus licheniformis

D. Bacillus amyloliquefaciens
E. Bacillus stearothermophilus

F. Bacillus circulans
G. Bacillus subtilis

H. Bacillus marisflavi

I. Bacillus vietnamensis

J. Bacillus salacetis
4. Pengolahan Data
4.1. Pohon Filogenetik
Berdasarkan hasil analisis MSA yang telah dilakukan, diperoleh dua pohon filogenetik
dengan pilihan FasTree dan phyML.

Gambar 2 Pohon filogenetik hasil FasTree

 Gambar 3 Pohon filogenetik hasil phyML
4.2. Penentuan Primer
Berdasarkan daftar primer yang diperoleh, dipilih primer 1 karena sesuai dengan kriteria
primer yang baik.
Forward primer: 5’-ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCA’-3’
Reverse primer: 5’-GCCTTCTTTTTTGGCGTTTAGTATT-3’
4.3. Motif pada Protein Amilase
 Gambar 4 Motif pada sekuens asam amino pengode alfa amilase

5. Pembahasan
5.1. Motif pada Sekuens Asam Amino Enzim α-Amilase Genus Bacillus
Motif protein adalah sekuens pendek yang conserved yang dapat berupa struktur
sekunder protein, atau kelompok residu protein yang terlibat dalam menjalankan suatu fungsi
tertentu. Contohnya motif helix-turn-helix yang ditemukan di seluruh DNA binding protein yang
meregulasi ekspresi gen yang terdiri atas kurang lebih 20 residu asam amino. Berikut adalah
motif yang ditemukan pada kesepuluh organisme yang berasal dari genus Bacillus.
Berdasarkan hasil penyejajaran dapat dilihat beberapa sekuens asam amino yang
cenderung lestari seperti yang ditandai dengan warna kuning dan memiliki panjang sekuens 5 –
20 asam amino. Sekuens-sekuens tersebut diduga merupakan motif lestari dari enzim α-amilase
dari genus Bacillus. Namun, setelah dicoba analisis dengan menggunakan program prediksi
domain dan motif dari NCBI dapat dilihat bahwa tidak terdeteksi motif khusus yang terdapat
pada kesepuluh organisme dari genus bacillus. Akan tetapi, dapat terlihat bahwa kesepuluh
organisme tersebut terdapat domain lestari berupa domain dari superfamily AmyAC yang
memiliki ukuran domain 300 – 400 asam amino.
 Gambar 5 Analisis domain superfamily AmyAC dengan NCBI

