MAKALAH SPETROSKOPI PERKEMBANGAN SS-NMR UNTUK ANALISIS KUANTITATIF DALAM FORMULASI PEMBUATAN OBAT-OBATAN

Disusun oleh :

Kelompok 19

Fera Rahmawati Jasika Gita Pramesti Rio Setiawan Rizkia Ananda Winda

J3L109017 J3L109074 J3L109161 J3L109116

Program Keahlian Analisis Kimia Program Diploma Institut Pertanian Bogor 2011

KATA PENGANTAR

Bismillahirrohmanirrohim Assalamualaikum Wr.Wb Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas berkat, rahmat, dan hidayah-NYA lah kami, kelompok 19 dapat menyelesaikan makalah koloid yang berjudul Perkembangan Ss-Nmr Untuk Analisis Kuantitatif Dalam Formulasi Pembuatan Obat-Obatan. Salawat dan salam tak luput juga kami sampaikan kepada junjungan kami, Nabi Besar Muhammad SAW karena Beliau telah membimbing kami dari zaman kegelapan menuju zaman yang terang benderang ini. Makalah ini membahas tentang salah satu aplikasi dari Spektrosopi yaitu ssNMR yang dilakukan dalam dunia farmasi. Makalah ini berisi tentang beberapa hal yang berkaitan dengan Perkembangan Ss-Nmr untuk Analisis Kuantitatif dalam Formulasi Pembuatan Meprobamate, serta prinsip dari alat yang digunakan. Terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu kami dalam menyelesaikan makalah ini. Terima kasih kepada Kakak Dewi Angraini,S.Si. selaku Penanggung Jawab Praktikum Spetroskopi yang telah membimbing kami, Kakak Esty Octiana Sari,A.Md dan Kakak Mely Yanti, A.Md selaku asisten praktikum Spetroskopi. Semoga makalah ini bermanfaat bagi penulis dan pembacanya.

Bogor, 10 Mei 2011

Penulis

ii

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ........................................................................................................ ii DAFTAR ISI...................................................................................................................... iii BAB I PENDAHULUAN ................................................................................................... 4 1.1 Latar Belakang .......................................................................................................... 4 1.2 Meprobamate ............................................................................................................ 5 BAB II PEMBAHASAN .................................................................................................... 5 2.1 Pengantar................................................................................................................... 6 2.2 Eksperimental ........................................................................................................... 7 2.2.1 Sampel................................................................................................................ 7 2.2.2 NMR fase cair .................................................................................................... 7 2.2.3 Solid-state NMR ................................................................................................ 8 2.3 Hasil dan diskusi ....................................................................................................... 8 2.3.1 Pengukuran spektrum NMR 13C dari Meprobamate .......................................... 8 2.3.2 Prosedur untuk kuantifikasi Meprobamate ...................................................... 10 2.3.2.1. Preparasi sampel ...................................................................................... 10 2.3.2.2 Intensitas referensi ................................................................................... 11 2.3.2.3 Percobaan optimalisasi 1H-13C polarisasi silang ....................................... 11 2.3.2.4. Kurva kalibrasi dan pengukuran kuantitatif ............................................. 13 BAB III PENUTUP .......................................................................................................... 16 3.1 Kesimpulan ............................................................................................................. 16 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................... 17

