Kepekaan Terhadap Antibiotik Dewasa ini, berbagai jenis antimikroba telah tersedia untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme. Zat antimikroba yang di- gunakan dalam pengobatan bertujuan untuk mengeliminasi mikroorga- nisme infektif atau mencegah terjadinya infeksi, Untuk tujuan terapi, suatu zat antimikroba harus menunjukkan toksisitas selektif. Zat antimikroba yang berguna untuk terapi harus menghambat mikroorganisme infektif dan bersifat toksik hanya terhadap patogen infektif, tetapi tidak terhadap inang- nya, Obat yang membunuh pasien tidak digunakan untuk mengobati penya- kit infeksi, walaupun obat itu dapat membunuh mikroorganisme patogen. Sebagai suatu aturan, zat antimikroba yang paling banyak digunakan dalam pengobatan adalah yang memengaruhi kerja dengan menghambat atau membunuh mikroorganisme patogen, tetapi tidak pada sel inang normal. Antibiotik mewakili kelompok terbesar dari zat antimikroba. Anti- biotik adalah zat biokimia yang diproduksi oleh mikroorganisme, yang da- lam jumlah kecil dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh mikro- organisme lain. Sesuai sifatnya, antibiotik harus memiliki toksisitas selektif karena kelompok obat ini diproduksi oleh satu mikroorganisme dan mem- punyai derajat toksisitas yang berbeda-beda terhadap mikroorganisme lain. Perbedaan ini tidak lagi bermanfaat karena ahli kimia organik dapat me- nyintesis senyawa antibiotik baru berdasarkan antibiotik alami yang sudah ada. Oleh karena itu, banyak antibiotik yang digunakan saat ini merupakan bentuk modifikasi dari produk biosintetik mikroorganisme. Seleksi antimikroba yang tepat untuk mengobati suatu penyakit ter- gantung pada beberapa faktor, antara lain: 1. Sensitivitas mikroorganisme infektif terhadap zat antimikroba tertentu. 2. Efek samping zat antimikroba, bergantung pada toksisitas langsung terhadap sel mamalia dan normal mikrobiota (flora normal) yang terdapat pada jaringan tubuh manusia 3. Biotransformasi zat antimikroba secara in vivo, bergantung pada apakah zat antimikroba akan tetap dalam bentuk aktifnya pada jangka waktu yang cukup untuk mempunyai efek toksik pada patogen infektif atau tidak,Buk Ajar Analisis Hayoti 4. Bahan kimia pada zat antimikroba yang menentukan distribusinya dalam tubuh, bergantung pada konsentrasi bahan kimia aktif antimikroba yang bermakna, yang dapat mencapai tempat infeksi untuk menghambat atau membunuh mikroorganisme patogen penyebab infeksi. Penetapan kerentanan patogen terhadap antimikroba penting untuk menyelidiki antibiotik yang sesuai untuk mengobati penyakit. Tidak ada gunanya menggunakan antibiotik yang tidak efektif melawan mikroorga- nisme penyebab penyakit. Ada beberapa prosedur berbeda yang digunakan oleh ahli mikrobiologi klinis untuk menentukan sensitivitas mikroorganisme terhadap antibiotik, antara lain Metode Cakram KIRBY-BAUER dan Metode Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM) atau Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Metode Cakram KIRBY-BAUER Cara yang mudah untuk menetapkan kerentanan organisme terhadap anti- biotik adalah dengan menginokulasi pelat agar dengan biakan dan membiar- kan antibiotik berdifusi ke media agar. Cakram yang telah mengandung antibiotik diletakkan di permukaan pelat agar yang mengandung organisme yang, diuji. Konsentrasi menurun sebanding dengan luas bidang difusi. Pada jarak tertentu pada masing-masing cakram, antibiotik terdifusi sampai pada titik antibiotik tersebut tidak lagi menghambat pertumbuhan mikroba. Efek- tivitas antibiotik ditunjukkan oleh zona hambatan. Zona hambatan tampak sebagai area jernih atau bersih yang mengelilingi cakram tempat zat dengan aktivitas antimikroba terdifusi. Diameter zona dapat diukur dengan peng- garis dan hasil dari eksperimen ini merupakan satu antibiogram. Metode difusi agar telah digunakan secara luas dengan menggunakan cakram kertas saring yang tersedia secara komersial; kemasan