Praktikum 2

Modul 3.2
Asisten Mikrobiologi 2022
Pendahuluan
Pemeriksaan serologi merupakan salah satu metode dalam mencari penyebab infeksi dengan dasar reaksi imunologi
atau ikatan spesifik antara antigen dan antibodi yang sifatnya spesifik.

Pemeriksaan imunologi dalam diagnosis imunologis infeksi, pada dasarnya dapat digunakan untuk mendeteksi
adanya antigen dari agen penyebab infeksi atau antibodi yang terbentuk oleh tubuh dalam responya terhadap
agen penyebab infeksi. Karena yang digunakan sebagai bahan pemeriksaan adalah serum, maka pemeriksaan ini
sering disebut sebagai pemeriksaan serologi.

Pada kasus infeksi, tubuh akan membentuk protein spesifik, yaitu antibody, yang segera akan diedarkan dalam cairan
darah. Antibodi yang sering digunakan sebagai indikator adanya infeksi oleh agen tertentu adalah IgG dan IgM.
Produksi IgG dan IgM mempunyai pola tertentu dalam responnya terhadap infeksi (lihat gambar), sehingga perlu
strategi khusus dalam menetapkan jenis antibodi yang diperiksa maupun dalam menginterpretasikan hasilnya.

Prinsipnya, sekitar seminggu setelah infeksi, akan terdeteksi antibodi dalam cairan darah penderita. Antibodi yang
terbentuk terutama darah IgG dan IgM.

IgM adalah jenis antibodi yang terbentuk segera setelah terjadi infeksi, tetapi kadarnya tidak terlalu lama dalam darah,
sehingga sering disebut sebagai antibodi fase akut.

IgG pada infeksi pertama akan terbentuk beberapa hari kemudian setelah IgM, tetapi bertahan lebih lama dalam aliran
darah, sampai beberapa bulan. Respon pembentukan IgG ini berbeda pada kasus infeksi ulang atau infeksi paska
imunisasi, dimana akan terjadi pembentukan IgG dengan jumlah yang sangat besar dalam waktu yang sangat cepat,
mendahului pembentukan IgM yang tidak mempunyai perbedaan pola pembentukannya, baik infeksi primer maupun
infeksi ulangan.
 Interpretasi
1. Hasil IgM (+) → infeksi yang baru saja terjadi (± 1 bulan terakhir)
2. Hasil IgG atau Ig total (+) → infeksi yang baru saja terjadi bila didapatkan
salah satu:
a. Pada pemeriksaan kuantitatif didapatkan hasil yang lebih tinggi
dibandingkan populasi normal.
b. Terjadi peningkatan titer ≥ 4x kadar antibodi fase penyembuhan
dibandingkan dengan kadar antibody yang diambil pada fase akut.
c. Adanya serokonversi, yaitu hasil negative pada pemeriksaan pertama,
menjadi positif pada pemeriksaan yang dilakukan beberapa waktu
kemudian.
01
TES TUBEX
pemeriksaan semikuantitatif dalam
mendeteksi antibodi jenis IgM anti LPS
O-9 kuman Salmonella typhi penyebab
penyakit demam Tifoid.
 Prinsip Tes Tubex
● Reaksi negatif

Apabila tidak terdapat human Ab IgM Salmonella thypi dalam sampel serum →
partikel indikator yang berlabel M ab LPS-O9 akan langsung berikatan dengan
partikel magnetik Ag LPS O9 → mengalami ko sedimentasi → akan terlihat perubahan
warna dari biru ke merah atau pink

● Reaksi positif

Bila terdapat human Ab IgM IgM Salmonella thypi dalam sampel serum → akan
menghambat ikatan antara M ab LPS-O9 dengan partikel magnetik Ag LPS O9 →
ikatan Ab IgM Salmonella thypi dengan Ag LPS O9 akan ko sedimentasi → dilihat
perubahan warna menjadi biru (kepekatan tergantung banyaknya konsentrasi Ab IgM
Salmonella yang ada)