iii

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Nuclear Magnetik Resonance ( NMR ), pertama kali ditemukan pada tahun 1946 oleh dua orang Fisikawan, yakni Felix Bloch di Universitas Stanford dan Edward Mills Purcell dari Universitas Harvard secara terpisah pada tahun 1952. Mereka menemukan bahwa inti magnet, seperti Hidrogen dan Phospor dapat menyerap energi RF (Radio Frequency) ketika ditempatkan dalam medan magnet pada ukuran tertentu sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi inti atom. Ketika proses penyerapan ini terjadi, inti atom digambarkan dalam bentuk resonansi. Inti atom yang berbeda dalam suatu molekul beresonansi pada frekuensi yang berbeda dalam suatu kuat medan magnet yang sama (Claridge 2009). Resonansi frekuensi zat tertentu berbanding lurus dengan kekuatan medan magnet yang diterapkan. Jika sampel diletakkan dalam medan magnet yang berbeda maka frekuensi resonansi dari inti sampel itu bergantung pada peletakannya (Becker 2000). Resolusi teknik NMR tergantung pada besarnya medan magnet gradien, sehingga medan megnet dapat ditingkatkan dengan menggunakan superkonduktor. Efektivitas NMR juga dapat diperbaiki dengan menggunakan hyperpolarization, dua dimensi, tiga dimensi dan teknik multifrekuensi dimensi tinggi (Sanders 1989). Solid state NMR telah berkembang sebagai metode yang digunakan untuk menentukan jenis komponen farmasi dalam bentuk padatan. Hal ini terutama didasarkan pada kedapatan meningkatnya pemilihan instrument dan berdasarkan fakta bahwa 80% obat-obatan yang ada di pasaran berbentuk padatan. ssNMR tidak hanya dapat digunakan untuk analisis struktur kimia, tapi juga struktur fisik dari suatu substansi farmasi. Struktur ini sangat penting untuk diketahui karena pengaruhnya tidak hanya terhadap kelarutan obat, tapi juga dengan

biokompatibilitas dan stabilitas kimia-fisik suatu obat (Sanchez 2008). Banyak pengamatan menunjukkan bahwa penggunaan NMR untuk analisis kuantitatif menunjukkan bahwa NMR merupakan teknik yang sangat

linear dan paling baik yang dapat menghasilkan presisi dan akurasi yang baik. Penggunaan ssNMR untuk analisis kuantitatif pada analisis ini memiliki berbagai keuntungan, yaitu tekniknya yang non destruktif dan tidak membutuhkan manipulasi preliminary.

1.2 Meprobamate Meprobamate pertama kali disintesis oleh Bernard John Ludwig dan Frank Milan Berger pada tahun 1950. Senyawa ini digunakan untuk menangani anxiety disorder yang dapat melemahkan aktivitas otak agar terjadi relaksasi. Meprobamate berbentuk serbuk putih dengan bau yang khas dan rasanya yang pahit. Meprobamate agak sukar larut dalam air, mudah larut dalam aseton dan alkohol. Struktur kimia dari meprobamate adalah C9H18N2O4 dengan bobot molekul 218.25. dalam tiap tablet meprobamate dengan bobot 200mg dan 400mg, mengandung senyawa aktif berikut ini : koloid silikon dioksida, magnesium stearat, mikrokristalin selulosa, pati natrium flikolat, pati jagung, dan asam stearat. Meprobamate dapat menghasilkan efek samping seperti pusing, mual-mual, diare, sakit kepala, sulit menggerakan badan, dan lesu. Beberapa efek samping yang berakibat serius seperti gatal gatal, kulit merah, mimisan, sakit tenggorokan, demam, sulit bernafas, dan detak jantung yang terlalu cepat (Sarker 2007).

BAB II PEMBAHASAN

2.1 Pengantar Solid-state resonansi magnet inti (ssNMR) akhir-akhir ini banyak digunakan untuk menentukan karakter senyawa farmasi pada fasa padat. Hal ini dikarenakan adanya peningkatan dalam instrumentasi. Faktanya, bahwa sekitar 80% dari obat yang tersedia di pasar saat ini hadir dalam bentuk padatan. ssNMR tidak hanya digunakan untuk menentukan struktur kimia suatu senyawa, tetapi juga menentukan sifat fisik suatu senyawa farmasi. Hal ini sangat penting karena keduanya tidak hanya mempengaruhi kelarutan tetapi juga biokompabilitas dan stabilitas fisiko-kimia obat. Banyak penelitian telah melaporkan bahwa penggunaan NMR untuk analisis kuantitatif menunjukkan teknik yang sangat linier dan kuat sehingga memungkinkan untuk kuantifikasi yang tepat dan akurat. Penggunaan ssNMR dalam teknik kuantifikasi menghasilkan berbagai keuntungan, yaitu sebagai teknik non-destruktif dan tidak memerlukan preparasi sampel. Selain itu, analisis sebagian besar dilakukan pada jumlah sampel yang sedikit, sehingga menghasilkan sampel homogen. Penggunaan standar internal dapat mengurangi efek dari ketidakstabilan instrument dan memungkinkan kuantifikasi langsung dapat dicapai. Kekurangan dari metode ini adalah sulitnya mempersiapkan campuran homogen sampel dan standar, khususnya apabila sampel dalam keadaan padat, dan juga penurunan sensitivitas akibat pengenceran sampel. Hal tersebut penting bagi NMR karena kepekaannya yang relatif rendah dan berkaitan dengan teknik analisis lainnya. Akhir-akhir ini, penelitian telah menunjukkan bahwa terdapat

