Machine Translated by Google

Ekspresi dan Pemurnian Protein 174 (2020) 105686

Daftar konten tersedia di ScienceDirect

Ekspresi dan Pemurnian Protein

beranda jurnal: www.elsevier.com/locate/yprep

Mengoptimalkan produksi trimer lonjakan larut SARS-CoV-2 dengan hasil tinggi untuk
T
pengujian serologi

Dominic Espositoa,ÿ , Jennifer Mehalkoa , Matthew Drew , Kelly Sneada, Vanessa Walla,
Troy Taylora , Peter Franka, John-Paul Densona , Min Honga , Gulcin Gultena , Kaitlyn Sadtlerb ,
Simon Messinga , William Gilletea
sebuah

Laboratorium Ekspresi Protein, Inisiatif NCI RAS, Program Teknologi Penelitian Kanker, Laboratorium Nasional Frederick untuk Penelitian Kanker, Leidos Biomedical Research, Inc.,
Frederick, MD, 21702, AS
b
Bagian tentang Rekayasa Imuno, Institut Nasional untuk Pencitraan Biomedis dan Rekayasa Bio, Institut Kesehatan Nasional, Bethesda, MD, 20894, AS

INFORMASI ARTIKEL ABSTRAK

Kata kunci: Trimer lonjakan SARS-CoV-2 adalah antigen utama untuk beberapa uji serologi yang penting untuk menentukan tingkat
SARS-CoV-2 paparan SARS-CoV-2 dalam populasi. Sampai garis sel yang stabil dikembangkan untuk meningkatkan titer protein yang
COVID-19 disekresikan ini dalam kultur sel mamalia, hasil protein lonjakan yang rendah yang dihasilkan dari transfeksi transien sel
Protein lonjakan HEK293 akan menjadi faktor pembatas untuk pengujian ini. Untuk meningkatkan hasil protein lonjakan dan mendukung
ELISA
tingginya permintaan antigen dalam uji serologi, kami menyelidiki beberapa variabel ekspresi protein rekombinan dengan
Serologi
mengubah suhu inkubasi, waktu panen, strategi kromatografi, dan manipulasi protein akhir.
produksi protein
Melalui penyelidikan ini, kami mengembangkan strategi pemurnian yang disederhanakan dan kuat yang secara konsisten
menghasilkan 5 mg protein per liter kultur ekspresi untuk dua bentuk protein lonjakan SARS-CoV-2 yang umum digunakan.
Kami menunjukkan bahwa protein ini membentuk trimer stabil yang berperilaku baik dan secara konsisten berfungsi dalam
uji serologi di berbagai lot produksi protein.

1. Perkenalan
Kebutuhan reagen protein berkualitas tinggi menjadi aspek penting dalam
penanggulangan pandemi COVID-19 [1]. Skrining untuk keberadaan dan tingkat
respons imun akan menjadi alat penting dalam mengendalikan penyebaran infeksi
hingga pengembangan vaksin yang efektif. Selain itu, pemantauan semacam itu
akan memberikan data penting kepada pembuat kebijakan saat mereka
mengembangkan pedoman untuk membatasi penyebaran virus dalam populasi.
Dengan keberadaan virus corona terkait di mana-mana dalam populasi (misalnya
SARS-CoV, MERS-CoV, virus corona flu biasa OC43 dan HKU1), tes harus sangat
spesifik untuk SARS CoV-2. Beberapa uji serologi, baik yang diterbitkan maupun
yang sedang dalam proses, menggunakan protein S (selanjutnya disebut sebagai
spike) dalam uji im munosorbent terkait-enzim (ELISA). Spesifisitas yang melekat
pada protein lonjakan [1,2] membuatnya menjadi target yang jelas untuk intervensi
terapeutik dan untuk digunakan dalam studi serologi untuk menilai prevalensi
respon imun terhadap virus corona tertentu. Dua antigen lonjakan saat ini banyak
digunakan: domain pengikat reseptor (RBD), yang berinteraksi dengan
reseptor ACE2 ekstraseluler, dan ectodo lonjakan utama yang jauh lebih besar
dimodifikasi untuk stabilitas untuk meniru konformasi trimer lonjakan asli prefusi
[2]. Sementara produksi domain spike RBD yang kuat baru-baru ini dilaporkan [3],
trimer spike larut berkualitas tinggi tetap menjadi antigen yang sulit untuk
diekspresikan dan dimurnikan. Publikasi salah satu bentuk protein ini mengutip
hasil 0,5 mg/l [2], dengan publikasi lain menunjukkan hasil setinggi 5 mg/l [3].
Namun, banyak laporan yang tidak dipublikasikan menunjukkan hasil yang
konsisten hanya dalam kisaran 1-2 mg/l, memberikan tantangan yang signifikan
untuk pengembangan uji serologi skala besar. Selain itu, beberapa publikasi ini
memberikan informasi yang terbatas pada detail pemurnian atau penilaian kualitas
protein, yang membuat interpretasi hasil menjadi sulit.
Untuk mendukung serosurvei yang dipimpin NIH tentang tingkat respons imun
virus corona pada ~10.000 sampel manusia, lab kami ditugaskan untuk
memproduksi RBD dan protein lonjakan untuk pengoptimalan dan penyebaran
pengujian ELISA [4]. Kami menemukan hasil produksi RBD kami serupa dengan
laporan yang dipublikasikan, namun, produksi lonjakan bermasalah dengan upaya
awal kami yang menghasilkan hasil yang tidak konsisten dan hasil yang lebih rendah daripada

Singkatan: AnSEC, kromatografi eksklusi ukuran analitik; CV, volume kolom; ELISA, uji imunosorben terkait-enzim; IMAC, kromatografi afinitas ion logam amobil; RBD, domain
pengikat reseptor; SEC, kromatografi eksklusi ukuran; SDS-PAGE, elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida; TEM, mikroskop elektron transmisi; TFF, filtrasi aliran
tangensial; VRC, Penulis Korespondensi Pusat Penelitian Vaksin.
