LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

ELEKTROFORESIS

Tanggal Praktikum : Kamis, 13 Oktober 2022

Rombel : Pendidikan Biologi A 2020

Nama/NIM : Alifia Rizky Agustiana/4401420002

PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2022
A. Tujuan
1. Memvisualisasi DNA hasil isolasi pada elektroforesis gel agarose 0,8%
B. Landasan Teori

Isolasi DNA merupakan proses dengan tujuan untuk memperoleh DNA murni,
yaitu tanpa protein maupun RNA dari suatu sel dalam jaringan. Salah satu cara untuk
mengetahui apakah isolasi DNA berhasil adalah dengan melalui beberapa proses,
diantaranya adalah melalui pengecekan keberadaan DNA salah satunya dengan
metode elektroforesis (Phillips et al., 2012). Berdasarkan Harahap (2018).
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan yang memanfaatkan medan listrik
yang dihasilkan dari elektroda-elektroda untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
memiliki muatan berupa kation ataupun anion. Elektroforesis membutuhkan media
pemisah berupa fase diam seperti sel Agarosa yang tercampur larutan buffer untuk
menjaga kondisi keasaman sampel saat proses pemisahan. Alat ini sangat mendukung
keterbaruan penelitian khususnya dibidang teknologi rekayasa genetika. Hasilnya
akan memberikan rekam jejak berupa pita-pita pemisahan senyawa. Kecepatan gerak
molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung
pula pada bentuk molekulnya.

Elektroforensis memiliki prinsip dasar pergerakan molekul bermuatan atau ion

melalui medium semi solid di bawah pengaruh suatu medan listrik. Ukuran DNA
dapat diketahui melalui elektroforesis dengan menggunakan DNA marker yang sudah
diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pembanding sehingga bisa
diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Jika molekul yang bermuatan negatif
(DNA) dilewatkan melalui gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif, sehingga elektroforesis dapat memisahkan DNA berdasarkan
ukuran panjangnya (Yuwono, 2006 dalam Sundari & Priadi, 2020).

Secara prinsip, elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan

sampel DNA berdasarkan ukuran berat molekul dan struktur fisik molekulnya. Gel
yang biasa digunakan salah satunya agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat
dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga
20.000 pasang basa (bp) (Pramono, 2012). Terdapat pula gel poliakrilamid yang dapat
 memisahkan DNA berukuran kecil sekitar 6-2000 pasang basa (Retnoningsih &
Susanti, 2022)

