ANALISA KROMATOGRAFI

OLEH:
Yuyun Uswatun K.L.M, S.Pd

PERKUMPULAN PEMBINA LEMBAGA PENDIDIKAN DASAR DAN MENENGAH

SMK PGRI (TERAKREDITASI “A”)
 Analisis Kromatografi

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi

dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair)
dan fase gerak (cair atau gas).
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium
kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya, dipakai secara luas untuk pemisahan
analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk
semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari
campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung
beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah :
a. Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)
b. Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan)
c. Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian).
Kegunaan Kromatografi
a. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa
tertentu dalam cuplikan
b. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen
campuran
c. Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah
memadai dalam keadaan murni.
Jenis-Jenis Kromatografi
Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar
yaitu gas chromatography (kromatografi gas) dan liquid chromatography (kromatografi cair).
Masing-masing golongan dibagi lagi berdasarkan pasangan fase gerak dan fase diam

Fase Gerak Fase Diam Jenis Kromatografi

Cair Padat Kromatografi Cair Padat (KCP)
Cair Cair Kromatografi Cair Cair (KCC)
Gas Padat Kromatografi Gas Padat (KGP)
Gas Cair Kromatografi Gas Cair (KGC)

Keterangan:
a. Kromatografi Cair Padat (KCP)/ Liquid Solid Chromatography (LSC)
LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai fase diam digunakan silika gel atau
alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana
komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi
kolom dan kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan teknik pemisahan yang masuk
golongan ini.
b. Kromatografi Cair Cair (KCC)/ Liquid Liquid Chromatography (LLC)
 LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase
diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak oleh larut dalam fase
gerak. Umumnya sebagai fase diam digunakan air dan sebagai fase gerak adalah pelarut
organik. Misalnya pada kromatografi kertas, sebagai fase diam adalah air yang terserap
pada serat selulosa dari kertas.
c. Kromatografi Gas Padat (KGP)/ Gas Solid Chromatography (GSC)
Kromatografi gas padat jika fase diamnya berupa padat dan fase geraknya berupa gas. Zat
padat dalam kromatografi gas padat biasanya adalah : alumina, silica gel, charcoal atau
ayakan molekuler dan serapan selektif pada zat padat diikuti pemisahan.
d. Kromatografi Gas Cair (KGC)/Gas Liquid Chromatography (GLC)
Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam adalah
cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan. Bagaimana
kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan tergantung pada seberapa
lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan sebaliknya melekat pada
cairan dengan jalan yang sama. Gas yang biasa digunakan pada kromatografi gas yaitu :
nitrogen, helium, argon dan hidrogen.
Berdasarkan interaksi Kromatografi dibagi menjadi:
a. Kromatografi Adsorpsi
Tswett menggunakan fase diam dalam bentuk bubuk halus untuk memisahkan zat warna
secara kromatografi. Pada kolom yang dibuatnya, nampak visual wilayah-wilayah dalam
bentuk pita-pita hasil pemisahannya. Berbagai komponen terpisahkan dalam fragmen-
fragmen dan terelusi secara individu dan mulai saat itu kromatografi sebagai teknik
pemisahan mulai berkembang.
b. Kromatografi Partisi
Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan
komponen-komponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi)
molekul-molekul yang dipisahkan.
c. Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan
untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino. Metode ini dapat dilakukan dalam
dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran
ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange).
Pada pertukaran kation, fase diam (phase stasioner) bermuatan negatif, sedangkan pada
pertukaran anion, fase diam (phase stasioner) bermuatan positif.
d. Kromatografi Permeasi Gel

Sama dengan kromatografi kolom.