ÿ

Alamat email: dom.esposito@nih.gov (D.Esposito).

https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105686
Diterima 29 Mei 2020; Diterima dalam bentuk revisi 1 Juni 2020; Diterima 1 Juni 2020
Tersedia online 04 Juni 2020
1046-5928/ © 2020 Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang.
Machine Translated by Google
D.Esposito, dkk.
yang dilaporkan dalam literatur. Tanpa metode yang kuat di lab kami untuk
menentukan titer lonjakan dalam supernatan kultur, kami terbatas pada metode kasar
analisis gel SDS-PAGE untuk memperkirakan tingkat ekspresi. Karena ukuran
lonjakan (138 kDa), tingkat glikosilasi yang berat, dan tingkat ekspresi yang rendah,
analisis gel SDS-PAGE tidak meyakinkan ketika membandingkan banyak supernatan
ekspresi. Dengan demikian, pekerjaan yang disajikan di sini dimaksudkan untuk
memberikan metode yang kuat bagi mereka yang ingin menghasilkan protein lonjakan
SARS CoV-2 secara andal dalam jumlah yang cukup untuk uji serologi, biologi
struktural, atau sekadar untuk lebih memahami beberapa variabel produksi yang
memengaruhi hasil. Diharapkan protokol ini dapat ditingkatkan lebih lanjut dan
mungkin pada akhirnya digantikan oleh platform produksi jalur sel yang stabil. Namun
demikian, pendekatan yang diuraikan di sini memungkinkan kami untuk meningkatkan
hasil produksi protein lonjakan secara signifikan dengan memodifikasi suhu kultur sel
dan waktu panen, serta meningkatkan proses pemurnian. Protein akhir yang
dihasilkan sangat murni, membentuk struktur trimerik yang sesuai, dan berfungsi
sebagai antigen dalam uji ELISA. Secara bersama-sama, perbaikan ini memungkinkan
produksi antigen lonjakan yang cukup untuk lebih dari 500 pelat ELISA per liter kultur
dan menghasilkan cukup protein dari ekspresi 4-L tunggal untuk mendukung
serosurvei kuat yang dilakukan oleh NIH [4].
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. DNA
DNA untuk ekspresi VRC spike (SARS-CoV-2 S-2P-3C-His8- Strep2x2) dan
protein spike untuk SARS-CoV, MERS-CoV, OC43-CoV, dan HKU1-CoV disediakan
dengan murah hati oleh Dr. Kizzmekia Corbett dan Dr.
Barney Graham (Pusat Penelitian Vaksin Dale dan Betty Bumpers, NIAID). DNA
untuk ekspresi lonjakan Gunung Sinai (SARS-CoV-2 S-2P His6) dengan murah hati
disediakan oleh Dr. Florian Krammer (Sekolah Kedokteran Icahn, Gunung Sinai)
melalui BEI Resources (Manassas, VA). Persamaan dan perbedaan dalam konstruksi
ini diuraikan pada Gambar. 1.
DNA berkualitas transfeksi diproduksi sendiri menggunakan Qiagen Plasmid Plus
Maxi Kit per protokol pabrikan atau dibuat dalam skala besar oleh Aldevron (Fargo,
ND).
2.2. Kultur sel mamalia
Protokol pabrikan diikuti untuk transfeksi dan kultur sel Expi293F (Thermo Fisher
Scientific, Waltham MA).
Secara singkat, 1,7 L kultur sel pada 2,9 × 106 sel/ml ditransfusikan dengan
Expifectamine: kompleks DNA pada 1 ÿg/ml volume kultur akhir. Kultur ekspresi
diinkubasi pada suhu 37 °C dan 8% CO2 dalam Labu Pertumbuhan Optimal 5-L
(Thomson Instrument Company, Oceanside, CA) gemetar pada 105 RPM pada
shaker Infors HT Multitron Standard dengan orbit 2ÿ. Penambah ekspresi ditambahkan
18-20 jam pasca transfeksi sesuai instruksi pabrik, dan inkubasi dilanjutkan pada
suhu 37 °C dan 8% CO2 hingga waktu panen 72, 96, atau 120 jam pasca transfeksi.
Untuk percobaan pergeseran suhu, suhu inkubasi diturunkan menjadi 32 °C segera
setelah penambahan penambah.
Konstruk Mt. Sinai berisi tag pemurnian His6 yang tidak dapat dibelah, sedangkan konstruksi VRC berisi kombinasi tag Strep2 ganda His8 yang didahului oleh urutan
pembelahan protease rhinovirus 3C 3C.
2
Ekspresi dan Pemurnian Protein 174 (2020) 105686
2.3. Filtrasi aliran tangensial (TFF)
Supernatan kultur yang dipanen diklarifikasi dengan sentrifugasi (4000 × g, 20
menit, 4 ° C) diikuti dengan filtrasi (katalog # 12993, Pall Corporation, Port
Washington, NY). Ketika digunakan dalam grafik kromato kolom, supernatan yang
diklarifikasi dikonsentrasikan dan buffer ditukar oleh TFF. Secara khusus, pompa
peristaltik MasterFlex (Vernon Hills, IL) mengumpankan supernatan yang telah
diklarifikasi ke set cas dengan berat molekul 30 kDa (katalog # CDUF002LT,
MilliporeSigma, Burlington, MA). Supernatan yang telah diklarifikasi dipekatkan
hingga 10% dari volume awal dan kemudian buffer ditukar dengan 5 vol 1x PBS, pH
7,4 (Buffer A, diencerkan dari 10X PBS, katalog #70011069 Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA). Setelah pertukaran buffer, kaset TFF dibilas dengan 200-250 ml
Buffer A, untuk mengumpulkan protein yang tersisa di dalam kaset.