5.2. Pohon Filogenetik dan Kekerabatan Amilase baqA

Secara umum, phyML terdapat pengulangan bootstrap sebanyak n kali, tetapi tidak
dengan fastree. Pengulangan-pengulangan tersebut akan menghasilkan hasil yang lebih akurat
dan dari nilai bootstrap menunjukkan pohon yang sama setelah n kali pengulangan. Untuk hasil,
phyML lebih dapat dipercaya daripada fastree.
Secara urutan organisme terdapat perbedaan posisi organisme P. polymyxa dan B.
megaterium. Pada hasil analisis filogenetik dengan fastree diperoleh B. megaterium teletak pada
klad yang lebih besar, sehingga berbeda dengan hasil analisis meggunakan phyML.
Kemudian panjang cabang (branch length) dapat memberikan informasi seberapa besar
perubahan yang telah terjadi. Semakin panjang cabangnya berarti spesies tersebut lebih “baru”
dibandingkan dengan spesies yang lain. Organisme-organisme yang dapat diperhatikan
perbedaannya di satu pohon dengan pohon lainnya adalah B. subtilis dengan bakteri lainnya, B.
megaterium dan B. polymyxa, dan B. licheniformis dengan B. amyloliquefaciens.
Berdasarkan dari kedua filogram tersebut dapat dilihat protein α-amilase baq A pada
bakteri B. aquamaris memiliki kekerabatan dengan α-amilase yang terdapat pada klad dengan
anggota B. vietnamensis dan B. marisflavi. Sebab, ketiga organisme tersebut diduga berasal dari
satu nenek moyang dengan sekuens asam amino pengkode α-amilase yang serupa.
5.3. Primer baqA
Adapun terdapat beberapa kriteria yang diperhatikan dalam primer yang baik untuk
digunakan di PCR: panjang basa primer, GC content, keberadaan struktur sekunder, ∆G, Ta
(annealing temperature) dan Tm (melting temperature). Pertama, panjang basa primer yang ideal
adalah sebanyak 17 – 28 basa agar primer yang dibentuk spesifik produknya. Kedua, GC content
adalah jumlah ikatan antara basa guanin dan sitosin dalam primer, jumlah idealnya adalah 40-
60% agar struktur primer tetap rigid dan stabil, tetapi reaksinya tetap spontan. Ketiga,
keberadaan struktur sekunder seperti hairpin, self dimer, dan cross dimer dapat mengganggu
proses pembentukan rantai DNA yang baru, jadi diharapkan tidak terlalu banyak struktur
sekunder tersebut. Keempat, ∆G memiliki batas -2kcal/mol agar hairpin tidak spontan terbentuk.
Kelima, Ta adalah suhu ketika primer dapat mengikat DNA dan biasanya lebih rendah 4 - 6℃
dari Tm. Lalu, Tm merupakan suhu ketika 50% dari dupleks DNA terdisosiasi dan menjadi
indikator stabilitas DNA. Pada umumnya suhunya berkisar di antara 52 - 58℃.
Primer yang diperoleh dengan bantuan aplikasi SnapGene adalah sebagai berikut
Forward primer: 5’-ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCA’-3’
Reverse primer: 5’-GCCTTCTTTTTTGGCGTTTAGTATT-3’
Akan tetapi, konten Gcnya kurang dari 40%, yaitu untuk primer forward sebesar 32% dan primer
reverse sebesar 36%. Digunakannya aplikasi ini untuk memperoleh desain primer karena pada
aplikasi NCBI hanya diperoleh amplikon dengan jumlah maksimum sebesar 700 bp yang
terhitung terlalu sedikit. Padahal minimum amplikon dari amilase baqA adalah 1,5 kbp karena
domain asam aminonya 300 – 400 asam amino, sehingga basanya diprediksi sekitar 1.500 bp.
Jadi digunakan primer dari hasil analisis yang menghasilkan minimum 1,5 kbp.

6.1. Kesimpulan
Adapun berdasarkan hasil praktikum yang diperoleh dapat disimpulkan:
1. Terdapat beberapa motif sekuens asam amino α-amilase dari Bacillus yang dianalisis,
tetapi tidak diketahui jenisnya.
2. Amilase baqA dari Bacillus aquamaris memiliki kekerabatan dekat dengan Bacillus
vietnamensis dan Bacillus marisflavi.
3. Primer yang dapat digunakan untuk amplifikasi gen pengkode amilase baqA adalah
forward primer: 5’-ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCA’-3’ dan reverse primer: 5’-
GCCTTCTTTTTTGGCGTTTAGTATT-3’.

4.
 DAFTAR PUSTAKA

de Souza, É.R., Lewis, G.P., Forest, F., Schnadelbach, A.S., van den Berg, C. and de Queiroz,
L.P., 2013. “Phylogeny of Calliandra (Leguminosae: Mimosoideae) based on nuclear
and plastid molecular markers”. Taxon. 62(6): 1201 – 1220.
Delong, R.K. & Zhou, Q. 2017. Introductory Experments on Biomolecules and Their Interaction.
Kansas: Kansas State University.
Diniz, W.J.S, Canduri, F., 2017. Bioinformatics: An overview and its applications. Genetics and
Molecular Research. 16 (1). (gmr16019645).
Fermentas. 2019. “Protocols and Recommendations for DNA Electrophoresis”.
http://res.hmu.edu.iq/Portals/0/Users/Bazhdar/DNA_Troubleshooting.pdf. Diakses 14
November 2019.
Luscombe, N.M., Greenbaum, D., Gerstein, M. 2001. What is bioinformatics? A proposed
definition and overview of the field. Methods of Information in Medicine. 40: 346–358.
Muralikrishna, G., & Nirmala, M. 2005. Cereal α-amylases—an overview. Carbohydrate
polymers. 60(2): 163-173.
Pevsner, J., 2015. Bioinformatics and Functional Genomics, third ed. Chichester: John Wiley &
Sons Inc.
Van Der Maarel, M. J., Van der Veen, B., Uitdehaag, J. C., Leemhuis, H., & Dijkhuizen, L.
2002. Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase
family. Journal of biotechnology. 94(2): 137-155.
Whitcomb, D. C., & Lowe, M. E. 2007. “Human Pancreatic Digestive Enzymes”. Digestive
Diseases and Sciences. 52(1): 1–17.