● Hanya deteksi antibodi IgM saja

● Metode dinamakan IMBI (Inhibition Magnetic Binding Immunoassay)
Hasil positif (+) ⇒ biru tetep biru, negatif (-) ⇒ biru jadi merah
 Tes Tubex
a. Jenis material : serum/plasma heparin
b. Bakteri : S. enterica serotype Typhi
c. Antigen : lipopolisakarida O9 → hanya mendeteksi IgM
d. Prinsip : tejradinya reaksi silang dg Salmonella sp lain serogrup D
e. Reagensia: Kit pemeriksaan yang terdiri atas
i. TUBEX® Brown Reagent: suspensi yang berisi partikel yang dilapis antigen.
ii. TUBEX® Blue Reagent: suspensi yang berisi partikel yang dilapis antibodi.
iii. TUBEX® Negative Control: suspensi yang berisi buffer protein.
iv. TUBEX® Positive Control: suspensi yang berisi antibodi kontrol positif.
v. TUBEX® Reaction Well Strip: 6 reaksi/strip, sekali pakai.
vi. TUBEX® Sealing Tape: sekali pakai.
vii. TUBEX® Colored Sticker.
f. Peralatan :
i. TUBEX® Color Scale.
ii. Mikropipet
iii. Vortex
iv. Timer.
 Tes Tubex
● Prosedur
○ Persiapkan semua reagen dan sampel pada suhu kamar. Vortex atau kocok
semua reagen sehingga homogen sebelum dipakai.
○ Tempatkan TUBEX® Reaction Well Strip di atas meja, dengan nomor well
(sumuran) menghadap ke depan.
○ Tuangkan 45 µl TUBEX® Brown Reagent untuk masing - masing sumuran.
○ Tambahkan 45 µl sampel, Tubex kontrol positif atau Tubex kontrol negatif pada
sumuran yang sesuai. Campur hati-hati dengan memipet ke atas dan ke bawah
10 X. Cegah gelembung. Gunakan pipet yang berbeda untuk masing - masing
sampel. 5. Inkubasi pada suhu kamar selama 2 menit.
○ Tambahkan 90 µl TUBEX® Blue Reagent untuk masing - masing sumuran.
○ Tutup TUBEX® Reaction Well Strip dengan TUBEX® Sealing Tape dengan
menekan bagian keras tape pada plastik untuk mencegah tumpah.
○ Campur reagen dengan cara memegang ujung – ujung TUBEX® Reaction Well
Strip dengan ibu jari dan jari telunjuk.
 Tes Tubex
● Prosedur (lanjutan)
○ Gerakkan TUBEX® Reaction Well Strip secara horisontal (90o ) sampai mencapai permukaan
sumuran secara maksimal.
○ Gojok TUBEX® Reaction Well Strip secara cepat ke depan dan ke belakang selama 2 menit.
Yakinkan isinya mengalir mencapai batas permukaan sumuran
○ Tempatkan TUBEX® Reaction Well Strip pada TUBEX® Color Scale sedalam mungkin. Biarkan 5
menit untuk mendapatkan supernatan yang terang.
 Tes Tubex
Interpretasi Hasil

○ Pembacaan dan skoring dilakukan dengan

membandingkan warna masing - masing supernatan
sampel terhadap TUBEX® Color Scale.
○ Baca pada penerangan cukup dalam 30 menit setelah
separasi. Skoring sesuai tabel di samping.
 02
TES WIDAL
- Untuk mengetahui titer antibodi
penderita terhadap bakteri Salmonella
typhi dan Salmonella paratyphi Prinsip
- Membantu diagnosis demam typhoid aglutinasi (pembentukan kompleks
antigen-antibody dalam bentuk partikel
karena interaksi antara antigen yang
tidak terlarut dengan antibodi yang
terlarut)
Jenis Material : Serum

Reagensia : Suspensi Antigen S. typhi H (widal SS-01), Murex

- S. typhi O (Widal SS-09), Murex

- S. paratyphi A-H (Widal SS-02), Murex
- S. paratyphi A-O (Widal SS-11), Murex
- S. paratyphi B-H (Widal SS-03), Murex
- S. paratyphi B-O (Widal SS-12), Murex
 Prosedur :

1. Pipet 20 serum pada tetesan obyek gelas, lalu tambahkan 1 (satu) tetes masing-
masing antigen Salmonella dengan memakai pipet pada botol reagen.
Titer = 1 : 80.
Campur dengan ujung obyek gelas dan goyangkan selama 1 (satu) menit tepat
(dengan stop watch).
1. Baca/amati terjadinya aglutinasi dibawah mikroskop dengan lensa obyektif 10 X.
2. Pembacaan harus dilakukan tepat 1 (satu) menit, untuk menghindari terjadinya positif
Palsu.
3. Bila pada titer 1 : 80 tersebut aglutinasi/positif, maka dilanjutkan pengenceran sebagai
berikut :
 Slide agglutination