C. Alat dan Bahan

Alat
1. Erleyer
2. Microwave
3. Mesin elektroforesis (chamber, sisir dan power supply)
4. Gel doc (UV transilluminator)
5. Micropipet
Bahan
1. Agarose
2. Tris acetic acid EDTA (TAE) 1x
3. Florosafe
4. Loading dye
D. Cara Kerja
E. Hasil dan Pembahasan
Langkah awal pada tahap elektroforesis adalah dengan melarutkan 0.4 gram
agarose ke dalam 50ml Tris Acetic Acid EDTA (TAE) 1X. Massa agarose yang
dilarutkan pada pembuatan gel elektroforesis bergantung pada DNA yang hendak
dimonitoring. Besarnya konsentrasi gel berbanding terbalik dengan ukuran DNA.
Semakin kecil ukuran DNA maka memerlukan gel dengan konsentrasi yang tinggi.
Sedangkan makin besar ukuran DNA diperlukan gel dengan konsentrasi yang rendah.
Fungsi TAE sebagai pelarut tidak lain digunakan sebagai buffer atau penyangga
ketika kondisi proses menjadi lebih panas dari sebelumnya.
Setelah dilarutkan, larutan kemudian dipanaskan dalam microwave selama 3
menit hingga larutan jernih. Larutan didinginkan sehingga suhunya sama dengan suhu
kuku. Larutan yang telah dingin dicampur dengan 3 µl florosafe dan dihomogenkan.
Florosafe digunakan untuk mewarnai sehingga terlihat dengan jelas visualisasi DNA.
Penambahan yang dilakukan saat suhu mulai dingin dimaksudkan agar florosafe tidak
menguap dan menjadi racun ketika ditambahkan saat suhu larutan masih panas.
Larutan agarose selanjutnya dicetak dengan dituangkan pada cetakan gel yang
telah dipasangi sisir dan dibiarkan membeku. Pencetakan dengan pemasangan sisir
digunakan agar nantinya pada gel terdapat sumur-sumur sebagai tempat DNA.
Setelah larutan gel agarose membeku selanjutnya dimasukan kedalam bak
elektroforesis dan diisi dengan larutan buffer TAE 1x yang berfungsi sebagai
penyetabil panas dalam proses running elektroforesis nantinya dan supaya gel agarose
tidak bergerak. Ketika dalam bak elektroforesis sudah diberikan gel dan larutannya
setelahnya adalah memasukkan DNA sebanyak 5µl yang terlebih dahulu ditambah
dengan 1µl loading dye. Loading dye ditambahkan sebagai pemberat ketika nantinya
DNA dimasukan kedalam sumur tidak keluar dan bias tercampur dengan larutan
buffer. Yang kedua loading dye juga berfungsi sebagai pewarna ketika nanti dalam
proses pengamatan menggunakan UV transluminator. Ketika memasukan larutan
DNA yang sudah tercampur loading dye kedalam sumur usahakan posisi mikropipet
tegak lurus dari atas supaya meminimalisir rusaknya sumur akibat tertusuk oleh
mikropipet.
Setelah semua DNA dimasukkan kedalam sumur tahap selanjutnya
menjalankan atau istilah running dengan 100volt selama 20 menit, hal ini disesuaikan
dengan berat molekul DNA. Ketika sudah selesai running nanti akan terlihat hasilnya
berupa pita warna cerah pada gel agarose.
 Figure 1. Hasil Elektroforesis