 Analisa Kromatografi Kolom

A. Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Berdasarkan mekanisme,
kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorpsi. Pada kromatografi kolom,
campuran yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom melalui bagian atas kolom yang
berisi fasa diam (adsorben). Fase gerak berupa cairan yang mengalir melalui kolom tersebut, dan
pada saat mengalir sepanjang kolom, fase gerak akan membawa campuran komponen tadi ke
bagian bawah kolom. Pada fase gerak mengalir sepanjang kolom akan terjadi suatu
kesetimbangan dinamis antara komopen yang teradsorpsi pada fase diam dengan komponen yang
terlarut dalam fase gerak.
B. Prinsip Kromatografi Kolom
Prinsip kerja dari kromatografi kolom, yaitu:
a. Dilaksanakan dalam suatu kolom yang diisi dengan fase diam
b. Digunakan cairan sebagai fase gerak untuk mengelusi komponen sampel keluar dari
kolom
c. Kolom digunakan untuk memurnikan senyawa / pemisahan campuran
d. Dapat diterapkan pada skala besar
C. Cara kerja Kromatografi Kolom
a. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui atas kolom dan
dibiarkan mengalir ke dalam adsorben (bahan penyerap).
b. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap
berupa pita sempit pada permukaan atas kolom.
c. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-masing komponen akan
bergerak turun melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu macam
komponen.
d. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang
lain keluar kolom.
D. Analisa Kromatografi Kolom
Digunakan untuk memisahkan pigmen-pigmen yang terdapat pada tumbuhan.
 Analisa Kromatografi Kertas

A. Pengertian Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas merupakan kromatografi partisi dimana fase geraknya adalah air
yang disokong oleh molekul-molekul selulosa dari kertas. Kertas yang digunakan adalah kertas
Whatman No.1 dan kertas yang lebih tebal Whatman No. 3 biasanya untuk pemisahan campuran
dalam jumlah yang lebih besar karena dapat menampung lebih banyak cuplikan
(Sastrohamidjojo, 1991).
Fase gerak yang digunakan biasanya campuran dari suatu komponen organik yang utama
air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa atau pereaksi-pereaksi kompleks dengan
tujuan untuk memperbesar kelarutan dari beberapa senyawa atau untuk mengurangi kelarutan
yang lainnya (Sastrohamidjojo, 1991). Fase gerak terdiri dari satu atau beberapa pelarut dan bila
diperlukan dapat menggunakan sistem pelarut multi komponen, berupa suatu campuran
sederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Pada pemisahan senyawa
organik selalu menggunakan pelarut campur, tujuannya untuk memperoleh polaritas yang tepat
sehinga diperoleh pemisahan senyawa yang baik. Kombinasi pelarut berdasarkan atas polaritas
masing-masing pelarut sehingga dengan demikian diperoleh sistem penggabung yang cocok
(Stahl, 1985).
Jarak pengembang senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan harga Rf
(Stahl, 1985).
Rf = Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik pentotolan diukur dari pusat bercak dan
harga Rf berada antara 0,00–1,00. Harga Rf sangat beguna untuk mengidentifikasi suatu
senyawa (Eaton, 1989). Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah sebagai berikut:
(Sastrohamidjojo,1991).

1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan

2. Sifat penyerap

3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap

4. Pelarut dan drajat kemurniannya

5. Drajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana

6. Teknik percobaan

7. Jumlah cuplikan yang digunakan

Menurut Sastrohamidjojo (1991), kromatografi kertas dapat dikembangkan dengan cara :

1. Menurun (desendens)

Dilakukan dengan membiarkan fase gerak merambat turun pada kertas kromatografi, kertas
digantungkan dalam bejana menggunakan batang kaca dan batang kaca lain menahan ujung atas
kertas yang tercelup dalam fase gerak. Setelah bejana ditutup, fase gerak dibiarkan merambat
turun pada kertas (Depkes, 1979).