Positif : terbentuk partikel aglutinasi

Negatif : tidak terbentuk partikel aglutinasi
Faktor-faktor yang mempengaruhi titer
aglutinin Widal (Batasan Uji Widal)
- Vaksinasi tifoid sebelumnya
- Reaksi silang dengan penyakit lain (co.infeksi Salmonella non tifoid,
malaria, penyakit liver kronik, kelainan imunologi, dll)
- Pemakaian antibiotik
- Endemisitas regio setempat
- Infeksi tifoid yang telah lalu
 03
Tes VDRL
Pemeriksaan VDRL merupakan pemeriksaan
serologis untuk mengetahui titer reagin Pemeriksaan Sifilis
(antibodi non-treponema) penderita terhadap 1.Non Treponemal test
cardiolipin. RPR, VDRL

Pemeriksaan VDRL berguna dalam 2.Treponemal test

membantu diagnosis dan monitoring terapi TPHA, TPPA
penyakit sifilis
 Jenis Material : Serum

Reagensia : 1. VD – 24 (Carbon Antigen), Murex

2. NaCI fisiologis

a. Kualitatif → deteksi awal ada tidaknya antibodi terhadap bakteri T. pallidum.

1. Pipet 50 serum pada slide
2. Tambahkan 20 Carbon Antigen
3. Putar dengan shaker / Rotator 180 rpm selama 4 (empat) menit
4. Amati terjadinya aglutinasi secara mikroskopis. Bila terjadi aglutinasi pada pemeriksaan kualitatif,
lanjutkan dengan pemeriksaan kuantitatif
b. Kuantitatif → Test kuantitatif dilakukan setelah didapatkan hasil reaktif pada test kualitatif
1. Buat pengenceran serial mulai 1 : 2, 1 : 4, dst

2. Dari masing-masing pengenceran tersebut pipet 50 pada slide dan tambahkan 20 antigen
3. Putar dengan shaker / rotator seperti diatas.
4. Lihat reaksi aglutinasi (flokulasi) berupa gumpalan berbentuk jarum dengan mikroskop.
04
Tes TPHA
 Definisi Pemeriksaan TPHA
Pemeriksaan serologis untuk mengetahui titer antibodi penderita
terhadap bakteri Treponema pallidum yang berguna dalam membantu
diagnosis penyakit Syphillis.

Dasar reaksinya adalah hemaglutinasi yang merupakan reaksi antara

antibodi anti treponema dengan reagen yang mengandung eritrosit
burung yang dilapis dengan antigen T. pallidum patogen (strain
Nichol’s).

Material : Serum

Peralatan :

1. Mikropipet ukuran 10:25:15 dan 190μl.

2. Plat mikrotitrasi U-Well.

 Reagensia
1. Test Cells: sel eritrosit burung yang disensitisasi antigen T. pallidum.

2. Kontrol sel: suspensi dari eritrosit burung.

3. Diluent.

4. Serum kontrol positif (pengenceran 1:20). Ekivalen dengan titer

1/640/2560 pada tes kuantitatif.

5. Serum kontrol non-reaktif (pengenceran 1:20)

 Prosedur (Metode Kualitatif)
1. Setiap tes memerlukan 3 well mikrotitrasi. Beri label 1 – 3.

2. Teteskan 190μl diluent pada well 1.

3. Teteskan serum 10μl pada well 1.

4. Dengan menggunakan mikropipet, campur larutan pada well 1, kemudian

pindahkan sebanyak 25μl ke well 2 dan well 3.

5. Campur isi well secara hati-hati hingga merata.Inkubasi selama 45 – 60 menit

pada suhu kamar.Inkubasi selama 45 – 60 menit pada suhu kamar.

6. Perhatian: hindari plat dari panas, sinar matahari dan goncangan.

7. Pembacaan hasil: hasil tetap stabil dalam 24 jam bila plat tertutup rapat dan
ditempatkan sesuai prosedur.
 Prosedur (Metode Kuantitatif)
1. Setiap sampel membutuhkan 8 well mikrotitrasi. Beri label A – H.

2. Teteskan 25μl diluent pada well B sampai H.

3. Pindahkan 25μl serum yang diencerkan 1:20 pada tes penyaring ke well A dan B.

4. Ambil 25μl diluent serum dari well B dan secara serial dilakukan pengenceran dan pencampuran dari well B
sampai H dengan cara pengambilan aliquot 25μl, dan terakhir buang 25μl diluen serum dari well H.