yang me- nunjukkan konsentrasi antibiotik tertentu juga tersedia. Efektivitas relatif antibiotik yang berbeda menjadi dasar bagi spektrum sensitivitas suatu organisme. Informasi ini, bersama dengan berbagai pertimbangan farma- kologi-digunakan dalam memilih antibiotik untuk pengobatan. Ukuran zona hambatan dapat dipengaruhi oleh kepadatan atau visko- sitas media biakan, kecepatan difusi antibiotik, konsentrasi antibiotik pada cakram filter, sensitivitas organisme terhadap antibiotik, dan interaksi anti- biotik dengan media. Selain itu, suatu zat yang ditemukan mempunyai efek samping signifikan tidak boleh digunakan untuk terapi karena zat ini mungkin juga mempunyai efek samping signifikan pada sistem yang diobati. Metode cakram difusi mewakili prosedur sederhana untuk menyelidiki zat dalam menentukan apakah zat tersebut signifikan dan mempunyai akti- vitas antibiotik yang berguna. 2Bob 1. Kepekaan Terhadop Antibionik Metode Penetapan Bahan dan alat: * Biakan: Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa * Media: Lempengan Mueller-Hinton agar, pelat agar nutrien * Cakram filter * Larutan antibiotik: kloromisetin, eritromisin, kanamisin, neomisin, novobiosin, penisilin, streptomisin, dan tetrasiklin Prosedur: 1. Siapkan satu pelat agar berisi biakan Staphylococcus aureus dan satu pelat agar berisi biakan Escherichia coli. 2. Dengan pena, bagi pelat menjadi 8 bagian yang sama dengan menggambar garis pada dasar pelat, atau gunakan pelat yang sudah ditandai. Beri nomor setiap bagian secara berurutan dan beri label setiap pelat sesuai dengan biakan mikroorganisme. 3° Letakkan satu cakram filter yang telah mengandung antibiotik yang akan diuji di tengah-tengah bagian tersebut. Lakukan ini pada setiap pelat. Catat nomor sektor pada cakram dan antibiotik apa yang diletakkan pada setiap nomor. . Inkubasi pelat pada suhu 37°C selama minimum 24 jam. . Setelah inkubasi, ukur zona hambatan untuk setiap biakan (5. aureus dan E. coli) dan catat hasilnya. . Bandingkan hasilnya dengan zona hambatan standar dari masing- masing antibiotik dan tetapkan apakah organisme tersebut sensitif, intermediet, atau resisten terhadap antibiotik tersebut (Tabel 1.1). ae 2 Tabel 1.1 Incerpretasi zona hambatan (Kirby-Bauer) ‘Antibiotik Kadar Diameter zonahambatan Resisten Intermedict _ Sensitif ‘Amikasin O0lmg — (Bataukurang 12-13 14 arau lebih Ampisilin O0img — Nataukurang 12-13 4 acau lebih Basicrasin 10 unie Bataukurang 9-11 Sefalotin 0,03 mg. W4araukurang 15-17 Kloramfenikel 0.03mg -I2ataulaurang 13-17 Eritromisin O01Smg —-I3aaukurang 14-17 Gentamisin 0.01 mg Es = Kanamisia 003mg = Bataukurang 14-17 Linkomisin 002mg —Fataukurang 10-14 Metisilin 0.005 mg Pataukurang ‘10-13 Asam nalidiksat 0.03 mg IBaraukurang 14-18Buku Ajor Analisis Hayati Tabel 1.1 Interpretasi zona hambatan (Kirby-Bauer}—lanjutan Antibiotik Kadar Diameter zona hambatan Resisten Intermediet _Sensitif Neomisin 03mg I2ataukurang (3-16 17 atau lebih Nitrofurantein 0,3 mg {4 atau kurang (5-16 17 aay lebih Penisilin G vs 10 nie Wataukurang | 1-28 29 atau lebih Stophylococci Penisilin vx 10 unie Hataukurang {2-21 22 atau lebih ‘organisme lain Polimiksin. 300 unit —Bataukurang 9K 1 {2 acau lebih Streptomisin 0,01 mg I ataukurang S2-14 15 acau lebih Sulfonamida 0,3 mg I2ataukurang 13-16 17 acau lebih Tetrasiklin 0.03 mg I4araukurang 15-18 19 acau lebih Vankomisin 003mg Pataukurarg 10-1 12 atau lebih Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM) Konsentrasi hambatan minimum adalah konsentrasi antibiotik terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan organisme tertentu. KHM dapat ditentukan dengan prosedur tabung enceran. Prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi antibiotik yang masih efektif untuk men- cegah pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis antibiotik yang efektif untuk mengontrol infeksi pada pasien. Inokulum mikroorganisme yang telah distandardisasi ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung seri enceran suatu antibiotik, dan pertum- buhan mikroorganisme akan termonitor dengan perubahan kekeruhan. De- ngan cara ini, KHM antibiotik yang dapat mencegah pertumbuhan mikro- organisme in vitro dapat ditentukan. KHM dapat juga ditentukan dengan menggunakan konsentrasi tunggal suatu antibiotik dengan membandingkan kecepatan pertumbuhan mikro- organisme pada tabung kontrol dan tabung yang diberi antibiotik. KHM mengindikasikan konsentrasi minimum antibiotik yang harus di- capai pada tempat infeksi untuk menghambat pertumbuhan mikroorga- nisme yang sedang diperiksa. Dengan mengetahui KHM dan teori kadar antibiotik yang dapat dicapai pada cairan tubuh (darah dan urin), kita dapat memilih antibiotik yang sesuai dan cara pemberian antibiotik tersebut. Secara umum, batas keamanan 10 kali KHM digunakan untuk memastikan keberhasilan pengobatan suatu penyakit. Penggunaan mikrotiter dan alat inokulasi otomatis serta sistem pem- bacaan membuat penetapan KHM dapat dikerjakan dengan mudah di labo- ratorium klinik.Bab 1. Kepekoun Terhadap Annibiotik ‘Tabet 1.2 Kadar yang dicapai oleh beberapa antibiotik pada cairan darah dan urin EE EES Antibiotik Konsentrasi dalam cairan Dosis/6-12 jam Darah (g/ml) Urin (ugimn) Klindamisin ‘4 0 (Oral 150-300 mg e190 0 1V 300-600 mg Penentuan KHM bahkan dapat dilakukan dengan cairan tubuh normal yang steril tanpa mengisolasi dan mengidentifikasi mikroorganisme pa- togen. Sebagai contoh, darah atau cairan serebrospinal yang mengandung mikroorganisme infektif dapat ditambahkan ke dalam tabung yang me- ngandung berbagai macam enceran suatu antibiotik dan media pertum- buhan yang sesuai. Peningkatan kekeruhan mengindikasikan pertumbuhan mikroorganisme dan kenyataan bahwa konsentrasi antibiotik tersebut tidak efektif untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme, sedangkan tidak adanya pertumbuhan mikroorganisme patogen menunjukkan kerentanan mikroorganisme terhadap antibiotik pada konsentrasi tersebut. Dengan me- nentukan KHM, dosis yang sesuai serta antibiotik yang tepat dapat dipilih untuk mengobati penyakit infeksi (lihat data pada Tabel 1.2). Metode Penetapan Bahan dan alat: ° Kultur Staphylococcus aureus dan Escherichia coli Media nutrient broth steril Blanko enceran steril 5 ml Blanko enceran steril 9,9 ml Penisilin G Eritromisin Pelat dengan sumur mikro: 24 sumur Pipet Prosedur: 1, Secara aseptik, tambahkan 0,8 ml media pertumbuhan ke dalam 24 sumur pada pelat sumur mikro bertutup. 2. Tambahkan 0,1 ml masing-masing biakan pada blanko enceran steril 9,9 ml secara terpisah untuk membuat enceran 107. 3. Tambahkan 0,1 ml enceran Staphylococcus aureus 10* ke dalam 12 sumur pada dua baris pertama sehingga baris A dan B akan diinokulasi dengan Staphylococcus aureus. |. Tambahkan 0,1 ml enceran E. coli 107 ke dalam 2 baris sisanya sehingga baris C dan D akan diinokulasi dengan E. cali. =Buku Ajar Analis’s Hayat 5. Siapkan seri enceran duplo untuk masing-masing antibiotik dengan konsentrasi 640, 320, 160, 80, 40, dan 20 ug/ml. Untuk mempersiapkan enceran ini, dilakukan cara sebagai berikut. Tambahkan 64 mg antibiotik ke dalam 10 ml air steril, campur baik-baik sampai larut. Tambahkan 1 ml larutan e dalam 9 ml air steril untuk menghasilkan konsentrasi 640 jug/ml. Tambahkan 5 ml larutan ini ke dalam 5 ml air steril untuk menghasilkan konsentrasi 320 jig/ml, dan seterusnya. 6, Tambahkan 0,1 m! masing-masing enceran penisilin secara terpisah pada baris A dan C sehingga konsentrasi tertinggi ada pada sumur A, dan C, dan konsentrasi terendah ada pada sumur A, dan C,. 