VALIDATION OF MICROBIAL

ENUMERATION TEST (ALT)

Jeffeta Pradeko Putra

Semarang, 6 November 2018
Pendahuluan
A B
1:10 200 250
• Manakah ALT yang
1:100 20 30
sesuai?
1:1000 2 1
PUSTAKA
• Direktorat Jenderal Bina Kefarmasian dan Alat
Kesehatan. 2014. Farmakope Indonesia edisi V.
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia
• United States Pharmacopeial Convention. 2018.
USP 41 Online
Preparasi sampel
Contoh
 Tabel 2. PERSYARATAN MUTU/KRITERIA PENERIMAAN
MIKROBIOLOGI PADA SEDIAAN NON-STERIL
Route of Administration Total Aerobic Total Combined Specified Microorganism(s)
Microbial Count Yeasts/Molds
(cfu/g or Count (cfu/g or
cfu/mL) cfu/mL)
Nonaqueous preparations for oral use 103 102 Absence of Escherichia coli (1 g or 1 mL)
Aqueous preparations for oral use 102 101 Absence of Escherichia coli (1 g or 1 mL)
Rectal use 103 102 —
Oromucosal use 102 101 Absence of Staphylococcus aureus (1 g or 1 mL)
Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 g or 1 mL)
Gingival use 102 101 Absence of Staphylococcus aureus (1 g or 1 mL)
Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 g or 1 mL)
Cutaneous use 102 101 Absence of Staphylococcus aureus (1 g or 1 mL)
Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 g or 1 mL)
Nasal use 102 101 Absence of Staphylococcus aureus (1 g or 1 mL)
Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 g or 1 mL)
Auricular use 102 101 Absence of Staphylococcus aureus (1 g or 1 mL)
Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 g or 1 mL)
Vaginal use 102 101 Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 g or 1 mL)
Absence of Staphylococcus aureus (1 g or 1 mL)
Absence of Candida albicans (1 g or 1 mL)
Transdermal patches (limits for one patch 102 101 Absence of Staphylococcus aureus (1 patch)
including adhesive layer and backing) Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 patch)
Inhalation use (special requirements 102 101 Absence of Staphylococcus aureus (1 g or 1 mL)
apply to liquid preparations for Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 g or 1 mL)
nebulization) Absence of bile-tolerant Gram-negative bacteria (1 g or 1 mL)
PROSEDUR PENGUJIAN
Angka Lempeng Total
• Prinsip
Menumbuhkan dan menghitung koloni mikroba setelah
cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar
dengan cara tuang dan diinkubasi pada 30-35 oC selama
3-5 hari
PELARUT / PENGENCER /MEDIA /
MIKROBA BAKU
Pengencer, Pelarut dan Media

Larutan Dapar Fosfat (LDF) pH 7,2;

Soybean-Casein Digest Agar (SCDA) / Trypticase Soy
Agar (TSA);
 Jika telah ditetapkan kriteria penerimaan untuk mutu mikrobiologi, maka
diinterpretasikan sebagai berikut :
 101 koloni : maksimal penghitungan yang dapat diterima = 20;
 102 koloni : maksimal penghitungan yang dapat diterima = 200;
 103 koloni : maksimal penghitungan yang dapat diterima = 2000 dan seterusnya.
 Pengolahan Data ALT (Farmakope)
A B A B A B
1:10 0 0 1:10 493 411 1:10 0 0
1:100 0 0 1:100 30 20 1:100 30 20
1:1000 0 0 1:1000 2 1 1:1000 2 1
ALT = ALT = ALT =