5. Pastikan Test Cells homogen. Tambahkan 75μl Test Cells ke dalam well A sampai H. Langkah ini akan
memberikan hasil pengenceran 1:80 pada well A sampai 1/10240 pada well H.

6. Goyang plat secara hati-hati untuk mencampur larutan yang ada dalam well.

7. Inkubasi 45 – 60 menit pada suhu kamar.

8. Perhatian: hindari plat dari panas, sinar matahari dan goncangan.

9. Pembacaan hasil: hasil tetap stabil dalam 24 jam bila plat tertutup rapat dan ditempatkan sesuai prosedur.
Pembacaan Hasil Tes TPHA
05
PEMERIKSAAN
DENGUE
 Dengue Duo Cassette Panbio
● Pemeriksaan kualitatif untuk deteksi antibodi IgG dan IgM pada serum,
plasma, atau darah lengkap terhadap antigen virus Dengue
● Jenis material ⇒ serum sentrifugasi, plasma tanpa sentrifugasi, darah
fingertip
● Deteksi dan diferensiasi IgG dan IgM.
● Pada infeksi primer, serum antibodi IgM muncul pada hari ke-3 onset demam
→ terdeteksi 4-5 hari setelah onset demam → menetap 3-8 bulan
● IgG terbentuk pada hari ke-7 dan menetap sampai 2 tahun
● Kit pemeriksaan:
- Test cassete
- Mikropipet 10 mikroliter
- Larutan buffer
- + Timer (Alat)
 Prosedur
1. Pengambilan sampel (darah fingertip, serum.plasma) dengan pipet
MicroSafe®dengan cara memegang pipet secara horisontal atau mikropipet.
2. Untuk mengambil sampel ujung pipet pada sampel, tekan balon pipit secara hati-
hati untuk menarik sampel masuk.
3. Plat mikrotitrasi U-Well.
4. Siapkan cassete letakkan secara horisontal di meja.
5. Teteskan 10μl sampel pada sumuran bulat dengan mikropipet atau pipet
MicroSafe®
6. Pegang botol buffer secara vertikal. Teteskan 2 tetes cairan buffer dengan
ketinggian 2 cm pada sumuran kotak di dasar kaset.
7. Baca hasil 15 menit setelah penambahan buffer.
8. Munculnya garis tranversal berwarna merah muda pada sumuran tes menunjukkan
hasil positif.
06 ● Pemeriksaan aglutinasi latex
~> mendeteksi antibodi (IgM
LEPTOTEK & IgG) pada serum orang
terinfeksi Leptospira.
DRI DOT ● Mengandung partikel latex
berwarna yang dikeringkan
pada kartu aglutinasi.
Jenis spesimen : Serum

Reagensia : Lepto-Ag: LeptoTek Dri Dot cards: partikel latek berwarna yang
dilapisi dengan ekstrak Leptospira strain Lely 607 pada penyangga.
Perlatan : 1. Spatula.
2. Mikrotiter 10 µl.
3. Pipet disposibel.
Prosedur :
1. Buka LeptoTek Dri Dot cards, letakkan di atas meja dgn bintik biru
menghadap ke atas.
2. Teteskan 10 µl serum di bintik biru dalam area yang dibatasi dengan
lingkaran garis hitam.
3. Pegang spatula dgn ibu jari dan jari telunjuk dgn bagian yang datar
menghadap ke bawah.
Prosedur :
4. Campur serum dengan antigen pada bintik biru
● Dengan cara menggerakkan spatula dengan
gerakan memutar.
● Jangan sampai menyebarkan susupensi ke
luar area yang dibatasi dengan garis lingkaran
biru.
5. Jaga kartu pada posisi mendekati horisontal ~>
gerakkan pelan-pelan sehingga suspensi cairan
bergerak dengan gerakan memutar u/ mencampur
lebih lanjut latex dan serum sampel sekalian
menginduksi aglutinasi.
6 Baca hasil 30 detik setelah pencampuran
Pembacaan hasil :
1. Reaktif kuat : terlihat
gumpalan aglutinasi kasar
2. Reaktif lemah : terlihat
gumpalan aglutinasi halus.
3. Non-reaktif : tidak terlihat
gumpalan aglutinasi kasar.
Catatan :
● Rapid test untuk leptospira
juga ada dalam bentuk
lateral flow.
● Cara pemeriksaannya dan
pembacaannya hampir sama
rapid test untuk dengue.