Supernatan yang diklarifikasi untuk digunakan dalam pemurnian batch tidak ditukar
dengan buffer.
2.4. Pemurnian protein
Kromatografi dilakukan pada suhu kamar (~22 °C) menggunakan sistem
kromatografi tekanan menengah NGC dari BioRad Laboratories Inc. (Hercules, CA)
dengan pengecualian di bawah ini. Protokol pemurnian standar menggunakan
kromatografi afinitas logam terimobilisasi (IMAC) diikuti dengan desalting ke buffer
akhir.
Secara khusus, supernatan kultur yang diberi perlakuan TFF disesuaikan dengan
imidazol 25 mM dan diterapkan pada kolom bermuatan nikel Kinerja Tinggi Ni
Sepharose 5 ml (GE Healthcare, Chicago, IL) yang sebelumnya diseimbangkan
dalam Buffer A + 25 mM imidazol. Laju aliran untuk semua langkah IMAC adalah 5
ml/menit. Supernatan kultur yang diproses TFF dari hingga 8 L kultur sel diaplikasikan
pada satu kolom 5 ml. Kolom dicuci dalam Buffer A + 25 mM imidazole untuk 4
volume kolom (CV) dengan 3 CV akhir dikumpulkan secara terpisah sebagai
pencucian kolom. Protein dielusi dari kolom dengan terlebih dahulu membalikkan
orientasi kolom, menerapkan gradien linier 6 CV dari imidazol 25 mM–175 mM dalam
Buffer A, elusi langkah 6 CV dari Buffer A + 325 mM imidazole, dan 3 Elusi langkah
CV dari Buffer A + 500 mM imidazole. Fraksi 2,5 ml adalah col
dipilih untuk semua langkah elusi. Fraksi elusi dianalisis dengan SDS PAGE/
pewarnaan Coomassie dan fraksi yang sesuai dikumpulkan.
Volume kumpulan tipikal untuk pemurnian dari 4 L supernatan kultur adalah ~30 ml.
Sampel dihilangkan garamnya ke dalam Buffer A menggunakan kolom desalting
HiPrep 53-ml 26/10 (GE Healthcare #17-5087-01, Chicago, IL) dengan injeksi 14-ml
pada 9 ml/menit untuk semua langkah. Sampel protein akhir dibuat dengan
menggabungkan elusi massal dari beberapa putaran kolom desalting. Konsentrasi
protein ditentukan dengan mengukur A280 menggunakan spektrofotometer Nanodrop
One (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Protein akhir dibagikan sebagai alikuot 0,5
ml atau 0,05 ml, dibekukan dalam nitrogen cair, dan disimpan pada suhu ÿ80 °C.
Untuk menilai keadaan oligomer protein, satu alikuot 0,5 ml dari protein akhir
dicairkan dan dianalisis dengan kromatografi eksklusi ukuran analitik menggunakan
kolom analitik Superdex200 10/300 (GE Healthcare, Chicago, IL), dengan laju alir
sebesar 0,5 ml/menit.
Untuk pemurnian batch dari supernatan kultur yang disaring, 20 ml
Gambar 1. Perbandingan konstruksi ekspresi
protein lonjakan VRC dan Gunung Sinai.
Kedua konstruksi berisi urutan sinyal protein
lonjakan asli (S) (asam amino 1–14) diikuti
oleh S ectodomain (hijau). Situs pembelahan
Furin (RRAR) dimutasi pada kedua konstruksi
seperti yang dicatat, dan mutasi prolin yang
menstabilkan diperkenalkan. Kedua konstruksi
berisi domain trimerisasi fibritin fag T4 (biru)
dan tag pemurnian terminal-C (merah).
Machine Translated by Google
D.Esposito, dkk.
MagBeads bermuatan Ni (Cat #L00295, GeneScript, Piscataway, NJ), yang
sebelumnya diseimbangkan dalam 1x PBS disesuaikan dengan konsentrasi akhir
NaCl 300 mM (Buffer B), ditempatkan di bagian bawah labu Thompson 2 x 5-L (10 ml
per labu) dan 2 L media biakan yang disaring ditambahkan ke setiap labu. Labu
dikocok dengan kecepatan 105 rpm pada suhu 27 °C selama 3 jam. Setelah dikubasi,
supernatan dituang ke dalam gelas kimia 4-L, magnet tanah jarang digunakan untuk
menangkap manik-manik ke dasar gelas kimia, dan media dipindahkan dan disimpan
sebagai "aliran melalui". Buffer B (150 ml) ditambahkan ke gelas kimia untuk
menangguhkan manik-manik, yang kemudian dipindahkan ke botol centrifuge Corning
500 ml dan dikocok pada ~ 22 ° C (suhu kamar untuk semua langkah selanjutnya)
selama 5 menit. Manik-manik dikumpulkan, pencucian dihilangkan, dan langkah
pencucian 150 ml kedua dilakukan. Manik-manik dicuci dua kali tambahan dengan
30 ml Buffer B dalam tabung Corning 50 ml sambil dikocok selama 10 menit untuk
setiap pencucian (total 4 langkah pencucian). Protein dielusi dari manik-manik yang
dicuci dengan penambahan Buffer B dengan peningkatan konsentrasi imidazol 25,
150, 300, dan 500 mM 20 ml buffer yang sesuai digunakan untuk setiap elusi dan
manik-manik dikocok dalam tabung Corning 50 ml selama 10 menit sebelum
mengumpulkan. Sampel dari setiap fraksi elusi dianalisis dengan SDS-PAGE dan
pewarnaan Coomassie dan fraksi yang sesuai dikumpulkan. Kolam diperlakukan
seperti di atas untuk pertukaran buffer, analisis gel akhir, dan penyimpanan.