7. Tambahkan 0,1 ml dari setiap seri eritromisin secara terpisah pada baris B dan D sehingga konsentrasi tertinggi ada pada sumur B, dan D; dan konsentrasi terendah ada pada sumur B, dan D,. Dengan menambahkan 0,1 ml pada 0,9 ml, antibiotik tersebut telah diencerkan dengan faktor 10 sehingga sekarang terdapat baris-baris dengan konsentrasi antibiotik 64, 32, 16,8, 4, dan 2 ug/ml. Inkubasikan sumur mikro/pelat pada 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, sumur-sumur tersebut diamati untuk melihat perubahan kekeruhan, Jika terlihat pertumbuhan, hal itu mengidentifikasikan mikroba resisten terhadap antibiotik pada konsentrasi di sumur tersebut. Jika pertumbuhan tidak tampak, mikroba sensitif terhadap antibiotik pada konsentrasi tersebut. Catat hasil pengamatan dengan menilai ada pertumbuhan (+) atau tidak ada pertumbuhan (-). 10. Dari hasil tersebut, tentukan KHM masing-masing antibiotik untuk masing-masing spesies bakteri. KHM diinterpretasikan pada tabung konsentrasi terendah pertama yang tidak menunjukkan pertumbuhan. Le Penyiapan Inokula Setiap kuman uji yang digunakan dalam penentuan potensi antibiotik harus selalu diremajakan dengan menanam ulang secara berkala. Peremajaan ku- man uji dilakukan setiap minggu dalam medium no. 1 untuk kuman uji sebagai berikut. Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 Escherichia coli ATCC 10536 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Micrococcus luteus ATCC 9341 Staphylococcus aureus ATCC 29737 © Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Untuk Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Bacillus brevis ATCC 8185, peremajaan kuman dilakukan dalam medium no. 32 setiap 3 bulan.Buku Alor Analisis Hayoti Dalam Gambar 1.1, terlihat bahwa cawan yang paling memungkinkan untuk dihitung adalah cawan yang diisi dengan pengenceran 10° (1/1000) yang menghasilkan 159 koloni. Dengan demikian, hasil perhitungan menjadi: 159 x 10° = 1,59 x 10° sel/mt 159 = jumlah koloni dalam cawan 10° = faktor pengenceran im imi im! im Imi 9 mi kaldu 107 107 108 104 108 10° tml imi 1mi Am! tml Aml aed Terlalu rapat 159 16 2 0 Tidak bisa dihitung | 159 x 10° = 1,59 x 10° Jumiah kuman/mi sampel Faktor pengenceran Jumlah koloni di dalam cawan petri Gambar |. Penghicungan jumlah kuman dengan cara pengenceran.Bob 7. Kepekoan Terhadop Antibiotik Cara pengenceran dapat lebih diperjelas dengan cara yang ditunjukkan dalam Gambar 1.2 sehingga penghitungan kuman dapat dilakukan dengan akurat. Ami tml tml tabung 1 tabung 2 tabung3 sampel agar cair45°C agarcair45°C agar cair 45°C a] ee SES APE: Diinkubasi 37°C selama 24 jam &@ koloni terlalu petumbuhan baik pertumbuhan padat, sulit dihitung dapat dihitung terlalu jarang Gambar 1.2. Cara penghitungan jumiah kuman dengan pengenceran.Buku Ajar Analisis Hayoti Penghitungan Kuman dengan Ruang Penghitung Penghitungan langsung dengan menggunakan ruang penghitung diperlihat- kan pada Gambar 1.3. Hasil pengenceran sampel diteteskan ke dalam ruang penghitung. Selanjutnya, pemeriksaan sel-sel mikroorganisme yang ter- dapat di dalam kolom-kolom penghitung dilakukan di bawah mikroskop. Misalnya, jika didapatkan jumlah sel yang terhitung adalah 12, perhitungan jumlah sel di dalam sampel adalah: 12 x 25 = 50 x 10° = 1,5 « 10” sel/ml 12. = jumlah sel yang terhitung 25 = jumlah kotak pada ruang penghitung yang digunakan 50 = volume setiap kotak 10° = faktor pengenceran sampel ‘Sampel yang akan diitung ditempatkan i sini, usahakan tidak Pemeriksaan secara mikroskopis beriebinan. Ketebalan ruang antara ‘semua sel yang berada pada Preparat dan penutup adalah 0,02 mm rongga terbesar Untuk menghitung jumiah di dalam sampel: 12 sel x 25 kotak x 50 x 10° = 1,5 x 107 (1. mm?) ‘Jumiah per mm? Jumlah per mm? Jumilah per mm?/ml Gambar 1.3 Cara penghicungan jumlah kuman dengan menggunakan ruang penghitung. 