kemungkinan untuk meningkatkan sensitivitas dan presisi pengukuran kuantitas dengan ssNMR berdasarkan metode standar eksternal, dengan menggunakan kemasan rotor yang dioptimalkan khusus untuk penentuan kuantitatif. Percobaan ini menunjukkan penerapan metode ssNMR untuk kuantifikasi tepat senyawa aktif dalam formulasi farmasi. Sebagai ilustrasi, Meprobamate digunakan sebagai agen anxiolytic yang disarankan dalam berbagai kasus anxiety

(mudah merasa cemas) atau kontraksi otot reflexive dengan cara menganalisis kembali dosis dalam formulasi Meprobamate secara komersial, yaitu sebagai suatu formulasi padat (Equanil) mengandung bahan-bahan lain seperti pati stearat, talk, magnesium, dll.

Gambar 1 Struktur molekul dan penomoran atom senyawa Meprobamate ([2 (carbamoyloxymethyl)-2-metil-pentyl] karbamat).

2.2 Eksperimental 2.2.1 Sampel Meprobamate ([2 - (carbamoyloxymethyl)-2-metil-pentyl] karbamat) dengan kemurnian tinggi digunakan sebagai Zat Kimia Referensi (CRS). struktur molekul dan penomorannya ditunjukkan pada Gambar 1. Equanil 400mg dan 250mg yang berbentuk tablet, dihaluskan dengan menggunakan mortar sebelum dianalisis. Sementara Meprobamate secara komersial tersedia sebagai serbuk halus. Dua campuran sintetik Meprobamate dengan pati dibuat dengan dua komposisi yang berbeda. Campuran A menggunakan 200mg Mepobamate dan 150.3mg pati yang dicampur dengan bantuan mortar. Sementara campuran B diperoleh dengan pencampuran 60.0mg Meprobamate dan 40.2mg pati. Untuk analisis dengan ssNMR, Meprobamate dilarutkan dalam aseton deuterasi.

2.2.2 NMR fase cair Semua percobaan NMR fasa cair dilakukan pada suhu 300K pada spektrometer yang dioperasikan pada frekuensi Larmor
1

H 400MHz, dan
7

dilengkapi dengan 5mm 1H/X probe. Pengukuran dengan ssNMR dilakukan dalam aseton-D6 menggunakan kombinasi 1D konvensional (1H, 2D (HSQC 1H-13C dan HMBC).
13

C {1H}) dan

2.2.3 Solid-state NMR Semua percobaan ssNMR dilakukan pada suhu 300K dalam spectrophotometer yang dioperasikan pada frekuensi Larmor 1H di 400MHz, dan dilengkapi dengan probe 1H/X 4mm solid-state CP MAS. Tingkat perputaran ditetapkan sebesar 10 kHz. Percobaan
13

C CP MAS, getaran pulsa 1H dimulai

dengan daya sebesar 100% dan menurun hingga 50% selama waktu kontak berlangsung. Pengukuran sinyal akuisi dilakukan dengan menggunakan skema GT8. Waktu tahan siklus daur ulang diatur selama 13s, lima kali lebih besar dari T1. Jumlah scan disesuaikan untuk menjamin rasio signal-to-noise minimal 150. Selain itu, untuk memfasilitasi pergeseran kimia ssNMR
13

C dari

Meprobamate, sebuah CPPI (cross-polarisasi polarisasi inversi) dilakukan dengan panjang inversi gelombang 40s. Dengan panjang gelombang ini, karbon CH3 dan karbon kuartener muncul sebagai sinyal positif, CH2 negatif, dan CH hampir nol. Apabila menggunakan metode referensi eksternal, banyaknya kumparan pada probe harus diketahui.