2.5. Mikroskop elektron transmisi (TEM)
Mikroskopi elektron transmisi dari protein lonjakan VRC dan Mt. Sinai yang
dimurnikan dilakukan dengan pengenceran sampel akhir yang dicairkan menjadi 0,02
mg/ml dalam 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl diikuti dengan pemuatan ke film
pendukung karbon yang dilepaskan cahaya grid (CF200-CU, Ilmu Mikroskopi
Elektron). Kisi-kisi dicuci dua kali dalam buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM
NaCl) dan diwarnai dengan format uranil 0,75% b/v (pH 4,5) tiga kali menggunakan
kertas saring untuk menghilangkan noda sebelum aplikasi tambahan segera. noda.
Tahap pewarnaan terakhir dilakukan selama 30 detik dengan noda kemudian
dihilangkan dengan cara disikat dengan kertas saring, dan kisi-kisi dikeringkan di
bawah lampu pijar.
Kisi-kisi bernoda dicitrakan pada mikroskop elektron Hitachi 7650 dengan perbesaran
40.000x.
2.6. Uji imunosorben terkait-enzim (ELISA)
Untuk menilai reproduktifitas batch-ke-batch dari antigen lonjakan, protein
lonjakan VRC yang dimurnikan dari lima pemurnian berbeda digunakan sebagai
antigen dalam ELISA dengan serum CoV-2 kontrol positif pada beberapa pengenceran.
Protokol ELISA dilakukan seperti yang dilaporkan [4] menggunakan 100 ng per sumur
dari berbagai protein lonjakan dan pengenceran 1:500, 1:10.000, dan 1:100.000.
Pengukuran absorbansi dilakukan pada 450 nm (sinyal) dan 650 nm (kontrol latar
belakang) menggunakan pembaca pelat BMG Labtech PHERAstar yang mampu
membaca absorbansi linier hingga OD ~4.
3. Hasil dan Pembahasan
Untuk menghasilkan antigen SARS-CoV-2 untuk pengembangan uji serologi,
kami awalnya mengikuti prosedur standar untuk produksi protein yang disekresikan:
transfeksi menggunakan protokol pabrikan, ekspresi pada suhu 37 °C, panen pada
tiga hari pasca transfeksi, filtrasi aliran tangensial dari supernatan kultur, kromatografi
ion logam amobil dengan elusi gradien linier, dan kromatografi eksklusi ukuran.
Namun, proses ini menghasilkan hasil yang sangat rendah (masing-masing 0,9 dan
0,3 mg/l, untuk lonjakan Mt. Sinai dan VRC seperti yang terlihat pada Tabel 1).
Tingkat hasil ini tidak cukup tinggi untuk mendukung studi serologi besar tanpa
peningkatan yang signifikan dan biaya tinggi terkait. Kebutuhan mendesak dan
kerangka waktu yang sempit untuk memberikan dukungan protein untuk studi serologi
NIH membatasi kemampuan kami untuk melakukan pemecahan masalah dan
pengoptimalan yang ekstensif. Sebaliknya, kami menilai beberapa parameter dengan
eksperimen yang dikontrol secara internal (misalnya membagi kumpulan IMAC menjadi dua dan meneruskan
3
Ekspresi dan Pemurnian Protein 174 (2020) 105686
Tabel 1
Pengaruh parameter ekspresi dan pemurnian terhadap hasil spike. Kecuali
disebutkan, proses produksi pasca panen mengikuti prosedur kolom TFF >
IMAC > desalting. Angka mewakili hasil dari percobaan yang bergantung. nd -
tidak ditentukan.
Kondisi VRC (mg/l) Gunung Sinai (mg/l)
37 °C/72 h IMAC/SEC 37 0,3 0,9
°C/96 h IMAC/desalt 32 °C/ 2.0, 2.0, 1.4 1,7, 2,6
96 h IMAC/desalt 32 °C/120 4.8, 5.2, 6.1 4,6, 5,3, 5,2
h IMAC/desalt 32 °C/96 h 6.4, 5.0 4.1, 4,4 t
MagBeads/desalt 5.5
dua alikuot pada resin pengecualian ukuran yang berbeda). Hal ini penting karena
protokol keselamatan pegawai laboratorium selama pandemi membatasi jumlah
pegawai di laboratorium. Dengan menggunakan pendekatan ini, kami dapat
memperoleh informasi tentang pengaruh beberapa parameter termasuk suhu kultur
sel, waktu panen, dan cara penangkapan target.
3.1. Pengaruh strategi pemurnian
Pemeriksaan analisis pewarnaan SDS-PAGE/Coomassie pada IMAC awal (tidak
ditampilkan), menunjukkan bahwa kami dapat meningkatkan pemisahan lonjakan
dari kontaminan dengan menyesuaikan parameter elusi. Afinitas yang relatif tinggi
dari protein lonjakan yang ditandai-Nya untuk kolom memungkinkan penggunaan
gradien elusi linier 6 CV dari 25 mM hingga 175 mM imidazol yang mengelusi
sebagian besar kontaminan sebelum lonjakan dielusi dalam langkah elusi 325 mM
imidazol ( Gambar 2A).