2. Menaik (esendens)

Kertas digantung pada penggantung berbentuk kail yang dipasang pada penutup bejana
kromatografi. Pelarut diletakkan pada bagian bawah dari bejana lalu ujung bawah kertas
dicelupkan ke dalam fase gerak sehingga fase gerak merambat naik pada kertas.
3. Mendatar

Kertas yang digunakan berbentuk bulat dan ditengahnya diberi lubang tempat untuk meletakkan
sumbu yang terbuat dari gulungan kertas atau benang. Fase gerak akan naik membasahi kertas
dan merambat melingkar memisahkan senyawa yang ditotolkan.
Kromatografi kertas merupakan metode yang paling sering digunakan dalam hal analisis
senyawa polar (flavonoida). Untuk tujuan isolasi, hanya memerlukan sejumlah bahan yang
sedikit. Komponen senyawa flavonoid umumnya mudah dipelajari dengan metode kromatografi
karena sifatnya yang menghasilkan warna dari hubungan sifat kelarutannya. Adapun kelebihan
kromatografi kertas yaitu senyawa flavonoida dapat menghasilkan warna alami dari berbagi
komponen senyawa bila dilihat dibawah sinar ultraviolet yang mudah diamati pada kertas.
Kedua, tekniknya mudah dipelajari, memberikan hasil yang cepat dan memerlukan peralatan
yang tidak mahal. Selain itu, metode kromatografi kertas merupakan cara terbaik untuk
mengidentifikasi campuran senyawa flavonoida dengan jumlah yang sedikit (Gaissman, 1962).
B. Prinsip Kromatografi Kertas
 kromatografi kertas adalah KLT yang menggunakan kertas.
 Kromatografi kertas sebenarnya adalah kromatografi planar
 Dilaksanakan dengan menggunakan kertas whatman no. 1
 Digunakan cairan sebagai fase gerak (aquades) maka air akan terserap kertas menjadi
lapisan tipis dipermukaan selulose
 Kolom digunakan untuk hal analisis senyawa polar (flavonoida)

C. Cara kerja Kromatografi Kertas

Pelarut akan meresap pada kertas saring dan bergerak naik, kemudian memisahkan tinta
menjadi beberapa zat warna. Zat warna yang paling mudah larut dalam fase gerak akan
bergerak lebih cepat ke atas daripada zat warna yang terabsorb kuat pada fase diam.
Setelah fase gerak mencapai bagian atas, kertas saring kemudian dapat diambil dan
dikeringkan, menghasilkan kromatogram setelah itu dapat dihitung Rf.
D. Analisa Kromatografi Kertas
Analisa kuantitatif : Digunakan untuk memisahkan zat-zat warna yang terdapat pada tinta
atau bahan pewarna dengan perhitungan Rf. Sedangkan Analisa kualitatifnya dengan
melihat perambatan warna yang terjadi pada sampel
 Analisa Kromatografi Kertas Lapis Tipis
A. Pengertian Kromatografi Kertas Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen menggunakan
fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan salah satu jenis
kromatografi analitik. KLT sering digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak keuntungan
menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk dalam kategori
kromatografi planar, selain kromatografi kertas.
B. Prinsip Kromatografi Kolom Lapis Tipis
Setelah sampel ditotolkan pada fase diam, plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi
fase gerak. Fase gerak akan merambat naik menelusuri fase diam. Ada beberapa cara
pengembangan: secara ascendent, descendent, mendatar, pengembangan berulang, dua
dimensi, dan sirkular.

C. Cara kerja Kromatografi Kolom Lapis Tipis

 Pemilihan pelarut à plate diuapkan kemudian ditetesi sampel dengan pelarut
menggunakan metode cincin terkonsentrasi
 Preparing chamber (kertas saring biasa, gelas / kaleng dengan pentup kaca, kertas
dibentuk seperti tabung tinggi tidak melebihi gelas, memasukkan pelarut yang ditentukan,
ditutup dengan plat/kaca ditunggu hingga kertas saring basah)
 Preparing and spotting the plate ( kertas whatman dimasukkan di oven, dilakukan
penotolan sampel)
 Developing sample(setelah penotolan , kertas whatman dimasukkan kedalam chamber
dengan pinset, totolan sampel tidak boleh terkena pelarut, ditunggu sampai terjadi elusi )
 Calculating Rf