2.3 Hasil dan diskusi 2.3.1 Pengukuran spektrum NMR 13C dari Meprobamate Meprobamate merupakan suatu senyawa aktif, akan tetapi sebelumnya tidak pernah dilakukan pengukuran Meptrobamate dengan menggunakan NMR
13

C. Oleh karena itu, agar diperoleh spectrum ssNMR dengan hasil yang lebih

baik, terlebih dahulu dilakukan pengukuran Meprobamate dalam fasa cair. Secara spesifik pengukuran akhir dilakukan dalam aseton-D6 menggunakan metode konvensional. Pengukuran ini dilakukan sebagai dasar untuk interpretasi spektrum fasa padat Meprobamate pada
13

C CP MAS, seperti ditunjukkan pada Gambar 2a.

Penentuan ssNMR selanjutnya dikonfirmasikan dengan menggunakan eksperimen CPPI yang diukur pada Meprobamate murni (Gambar 2b). Spektrum ini

menunjukkan sinyal akibat adanya CH3 dan karbon kuartener yang bermuatan positif, sedangkan pada CH2 muncul sinyal negatif. Secara keseluruhan, percobaan CPPI memungkinkan pengukuran fase padat berdasarkan fase cairnya, kecuali pada golongan C-1 dan C-3, dimana pergeseran kimia 13C dibalik dari fasa padat oleh fasa cairnya. Hal ini merupakan bukti dalam spektrum CPPI oleh sinyal negatif kecil pada 38,9 ppm, dibawah daerah sinyal pada 37,4 ppm. Tabel 1 Pergeseran kimia 13C untuk meprobamat murni pada fase padat dan cair

Sinyal C-4 tidak terdeteksi dalam spektrum CPPI, sebagaimana dibuktikan pada Gambar 2. Hal ini merupakan salah satu kelemahan dari gelombang yang berurutan, karena sinyal dari fasa yang berlawanan dapat mengganggu pengukuran ketika terdapat perbedaan panjang gelombang diantara pergeseran kimia yang dibandingkan dengan lebar puncaknya.

Gambar 2 (a) CP MAS dan (b) Spektrum CPPI dicatat untuk Meprobamate murni pada probe / CP X 1H MAS di 10 kHz.

2.3.2 Prosedur untuk kuantifikasi Meprobamate Sebuah prosedur baku dalam menjelaskan semua akuisisi yang relevan dan parameter pengolahan yang dibutuhkan untuk mendapatkan hasil optimal pada ssNMR telah dilakukan. Berikut merupakan beberapa prosedur yang digunakan berdasarkan aturan tersebut.

2.3.2.1. Preparasi sampel Intensitas sinyal NMR adalah perhitungan langsung dari jumlah inti nucleus yang tereksitasi oleh frekuensi radio, yang dikalikan dengan suatu faktor

10

pengukuran efektivitas eksitasi. Faktor ini sebanding dengan satu gelombang eksitasi sempurna pada 90. Bidang frekuensi radio yang dihasilkan oleh kumparan pada probe NMR merupakan satu-satunya fraksi homogen pada pengukuran. Jadi, jika sampel yang dianalisis dibentangkan di atas volume spesifik ini, respon NMR tidak akan homogen untuk semua molekul. Ketika menganalisis suatu larutan, efek ini bukan merupakan suatu gangguan, sebagai suatu fasa homogen dari sampel dan pergerakan internal digunakan sebagai factor efisiensi untuk eksitasi pada frekuensi radio. Sebaliknya, ketika menganalisis suatu padatan, molekul di dalam maupun di luar volume eksitasi homogen, maka akan memberikan kontribusi yang berbeda terhadap sinyal yang terbentuk, sehingga menurunkan respon.