Analisis langkah-langkah pemurnian antara dengan metode pewarnaan SDS-PAGE/
Coomassie beresolusi rendah menunjukkan bahwa kehilangan protein yang signifikan
terjadi selama kromatografi eksklusi ukuran (SEC). Ini berkorelasi dengan metode
pemurnian spike yang dipublikasikan [3] dan menyarankan bahwa konsentrasi spike
yang tinggi dapat menyebabkan hilangnya protein melalui pengendapan. Kami
menemukan kesulitan untuk mengukur jumlah kehilangan target selama langkah-
langkah ini, kemungkinan karena glikosilasi berat, yang dilaporkan mengganggu
analisis konsentrasi protein Bradford [5,6]. Dengan menggunakan kolom desalting
untuk pertukaran buffer, daripada SEC atau diafiltrasi, protokol kami yang dimodifikasi
dirancang untuk meminimalkan manipulasi protein yang dapat menyebabkan
hilangnya protein terutama selama langkah pasca IMAC. Dengan demikian, kami
membandingkan hasil pemurnian dari percobaan paralel dengan SEC atau kolom
desalting sebagai langkah pemurnian akhir (Tabel 1). Protokol kolom desalting
menghasilkan hasil yang lebih tinggi secara konsisten sebesar ~2 mg/l, yang
menunjukkan bahwa metode ini meningkatkan pemulihan protein. Selain itu, sangat
sedikit perbedaan dalam kualitas protein yang diamati dalam sampel ini, terutama
dalam kasus protein lonjakan VRC, lagi-lagi dengan alasan perlunya langkah SEC.
Seperti dapat dilihat pada Gambar. 2B, protein lonjakan VRC secara konsisten
memiliki kemurnian yang lebih tinggi daripada protein lonjakan Gunung Sinai. Namun,
data ELISA yang membandingkan kedua protein ini menunjukkan bahwa pengotor
kecil ini tidak berpengaruh signifikan terhadap antigenisitas dalam pengujian [4].
Namun demikian, untuk proses hilir yang membutuhkan tingkat kemurnian yang lebih
tinggi, lonjakan Gunung Sinai mungkin memerlukan langkah pemurnian tambahan.
3.2. Pengaruh suhu dan waktu ekspresi terhadap hasil produksi spike
Mengurangi suhu ekspresi selama ekspresi protein rekombinan, baik E. coli dan
sistem ekspresi baculovirus/serangga, dapat secara signifikan meningkatkan hasil
protein larut [7]. Dalam sistem CHO sementara, penurunan suhu biasanya digunakan
untuk meningkatkan produksi protein [8]. Namun, modifikasi serupa dalam sistem
berbasis HEK293 lebih jarang dilaporkan. Pekerjaan sebelumnya di lab kami dan
lainnya menunjukkan satu batasan untuk sekresi protein dalam kultur sel mamalia
yang ditransfusikan secara sementara mungkin adalah proses sekresi itu sendiri.
Sementara beberapa faktor tampaknya terlibat, sebuah makalah baru-baru ini
menunjukkan bahwa membatasi komponen dalam jalur sekretori tampaknya menjadi
hambatan utama [9,10]. Kami memang mengamati sejumlah besar protein lonjakan
Machine Translated by Google
D.Esposito, dkk.
dalam pelet sel Expi293 (data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa beberapa
protein ditahan di retikulum endoplasma, atau gagal matang sepenuhnya melalui jalur
sekretori.
Viabilitas sel yang rendah (<70%) saat panen adalah tanda lain potensi toksisitas
yang disebabkan oleh kegagalan sekresi. Dengan demikian, kami membandingkan
hasil pemurnian VRC dan lonjakan Gunung Sinai dari sel yang ditransfusikan secara
transien yang diinkubasi pada suhu 32 °C atau 37 °C setelah penambahan enhancer 18 jam.kondisi serupa. Ini berpendapat bahwa lonjakan SARS CoV-2 unik dalam beberapa
pasca-transfeksi. Seperti yang terlihat pada Tabel 1 dan Gambar 2B, ekspresi suhu
yang lebih rendah menyebabkan peningkatan dramatis dalam hasil hingga ~5 mg/l
untuk kedua protein lonjakan CoV-2 yang kami uji. Hasil ini mirip dengan yang dikutip
dalam laporan baru-baru ini tentang protein lonjakan Gunung Sinai yang diproduksi
pada suhu 37 °C dan menggunakan pendekatan diafiltrasi untuk pertukaran buffer [3].
Namun, hasil yang tidak dipublikasikan dari rekan lain di lapangan menggunakan
konstruk ini menyarankan 1-2 mg/l adalah hasil yang lebih konsisten diamati,
menunjukkan bahwa perbaikan ini akan membuat peningkatan yang nyata untuk hasil.
Hasil protein lonjakan VRC yang dipublikasikan adalah 0,5 mg/l [2], menunjukkan
bahwa prosedur modifikasi kami meningkatkan produksi protein ini hampir 10 kali lipat.
Kami juga menyelidiki waktu panen sebagai variabel, karena ini adalah pendekatan
umum untuk meningkatkan hasil dari platform protein yang disekresikan [11]. Dalam
percobaan awal yang diinkubasi pada suhu 37 °C, peningkatan waktu panen dari 72
jam pasca transfeksi menjadi 96 jam menghasilkan beberapa peningkatan hasil (Tabel
1). Kami tidak menguji produksi pada suhu yang lebih rendah dari 32 °C pada 72 jam,
karena pertumbuhan sel jauh lebih lambat pada suhu ini dan kami mengantisipasi ini
tidak akan cukup waktu untuk ekspresi tingkat tinggi. Oleh karena itu, 96 jam digunakan
sebagai standar untuk ekspresi 32 °C seperti disebutkan di atas. Namun, kami
mengeksplorasi waktu pertumbuhan yang lebih lama pada suhu yang lebih rendah
dan tidak melihat peningkatan hasil lebih lanjut untuk VRC atau Mt. Sinai spike dengan
memanen 120 jam pasca transfeksi (Tabel 1, Gambar 2B). Untuk alasan ini, kami
memilih 32 °C dan 96 jam sebagai kondisi optimal kami untuk ekspresi masa depan.