D. Analisa Kromatografi Kolom Lapis Tipis

Analisis Kualitatif
Pada analisis kualitatif diperlukan senyawa murni pembanding. Sampel dielusi pada sistem
yang sama dengan senyawa pembanding, bila sampel dan senyawa pembanding selalu
memberikan bercak dengan nilai Rf yang sama pada walaupun sistem yang berbeda, maka
senyawa sampel identik dengan senyawa pembanding. Dipelajari hubungan struktur
molekul senyawa dengan polaritas, sehingga dapat diprediksi Rf suatau senyawa.

Analisis Kuantitatif
Berdasarkan adanya hubungan antara luas bercak dengan berat senyawa yang terkandung
pada bercak, maka senyawa di dalam sampel dapat diukur kadarnya dengan membuat
persamaan regresi senyawa baku pembanding.
 Analisa Kromatografi Gas

1. Pengertian Kromatografi Gas

Kromatografi gas termasuk dalam salah satu alat analisa (analisa kualitatif dan analisa
kuantitatif), kromatografi gas dijajarkan sebagai cara analisa yang dapat digunakan untuk
menganalisa senyawa-senyawa organic. Kita telah mengetahui bahwa ada dua jenis
kromatografi gas, yatiu kromatografi gas padat (KGP), dan kromatografi gas cair (KGC).
Dalam kedua hal ini sebagai fasa bergerak adalah gas (hingga keduanya disebut kromatografi
gas), tetapi fasa diamnya berbeda. Meskipun kedua cara tersebut mempunyai banya
persamaan. Perbedaan antara kedunya hanya tentang cara kerja.
Pada kromatografi gas padat (KGP) terdapat adsorbsi dan pada kromatografi gas cair
(KGC) terdapat partisi (larutan). Kromatografi gas padat (KGP) digunakan sebelum tahun
1800 untuk memurnikan gas. Metode ini awalnya kurang berkembang. Penemuan jenis-jenis
padatan baru sebagi hasil riset memperluas penggunaan metode ini.
2. Prinsip Kerja
Untuk memahami prinsip kerja dari kromatografi gas khususnya kromatigrafi gas cair (KGC), yang
lazim ditemui adlah pada helium, hydrogen, dan juga nitrogen dapat digambarkan dengan
menggunakan gambar dari kamar-kamar khayal yang masing-masing berisi suatu porsi cairan atsiri,
yang berfungsi sebagai fase stasionernya. Pada kamar pertama dimasukan suatu sampel fasa gerak,
suatu gas seperti nitrogen, yang mengandung uap suatu senyawa organic, katakan benzene, jika
cairan itu cocok maka sejumlah benzena akan melarut kedalamnya, dan sejumlah lain akan tetap
tinggal dalam runag diatasnya. Hal ini dinyatakan dalam Hukum Henry dalam bentuknya yang biasa
menyatakan bahwa tekanan parsial yang dilakukan oleh sutau zat terlarut dalam larutan encer akan
berbanding lurus dengan fraksi molnya. Jadi untuk disrribusi dalam keadaan setimbang (dari)
benzena antara cairan dan fase-fase uap dalam kamar tersebut dapat dituliskan
Untuk GLC fasa diamnya berupa suatu cairan bertitik didih tiggi dan proses serapannya lebih
banyak berupa partisi. Sedangkan untuk GSC fasa diamnya berupa padatan dan adsorpsi
memainkan peranan utama.
Kromatografi Gas mempunyai prinsip yang sama dengan kromatografi kolom (serta yang
lainnya seperti HPLC, TLC), tetapi memiliki beberapa perbedaan:
Pertama, Proses memisahkan senyawa dalam campuran dilakukan antara fasa cair diam dan fasa
gas bergerak, sedangkan pada kromatografi kolom yang seimbang dalah tahap yang solid dan
bergerak adalah fasa cair.
Kedua, melalui kolom yang lolos tahap gas terletak di sebuah oven dimana temperatur gas dapat
dikontrol sedangkan kromatografi kolom biasanya tidak memiliki kontrol seperti suhu.
Ketiga, konsentrasi yang majemuk dalam fasa gas adalah hanya salah satu fungsi dari tekanan
uap dari gas.
Pada Prinsipnya, pemisahan Kromatografi Gas adalah disebabkan oleh perbedaan dalam
kemampuan distribusi analit diantara fasa gerak dan fasa diam di dalam kolom pada kecepatan
dan waktu yang berbeda.
Kromatografi gas (KG) merupakan jenis kromatografi yang digunakan dalam kimia organik
untuk perusahaan dan analisis, kromatografi gas dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari
bahan tertentu, atau memisahkan berbagai komponen dari campuran.