Gambar diatas menunjukan hasil elektroforesis dimana ada 15 DNA dan 5

DNA atau sumur dari kiri merupakan DNA mikroba lalu 5 ditengah adalah DNA
hewan dan yang paling ujung kanan adalah DNA tumbuhan. pada mikroba DNA tidak
dapat dilihat yang menampilkan hasil negatif lalu pada hewan terlihat dengan sangat
jelas walaupun ada smear dan pada tumbuhan juga terlihat walaupun tidak sejelas
dengan yang ada pada hewan.
Elektroforesis gel adalah cara untuk memvisualisasikan sampel yang dicerna
dari molekul kecil seperti DNA dan memperkirakan ukuran fragmen tersebut. Namun
saat melakukan elektroforesis, hasil terkadang diikuti oleh smear. Adanya smear yang
terdapat pada hasil elektroforesis DNA genom menandakan adanya kontaminan.
Smear terbentuk karena menunjukkan degradasi DNA genom. Degradasi bisa terjadi
selama proses ekstraksi dan bukan selama elektroforesis.
Smear dapat muncul karena beberapa faktor antara lain persiapan gel agarose
kurang sempurna, terlalu banyak sampel isolat yang digunakan, dan kualitas sampel
yang buruk. Persiapan gel agarose kurang sempurna dapat memunculkan smear
karena hasil gel akan tidak rata, padahal gel yang bagus dapat berpolimerisasi secara
merata, menghasilkan matriks yang seragam di seluruh gel dalam baki pengecoran.
Jika bagian gel – biasanya bagian bawah – mengendap sebelum seluruh bahan
dituangkan, gel yang dihasilkan akan menjadi tidak rata dan menghasilkan hasil yang
ternoda.
 Terlalu Banyak Sampel Sebelum memasukkan sampel ke dalam sumur,
sampel tersebut harus cukup encer untuk mengalir melalui gel tanpa meluap ke dalam
sumur. Jika sampel yang dimuat terlalu pekat karena tidak diencerkan atau
menggunakan faktor pengenceran yang tidak tepat, fragmen akan terlalu besar untuk
sumur dan menghasilkan smear. Kualitas sampel yang buruk juga dapat
memunculkan smear. Misalnya, sampel DNA yang terkontaminasi protein atau
mengandung terlalu banyak garam dapat menimbulkan noda. Sampel yang
terdegradasi atau terdenaturasi juga memberikan hasil yang buruk, termasuk pita
smear. Persiapan hati-hati dari gel dan sampel meminimalkan kemungkinan smear
dan menghasilkan pita bening yang ideal untuk interpretasi ilmiah.
Hasil praktikum menunjukkan hanya smear yang muncul di gel agarose. Dari
15 sampel untuk 3 jenis isolat, smear yang paling terlihat adalah sampel isolasi DNA
hewan. Hal ini dapat diindikasikan bahwa sampel yang digunakan tidak berkualitas
baik atau gel agarose yang digunakan tidak sempurna.
Keberhasilan elektroforesis ditentukan oleh beberapa faktor. Diantaranya
adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi gel agarose, konformasi DNA, voltase,
keberadaan pewarna DNA dan komposisi buffer elektroforesis. Hal-hal tersebut
mempengaruhi kecepatan migrasi DNA. Ukuran molekul DNA yang lebih besar akan
bermigrasi lebih lambat. Untuk molekul DNA berukuran besar, maka konsentrasi
agarose harus lebih rendah. Voltase yang digunakan juga bergantung pada ukuran
molekul DNA. Komposisi buffer yaitu ion akan menentukan kecepatan migrasi DNA,
jika aliran listrik kecil maka migrasi DNA akan berjalan lebih lambat. Namun jika
aliran listrik terlalu besar, akan memperbesar resiko lelehnya gel dan denaturasi DNA.
Selain itu, ada beberapa langkah yang menentukan keberhasilan elektroforesis.
Saat persiapan agarose, agarose harus sepenuhnya larut dan homogen, bila tidak maka
akan mengganggu hasil dari DNA marker. Kemudian saat mengangkat sisir setelah
agarose dingin haruslah bersamaan agar gel tidak sobek atau terluka. Kemudian saat
memasukan larutan DNA pada sumur-sumur harus berhati-hati agar tidak menembus
hingga gel atau berceceran. Bila menembus, ada kemungkinan DNA menjadi
bercampur dengan larutan buffer. Akibatnya DNA hanya sedikit yang terbaca.

F. Kesimpulan
Analisa Elekroforesis gel Agarose merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul
DNA/RNA,baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul
DNA.Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub
negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Pada praktikum ini
menggunakan 3 DNA yaitu mikroba, hewan dan tumbuhan. DNA terdeteksi di dalam
sampel hewan dan mikroba saja walaupun terdapat smear. Smear dapat muncul
karena beberapa faktor antara lain persiapan gel agarose kurang sempurna, terlalu
banyak sampel isolat yang digunakan, dan kualitas sampel yang buruk
 DAFTAR PUSTAKA

Harahap, M. R. (2018, February). Elektroforesis: Analisis Elektronika Terhadap Biokimia

Genetika. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro,, 2, No.1, 21-26. ISSN:
2549-3698 (printed)/ 2549-3701 (online)
Pramono, H. 2012. Elektroforesis Gel Agarosa. http://02bios2unsoed.wordpress.com/
tentang/acara-praktikum/3-elelektroforesis-dna/.
Retnoningsih, A., & Susanti, R. (2022). Petunjuk Praktikum Biologi Molekuler. Semarang:
Jurusan Biologi, F MIPA, UNNES
Phillips, K., McCallum, N., & Welch, L. (2012). A comparison of methods for forensic DNA
extraction: Chelex-IOO and the QIAGEN DNA investigator kit (manual and
automated). Forensic Science International: Genetics, 6(2), 282-285
Sundari, S., & Priadi, B. (2020). TEKNIK ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS DNA IKAN
TAPAH. Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur, 17(2), 87-90.