Ekspresi dan Pemurnian Protein 174 (2020) 105686
Gambar 2. Representatif analisis fraksi
kromatografi IMAC dan protein murni. M ÿ
standar protein, berat molekul standar
terpilih dicatat dalam kDa. SEBUAH.
Analisis SDS-PAGE bernoda Coomassie
dari protokol IMAC standar (VRC spike), S
- supernatan kultur, F - kultur su pernatan
tersaring, P - TFF meresap, L - TFF re
tentate / beban kolom, FT - aliran kolom
melalui, W - pencucian kolom. Pecahan
yang dikumpulkan digarisbawahi. B. Analisis
SDS-PAGE pewarnaan Coomassie dari
protein murni yang representatif. C.
Representatif analisis SDS-PAGE bernoda
Coomassie dari kromatografi manik magnetik
IMAC dan protein akhir (lonjakan VRC). F -
supernatan kultur yang disaring, U - protein yang tidak te
Sebagai catatan, kami juga telah mengekspresikan dan memurnikan protein
lonjakan kombinan analog dari 4 beta-coronavirus lainnya menggunakan protokol asli
yang dijelaskan di sini sebagai kontrol untuk uji serologi [4].
Menariknya, hasil protein lonjakan kami dari SARS-CoV, MERS CoV, OC43, dan
HKU1 (masing-masing 4,6, 10,6, 8,4, dan 5,7 mg/l) dalam percobaan tunggal dari sel
yang diinkubasi pada suhu 37 °C jauh lebih tinggi daripada lonjakan CoV-2 dalam
aspek stabilitas protein dan/atau ekspresi protein rekombinan, karena protein lonjakan
virus corona lainnya ini dikloning dalam vektor yang sama dan menggunakan strategi
yang sama dengan lonjakan VRC CoV-2. Kami mengantisipasi bahwa protokol baru
yang diuraikan di sini juga dapat lebih meningkatkan hasil protein tersebut.
3.3. Modus penangkapan target
Pengamatan kami tentang kehilangan protein selama langkah-langkah di mana
lonjakan terkonsentrasi atau terpapar ke area permukaan yang luas, menunjukkan
bahwa kami dapat lebih meningkatkan pemurnian dengan menghilangkan TFF, yang
diperlukan untuk mencapai penangkapan protein maksimum dari supernatan kultur
selama IMAC kolom berikutnya. Jadi, kami menggunakan manik-manik IMAC magnet
untuk menangkap lonjakan VRC dalam mode batch dari lisat yang difilter. Protein
akhir yang dimurnikan dengan pendekatan ini serupa dalam hal kuantitas dan
kemurnian akhir (Tabel 1 dan Gambar 2C) dengan protein yang dimurnikan dengan
protokol TFF/IMAC/desalting. Proses batch ini memiliki beberapa keunggulan berbeda
dibandingkan protokol yang lebih kompleks. Pertama, ini menghilangkan kebutuhan
akan proses TFF padat karya, yang untuk kultur transien skala besar dapat memakan
waktu berjam-jam, dan kebutuhan akan peralatan dan bahan habis pakai khusus.
Kedua, ketika dikombinasikan dengan pendekatan aliran gravitasi untuk pertukaran
buffer, proses ini benar-benar meniadakan kebutuhan stasiun kerja protein, membuat
proses dapat diakses oleh banyak orang.
4
Machine Translated by Google
D.Esposito, dkk.
Gambar 3. Penilaian keadaan oligomer VRC dan protein lonjakan Gunung Sinai.
A. Representatif mikrograf elektron transmisi bernoda negatif dari protein lonjakan
VRC dan Gunung Sinai. B. Kromatografi eksklusi ukuran analitik dari VRC murni
(garis biru) dan protein lonjakan Gunung Sinai (garis merah). Volume elusi puncak
standar ukuran dicatat (670 kDa - tiroglobulin, 158 kDa – ÿ globulin, 44 kDa –
ovalbumin).
laboratorium tanpa teknologi FPLC, dan menjadikannya sangat dapat diskalakan.
3.4. Validasi kontrol kualitas protein lonjakan
Kami mengevaluasi fungsionalitas protein lonjakan dengan metode struktural dan
berbasis konformasi. Tidak seperti protein lonjakan SARS-CoV-2 alami, bentuk protein
rekombinan yang direkayasa ini menggunakan domain trimerisasi eksogen dari fag T4
untuk membentuk struktur trimerik yang sesuai tanpa adanya membran sel. Untuk menilai
keadaan oligomer, protein lonjakan terlarut kami dianalisis dengan mikroskop elektron
dan kromatografi eksklusi ukuran analitik (AnSEC).
Gambar TEM pewarnaan negatif dari partikel spike (Gbr. 3A) dengan jelas menunjukkan
struktur trimerik yang diharapkan dan sangat mirip dengan gambar yang diterbitkan
sebelumnya dari protein spike trimer terlarut yang direkayasa [2]. Selain itu, seperti yang
terlihat pada Gambar. 3B, protein lonjakan rekombinan dielusi selama AnSEC pada
volume yang diharapkan untuk protein ~520 kDa daripada yang diharapkan untuk lonjakan
monomer (~180 kDa). Hasil ini konsisten untuk semua persiapan protein lonjakan VRC
dan Mt. Sinai, dan dalam kasus apa pun kami tidak mengamati protein lonjakan monomerik
yang dapat dideteksi oleh AnSEC.