2.3.2.2 Intensitas referensi Sebuah standar konsentrasi internal atau eksternal diperlukan untuk menerjemahkan intensitas sinyal NMR menjadi jumlah molekul terdeteksi yang sebenarnya. Sementara referensi internal menyediakan homogenitas respon yang dekat dengan sampel yang diamati, penambahan ataupun pengurangan sampel dapat menimbulkan suatu masalah. Seperti homogenitas sampel yang

mempengaruhi intensitas sinyal NMR, maupun bila dilakukan pengenceran pada sampel yang menyebabkan intensitas sinyalnya menurun. Metode referensi eksternal dapat meningkatkan akurasi dan presisi yang sangat baik apabila volume sampel terbatas dan jika kestabilan spektrometer tidak menjadi masalah. Pemilihan referensi eksternal pada analisis Meprobamate digunakan sebagai kurva kalibrasi. 2.3.2.3 Percobaan optimalisasi 1H-13C polarisasi silang Pengukuran ini, menggunakan 13C CPMAS sebagai pengganti gelombang eksitasi tunggal (SPE) pada MAS untuk memaksimalkan sensitivitas percobaan. Faktanya, karena transfer polarisasi melalui interaksi dipolar dari sejumlah perputaran 1H ke perputaran 13C, intensitas sinyal spin 13C dalam CP ditingkatkan mengacu pada SPE. Selain itu, karena relaksasi dalam percobaan CP MAS lebih

11

banyak ditentukan oleh 1H dibandingkan

13

C, tingkat keterulangan yang lebih

cepat dapat digunakan, sebagai bentuk relaksasi yang lebih efisien dari relaksasi terakhir. Hal ini menyebabkan peningkatan secara keseluruhan dalam rasio signalto-noise per unit waktu. Tabel 2 waktu relaksasi spin 1H terhadap sinyal 13C CP MAS untuk mengukur Meprobamate murni dan Meprobamate dalam Equanil

Di sisi lain, intensitas sinyal dalam percobaan CP MAS berasal dari kombinasi beberapa parameter, yang terkait pada tiap waktu relaksasi, dan ukuran proton pada karbon dengan dipolar coupling. Di antara parameter relaksasi, hanya nilai-nilai waktu relaksasi konstanta longitudinal, T1 dari proton memberikan polarisasi ke karbon yang diperlukan untuk analisis kuantitatif, karena ini menentukan jeda antara masing-masing pemayaran. Pengukuran ini dilakukan secara langsung pada spektrum karbon CP MAS, sehingga penggunaan sinyal karbon sebagai penunjuk dari relaksasi proton dimana mereka mengalami polarisasi. Untuk mengetahui kemungkinan efek lingkungan terhadap relaksasi, pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan Meprobamate murni dan Meprobamate dari Equanil. Hasilnya, juga dilaporkan di Tabel 2, menunjukkan bahwa nilai-nilai yang serupa dengan T1 diperoleh dalam kedua kasus. Hal ini penting bahwa semua sinyal hampir memiliki karakteristik relaksasi yang sama, tipe dari sistem yang didominasi oleh sumber relaksasi tunggal. Untuk membuat kurva kalibrasi, sinyal harus dipilih dalam spektrum CP MAS, yang intensitasnya akan berhubungan dengan jumlah Meprobamate pada rotor. Spektrum CPMAS dari Meprobamate dalam Equanil ditunjukkan pada

12

Gambar 3. Semua resonansi akibat adanya Meprobamate, ditambah pelebaran resonansi memiliki kemungkinan besar sebagai bahan pembantu. Agar tidak terpisahkan dari sinyal yang dipilih untuk tidak bias oleh kehadiran resonansi tambahan, maka dpilih sinyal C-7, 7, yang beresonansi di daerah spektra sekitar 159 ppm di mana diharapkan tidak terdapat puncak karena adanya bahan pembantu. Selanjutnya, CP menghasilkan magnetisasi dipindahkan dari 1H ke 13C. kurva untuk sinyal

tertentu untuk mengoptimalkan waktu kontak pada percobaan, yaitu waktu selama

Gambar. 3. 13C CP MAS spektrum Equanil.