A B A B A B
1:10 250 240 1:10 >200x8 >200x8 1:10 1 2
1:100 40 30 1:100 >200x8 >200x8 1:100 0 0
1:1000 2 1 1:1000 400 300 1:1000 0 0
ALT = ALT = ALT =
VALIDASI METODE
ANALISIS
Pendahuluan
• Validasi metode adalah pembuktian objektif bahwa metode
yang digunakan memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
• Verifikasi metode merupakan validasi sekunder, dilakukan jika
laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode
standard yang telah divalidasi (Farmakope, ISO, AOAC,
WHO dll)
• Sampel positif adalah sampel dengan penambahan
mikroba target
• Sampel negatif adalah sampel tanpa penambahan mikroba
(target)
• Kontrol positif adalah media dengan penambahan mikroba
target
• Mikroba target adalah mikroba yang menjadi target dari
metode analisis
Persyaratan Lab
• Personel yang kompeten
• Metode standar atau inhouse methode
• Peralatan terkalibrasi
• Mikroba acuan
• Program statistik untuk menghitung, mengevaluasi dan
menginterpretasikan hasil pengujian
• Protokol validasi atau verifikasi
Verifikasi Metode ALT
Prosedur ini digunakan untuk verifikasi metode analisis ALT
secara kuantitatif dalam produk makanan dan minuman,
sediaan obat tradisional, sediaan kosmetik, sediaan
suplemen kesehatan, sediaan obat.
Parameter analisis yang digunakan
dalam Validasi metode ini adalah
1. Recoveri atau akurasi  70 - 130%
2. Linieritas (R2) ≥ 95%
3. Presisi sampel positif dengan 5 konsentrasi inokulum
mikroba (rendah, intermediet 1, sedang, intermediet 2
dan tinggi) untuk memperoleh nilai % RSD atau
Koefisien Variasi (CV)
Kriteria keberterimaan :
• Konsentrasi rendah (< 100 koloni/g atau mL)  CV < 35 %
• Konsentrasi intermediate 1 (102-103 koloni/g atau mL)  CV ≤ 10%
• Konsentrasi sedang (103-104 koloni/g atau mL)  CV ≤ 10 %
• Konsentrasi intermediate 2 (104-105 koloni/g atau mL)  CV ≤ 10 %
• Konsentrasi tinggi (105-106 koloni/g atau mL)  CV ≤ 10 %
Tahapan Pelaksanaan Verifikasi
Uji Pendahuluan untuk Pembuatan
Inokulum (Cemaran mikroba)
Penghitungan Jumlah Mikroba Target
• Mikroba diinokulasikan ke media umum, diinkubasi pada
kondisi dan suhu tertentu selama 24-48 jam.
• Penghitungan jumlah mikroba target dilakukan dengan metode
Angka Lempeng Total, menggunakan media dan kondisi
inkubasi yang sesuai mikroba target dan non target, atau
menggunakan standar Mc Farland yang sebelumnya telah
diketahui berapa jumlah koloni dari setiap tingkat Mc Farland
dari mikroba yang digunakan, (dihitung dengan metode Angka
Lempeng Total)
• Penggunaan kurva pertumbuhan mikroba
Kelompok perlakuan untuk verifikasi
dibagi menjadi 3 yaitu :
• Perlakuan 1, berupa sampel negatif yaitu sampel tanpa
penambahan mikroba target.
• Perlakuan 2, berupa sampel positif yaitu sampel dengan
penambahan mikroba target (1-100 koloni/ g atau mL)
• Perlakuan 3, berupa kontrol positif yaitu menggunakan
media dengan penambahan mikroba target
• Masing-masing kelompok dikerjakan 5 x ulangan ( untuk
perlakuan 1-2) sedangkan kontrol positif minimal 2x
ulangan )
Cara memberikan inokulum ke dalam
sampel (spiking)
Misal Sirup  Volume sampel 120 mL
• Spiking Bakteri misal B. subtilis 100 koloni/mL
• Jumlah bakteri dalam suspensi = 6 x 107 kol/ mL
• Spiking B. subtilis 100 koloni/mL x 120 mL = 12.000 koloni
maka inokulum

• Perlu diencerkan hingga 10-4 diambil 2 mL atau 10-3

diambil 0,2 mL  pertimbangkan maksimal 1% dari
total (rekomendasi)
Kesimpulan
• Metode analisis ini dapat/tidak dapat digunakan untuk
pengujian.
INTERPRETASI DATA
MATUR NUWUN….
TERIMA KASIH
Ada pertanyaan ???