Pendekatan berbasis makromolekul ini mendukung kesimpulan bahwa protein lonjakan
kami yang dimurnikan mengadopsi struktur tersier dan kuaterner seperti trimer lonjakan
yang direkayasa yang diterbitkan sebelumnya.
Banyak protein lonjakan VRC awal sebelumnya digunakan untuk mengembangkan
dan mengoptimalkan uji serologi menggunakan format ELISA [4]. Untuk menilai apakah
protein lonjakan yang dihasilkan oleh protokol kami yang dimodifikasi memiliki sensitivitas
ELISA yang setara, banyak produksi lonjakan VRC
5
Ekspresi dan Pemurnian Protein 174 (2020) 105686
Gambar 4. Sensitivitas ELISA dari lot produksi VRC Spike terpilih. Banyak protein
lonjakan VRC yang dihasilkan menggunakan kondisi waktu dan suhu ekspresi yang
dicatat digunakan untuk melapisi pelat ELISA yang kemudian dirawat dengan sera
pasien kontrol positif pada pengenceran yang ditunjukkan. Semua pengukuran
dilakukan dalam rangkap tiga dan rata-rata diplot dengan standar deviasi yang dicatat
dengan bilah kesalahan. Pengukuran didasarkan pada absorbansi pada 450 nm
dikoreksi dengan pengurangan absorbansi pada 650 nm.
dibandingkan dalam uji serologi. Gambar. 4 menunjukkan bahwa dalam kumpulan protein
lonjakan VRC yang bergantung dilakukan hampir identik dalam pengujian pada berbagai
konsentrasi sera kontrol positif. Sensitivitas pengujian konsisten pada banyak protein yang
diproduksi dengan kondisi ekspresi yang sama (batang duplikat dengan warna yang
identik) dan juga pada protein yang diproduksi pada waktu dan suhu ekspresi yang
berbeda. Performa lot-to-lot yang konsisten dari protein lonjakan merupakan bagian
penting dari pengujian serologi yang sensitif dan berkualitas tinggi.
4. Kesimpulan
Singkatnya, kami mempresentasikan beberapa peningkatan pada produksi protein
lonjakan SARS CoV-2 yang akan memungkinkan laboratorium dengan ekspresi protein
sederhana dan pengalaman pemurnian untuk secara konsisten menghasilkan protein
dengan hasil tinggi dan berkualitas tinggi untuk digunakan dalam berbagai aplikasi.
Sementara kami mengoptimalkan proses untuk menghasilkan protein untuk uji serologi,
kualitas tinggi dari protein ini membuat mereka cocok untuk studi biokimia, biofisik, dan
struktural, atau sebagai substrat untuk skrining obat.
Kami berharap bahwa parameter yang kami soroti dalam laporan ini akan membantu
orang lain mengatasi hambatan dalam produksi lonjakan dan memandu pekerjaan
pengoptimalan di masa mendatang.
Pernyataan kontribusi kepengarangan CRedit
Dominic Esposito: Konseptualisasi, Analisis formal, Akuisisi pendanaan, Metodologi,
Administrasi proyek, Sumber Daya, Pengawasan, Validasi, Visualisasi, Penulisan - draf
asli, Penulisan - ulasan & pengeditan. Jennifer Mehalko: Investigasi, Metodologi, Validasi,
Visualisasi, Penulisan - draf asli, Penulisan - ulasan & pengeditan. Matthew Drew:
Investigasi, Metodologi, Administrasi proyek, Pengawasan, Validasi, Penulisan - draf asli,
Penulisan - review & editing. Kelly Snead: Analisis formal, Akuisisi pendanaan, Investigasi,
Metodologi, Administrasi proyek, Sumber Daya, Validasi, Visualisasi, Penulisan - draf asli,
Penulisan - ulasan & pengeditan. Vanessa Wall: Investigasi, Administrasi Proyek, Sumber
Daya, Validasi. Troy Taylor: Investigasi, Metodologi, Validasi, Penulisan - draf asli,
Penulisan - ulasan & penyuntingan. Peter Frank: Investigasi, Metodologi, Validasi. John-
Paul Denson: Investigasi, Metodologi, Validasi, Penulisan - draf asli, Penulisan - ulasan &
penyuntingan. Min Hong: Investigasi, Metodologi, Validasi. Gulcin Gulten: Metodologi,
Pengawasan, Validasi, Penulisan - draft asli, Penulisan - review & editing. Kaitlyn Sadtler:
Investigasi, Metodologi, Administrasi Proyek, Sumber Daya,
Machine Translated by Google
D.Esposito, dkk.
Validasi, Penulisan - draf asli, Penulisan - ulasan & pengeditan. Simon
Messing: Konseptualisasi, Analisis formal, Metodologi, Administrasi
proyek, Pengawasan, Validasi, Penulisan - draf asli, Penulisan - ulasan
& pengeditan. William Gillette: Konseptualisasi, Analisis Formal,
Metodologi, Administrasi Proyek, Sumber Daya, Pengawasan, Validasi,
Visualisasi, Penulisan - draf asli, Penulisan - tinjauan & penyuntingan.
Terima kasih
Kami berterima kasih kepada Dr. Matthew Hall (NIH/NCATS) dan
Dr. Matthew Memoli (NIH/NIAID) atas peran mereka dalam
pengembangan tes serologi yang digunakan untuk memvalidasi protein
ini. Para penulis ingin berterima kasih kepada Dr. Kizzmekia Corbett,
Dr. Barney Graham, dan Olubukola Abiona dari NIAID VRC atas
sumbangan murah hati mereka untuk plasmid lonjakan virus corona dan
dukungan teknis selama pemurnian awal protein lonjakan kami.