Gambar 4 Kurva 13CCPMAS C-7, 7. Di pureMeprobamate () dan Meprobamate di Equanil ( ). 2.3.2.4. Kurva kalibrasi dan pengukuran kuantitatif Setelah semua parameter eksperimental yang relevan telah dioptimalkan, termasuk kontak dan waktu relaksasi T1, dan volume kumparan kuantitatif probe
13

telah ditentukan, kurva kalibrasi dapat dibuat. Hal ini cukup dilakukan dengan mer spektrum CP MAS dalam jumlah Meprobamate yang telah diketahui dengan tepat dan pelaporan sinyal yang tidak terpisahkan dari sinyal CO sebagai fungsi dari jumlah sampel yang digunakan. Hal ini diilustrasikan pada Gambar 5, yang menunjukkan linieritas yang sangat baik dari teknik di atas rentang bobot diukur dalam percobaan ini (dari 0 sampai 20mg). Jumlah terbesar Meprobamate murni yang dianalisis dibatasi sebanyak 20mg. Untuk mengetahui ketepatan kurva ini, dua campuran sintetik, yaitu campuran A dan B yang telah dihaluskan dengan sejumlah Meprobamate murni dengan pati. Lima rotor berbeda berisi 20mg campuran kemudian dianalisa oleh ssNMR. Kurva kalibrasi pada Gambar 5 digunakan untuk menentukan jumlah Meprobamate rata-rata untuk kelima rotor. Hasil yang dilaporkan dalam Tabel 3 menunjukkan bahwa metode ini memiliki keakuratan yang tinggi. Hal ini disebabkan deviasi antara jumlah Meprobamate teoritis dan percobaan kurang dari 1%.

Gambar. 5. Kurva kalibrasi diperoleh dengan menggunakan dan intensitas yang sesuaidari C-7, 7 sinyal resonansi.

13

C CP MAS dan

pengepakan rotor kuantitatif menunjukkan hubungan antara jumlah Meprobamate

14

Tabel 3 Penentuan jumlah Meprobamate di sintetik (campuran A dan B) dan sampel komersial (Equanil 400 dan Equanil 250)

Prosedur yang sama kemudian diaplikasikan untuk menghitung jumlah Meprobamate dalam Equanil 250 dan Equanil 400. Untuk setiap campuran, 10 tablet dihaluskan dengan prosedur yang sama dengan prosedur yang digunakan dalam campuran sintetis. Hasilnya ditampilkan pada Tabel 3 yang

menggambarkan keakuratan yang baik antara data eksperimen dan nilai yang dilaporkan oleh produsen. Data ini menunjukkan keandalan metode dan menunjukkan bahwa ssNMR menghasilkan hasil kuantitatif dengan presisi yang baik.

15

BAB III PENUTUP

3.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil percobaan, prosedur ssNMR dapat digunakan untuk pengukuran kuantitatif yang dapat bermanfaat bila diterapkan pada penentuan kuantifikasi senyawa aktif dalam obat-obatan. Prosedur ini memberikan sensitivitas yang optimal sehingga dapat dikombinasikan dengan metode referensi intensitas eksternal dan memungkinkan analisis yang lebih cepat dengan presisi dan akurasi yang sangat baik.

16

DAFTAR PUSTAKA

Becker ED. 2000. High Resolution NMR : Theory and Chemical Applications. Florida : Academic Press. Claridge T D W. 2009. High Resolution NMR Techniques In Organic Chemistry. Amsterdam : Elsevier Ltd. Sanchez S, Ziarelli F, Viel S, Delaurent C, and Caldaqrelli S. 2008. Improved solid-state NMR quantifications of active principles in pharmaceutical formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Volume 47 .Hal 683687. Sanders JKM, Constable EC, and Hunter BK.1989.Modern NMR Spectroscopy: A Workbook of Chemical Problems. New York : Oxford University Press. Sarker SD dan Nahar L.2007. Chemistry for Pharmacy Students : General, Organic and Natural Product Chemistry. England : John Wiley & Sons, Ltd.

17