3. Cara
KG merupakan teknik pemisahan yang mana solut-solut yang mudah menguap (dan
stabil terhadap panas) bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam dengan suatu
kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya. Pada umumnya solut akan terelusi
berdasarkan pada peningkatan titik didihnya, kecuali jika ada interaksi khusus antara solut
dengan fase diam. Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase
diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu
menghantarkannya ke detektor. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50-
3500C) bertujuan untuk menjamin bahwa solut akan menguap dan karenanya akan cepat
terelusi.

Ada 2 jenis kromatografi gas:

1. Kromatografi gas–cair (KGC)

Pada KGC ini, fase diam yang digunakan adalah cairan yang diikatkan pada suatu
pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam sehingga mekanisme sorpsi-nya
adalah partisi.

2. Kromatografi gas-padat (KGP)

Pada KGP ini, digunakan fase diam padatan (kadang-kadang polimerik). Mekanisme
sorpsi-nya adalah adsorpsi permukaan.
4. Aplikasi kromatografi gas
Kromatografi gas (KG) merupakan jenis kromatografi yang digunakan dalam kimia organik
untuk perusahaan dan analisis, kromatografi gas dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari
bahan tertentu, atau memisahkan berbagai komponen dari campuran.
 ANALISA KROMATOGRAFI PENUKAR ION
 Digunakan untuk spesies ion.
 Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif
antara molekul spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolom kromatografi.
 Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama enzim).
Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi
pertukaran ion ini antara lain senyawa alkohol, alkaloid, asam amino, dan nikotin.
 ANALISA KROMATOGRAFI PENYARINGAN GEL (EKSLUSI)

 Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul
polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang.
 Kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari
polimer sintetis.
 ANALISA KROMATOGRAFI ELEKTROFORESIS

 Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya. Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan
komponen bermuatan positif (+) pada kutub negatif  (-) serta komponen bermuatan
negatif (-) pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik". Hasil
yang didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan informasi
mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan
migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses kromatografi.
 Prinsip: Elektroforesis adalah teknik pemisahan yang didasarkan pada kemampuan
analit bergerak melalui media konduktif sebagai akibat diaplikasikannya arus listrik.
Media yang digunakan adalah larutan buffer. Jika tidak ada faktor lain, senyawa
bermuatan positif (kation) akan bergerak ke katoda sedangkan senyawa bermuatan
negatif akan bergerak ke anoda. Kecepatan gerakannya dipengaruhi oleh kondisi
lingkungan di sekitar molekul yang dapat mempengaruhi muatannya (pH) dan
hambatan fisik yang mempengaruhi gerakan molekul dalam medan listrik seperti
ukuran pori fase diam. Elektroforesis dapat dimanfaatkan untuk pemisahan ion
anorganik dan logam kation, protein, DNA, karbohidrat dan sampel-sampel biomedik
lainnya.

 Contoh Aplikasi Elektroforesis

Pemisahan ion Li+ dan Na+
Pemisahan NO2- dan NO3- menggunakan EOF