Penelitian ini didukung sebagian oleh Program Penelitian Intramural
dari Institut Nasional Pencitraan Biomedis dan Bioengineering. Proyek
ini didanai seluruhnya atau sebagian dengan dana Federal dari National
Cancer Institute, National Institutes of Health, dengan nomor kontrak
HHSN261200800001E. Isi publikasi ini tidak serta merta mencerminkan
pandangan atau kebijakan Departemen Kesehatan dan Layanan
Kemanusiaan, dan penyebutan nama dagang, produk komersial, atau
organisasi juga tidak menyiratkan dukungan dari Pemerintah AS.
Referensi
[1] F. Krammer, V. Simon, Serology assays to manage COVID-19, Science (2020),
https://doi.org/10.1126/science.abc1227.
[2] D. Wrapp, N. Wang, KS Corbett, JA Goldsmith, CL Hsieh, O. Abiona,
BS Graham, JS McLellan, struktur Cryo-EM dari lonjakan 2019-nCoV dalam
konformasi pra fusi, Science 367 (6483) (2020) 1260–1263, https://doi.org/10. 1126/
science.abb2507.
[3] D. Stadlbauer, F. Amanat, V. Chromikova, K. Jiang, S. Strohmeier, GA Arunkumar,
Ekspresi dan Pemurnian Protein 174 (2020) 105686
J. Tan, D. Bhavsar, C. Capuano, E. Kirkpatrick, P. Meade, RN Brito, C. Teo,
M. McMahon, V. Simon, F. Krammer, serokonversi SARS-CoV-2 pada manusia:
detail protokol untuk pengujian serologis, produksi antigen, dan pengaturan
pengujian, Curr Protoc Microbiol 57 (1) (2020) e100, , https://doi.org/10.1002/cpmc.100.
[4] C. Klumpp-Thomas, H. Kalish, M. Drew, S. Hunsberger, K. Snead, MP Fay,
J. Mehalko, A. Shunmugavel, V. Wall, P. Frank, J.-P. Denson, M. Hong, G. Gulten,
S. Messing, J. Hicks, S. Michael, W. Gilette, MD Hall, M. Memoli, D. Esposito, K.
Sadtler, Standarisasi uji imunosorben terkait-enzim untuk serosurvei pandemi SARS-
CoV-2 menggunakan pengambilan sampel darah secara klinis dan di rumah,
medRxiv:2020.2005.2021.20109280 (2020), https://doi.org/10.1101/2020.05.21.
20109280.
[5] M. Fountoulakis, JF Juranville, M. Manneberg, Perbandingan Coomassie
biru cemerlang, asam bicinchoninic dan tes kuantisasi Lowry, menggunakan protein
non-glikosilasi dan glikosilasi, J. Biochem. Biofisika. Metode 24 (3–4) (1992) 265–
274, https://doi.org/10.1016/0165-022x(94)90078-7.
[6] HJ Møller, JH Poulsen, Staining of glycoproteins/proteoglycans on SDS-gels, in: JM
Walker (Ed.), The Protein Protocols Handbook, Humana Press, Totowa, NJ, 2009,
hlm. 569–574, , https ://doi.org/10.1007/978-1-59745-198-7_52.
[7] WK Gillette, D. Esposito, TE Taylor, RF Hopkins, RK Bagni, JL Hartley, Purify First:
ekspresi cepat dan pemurnian protein dari XMRV, Protein Expr. Purif. 76 (2) (2011)
238–247, https://doi.org/10.1016/j.pep.2010.12.003.
[8] M. Torres, R. Zúñiga, M. Gutierrez, M. Vergara, N. Collazo, J. Reyes, J. Berrios,
JC Aguillon, MC Molina, C. Altamirano, Mild hypothermia meningkatkan ekspresi
myc dan xbp1s dan meningkatkan produksi anti-TNFÿ dalam sel CHO, PloS One 13
(3) (2018) e0194510,, https://doi.org/10.1371/journal .pone.0194510.
[9] H. Hefzi, KS Ang, M. Hanscho, A. Bordbar, D. Ruckerbauer, M. Lakshmanan,
CA Orellana, D. Baycin-Hizal, Y. Huang, D. Ley, VS Martinez, S. Kyriakopoulos, NE
Jimenez, DC Zielinski, LE Quek, T. Wulff, J. Arnsdorf, S. Li, JS Lee, G. Paglia, N.
Loira, PN Spahn, LE Pedersen, JM Gutierrez, ZA King, AM Lund, H. Nagarajan, A.
Thomas, AM Abdel-Haleem, J. Zanghellini, HF Kildegaard, BG Voldborg, ZP
Gerdtzen, MJ Betenbaugh, BO Palsson, MR Andersen, LK Nielsen, N. Borth, DY
Lee, NE Lewis, Konstruksi skala genom konsensus metabolisme sel ovarium hamster
Cina, Cell Syst 3 (5) (2016) 434–443, https:// doi.org/10.1016/j.cels.2016.10.020
e438.
[10] V. Le Fourn, PA Girod, M. Buceta, A. Regamey, N. Mermod, rekayasa sel CHO untuk
mencegah agregasi polipeptida dan meningkatkan sekresi protein terapeutik, Metab.
Eng. 21 (2014) 91ÿ102, https://doi.org/10.1016/j.ymben.2012.12.003.
[11] NK Jain, S. Barkowski-Clark, R. Altman, K. Johnson, F. Sun, J. Zmuda, CY Liu, A.
Kita, R. Schulz, A. Neill, R. Ballinger, R. Patel , J. Liu, A. Mpanda, B. Huta, H. Chiou,
W. Voegtli, T. Panavas, Sistem transien transien CHO-S kepadatan tinggi:
perbandingan ExpiCHO dan Expi293, Protein Expr. Purif. 134 (2017) 38–46, https://
doi.org/10.1016/j.pep.2017.03.018.