10Bab 1. Kepekaan Techadep Antibiotik Penghitungan Kuman dengan Turbidimeter/Nefelometer Cara ini merupakan perhitungan kerapatan suatu materi (sel) di dalam laratan yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dihasilkan identik dengan kerapatan materi sel yang, berada di dalam larutan. Serapan (A) yang diperoleh adalah: A=2-log %T A=serapan T = transmisi WPenetapan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi Aktivitas atau potensi antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi yang se- ‘suai dengan efek daya hambat terhadap mikroorganisme. Suatu penurunan aktivitas antimikroba juga dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia sehingga pengujian secara mikro- biologi atau biologi biasanya merupakan standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas. Bab ini meringkaskan cara kerja penetapan potensi antibiotik dengan pengujian secara mikrobiologi. Ada dua metode umum yang dapat digunakan, yaitu penetapan dengan lempeng silinder atau cara “lempeng” dan penetapan dengan turbidimetri atau cara “tabung”. Metode pertama berdasarkan difusi antibiotik dari si- linder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng. Jadi, mikroorganisme yang, ditambahkan dihambat pertum- buhannya pada daerah berupa lingkaran atau “zona” di sekeliling silinder yang berisi larutan antibiotik. Metode turbidimetri berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroorganisme dalam larutan antibiotik serba sama dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan cepat jika tidak terdapat antibiotik. Peralatan Semua peralatan harus dicuci bersih sebelum dan sesudah digunakan. Per- alatan gelas, untuk menyimpan dan memindahkan mikroorganisme uji, di- sterilkan dengan pemanasan kering atau dengan uap air. Pengendalian Suhu Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa tahap penetapan se- cara mikrobiologi, yaitu pada saat membiakkan mikroorganisme dan pe- nyiapan inpkula, serta selama inkubasi dalam penetapan pada lempeng dan tabung. Suhu penetapan dengan cara lempeng dipertahankan lebih kurang, 0,5°C dari suhu yang dipilih. Pengendalian suhu yang lebih dekat (lebih kurang 0,1°C dari suhu yang dipilih) sangat penting untuk inkubasi pada penetapan dengan cara tabung. Hal ini dapat dicapai dengan mengatur sir- 12Bab 2. Penetopan Polensi Aniibiotik Secara Mikrobiologi kulasi udara atau air; kapasitas panas dari air yang lebih besar lebih meng- untungkan daripada sirkulasi udara. Spektrofotometer Pengukuran transmitans dalam pita frekuensi yang sempit membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan mempunyai sumber cahaya panjang ge- lombang yang dapat diubah atau dibatasi menggunakan filter 530 nm untuk pengukuran serapan pada pen, dengan cara tabung. Untuk tujuan tersebut, alat dapat diatur sehingga dapat menerima tabung yang digunakan untuk inkubasi dan menggunakan sel yang dimodifikasi, yang dilengkapi dengan pipa pembuangan untuk memudahkan pertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yang mempunyai saluran untuk ‘pengaliran secara sinambung selama pengukuran. Atur serapan dengan blangko untuk serap- an nol menggunakan media cair yang jernih tanpa inokula yang disiapkan seperti dinyatakan untuk masing-masing antibiotik, termasuk larutan uji dan formaldehida dalam jumlah yang sesuai dalam setiap contoh. (Catatan pengukuran serapan ataw transmitans dapat digunakan untuk penyiapan inokula.) Wadah untuk Penetapan Secara Lempeng Silinder Untuk penetapan cara lempeng, gunakan cawan petri kaca atau plastik (lebih kurang 20 mm x 100 mm) yang mempunyai tutup dari bahan yang sesuai. Untuk silinder, gunakan silinder besi tahan karat atau porselen dengan to- leransi ukuran masing-masing lebih kurang 0,1 mm; diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan tinggi 10 mm. Cuci silinder dengan saksama untuk membersihkan semua residu, kadang-kadang diperlukan asam seperti asam nitrat 2 N atau asam kromat. Wadah untuk Penetapan Secara Turbidimetri Penetapan dengan cara turbidimetri menggunakan tabung reaksi kaca atau plastik dengan ukuran misalnya 16 mm * 125 mm atau 18 mm * 150 mm, yang panjang, diameter, dan ketebalannya relatif seragam, serta permuka- annya tidak cacat dan tidak tergores. Tabung yang akan ditempatkan pada spektrofotometer harus yang sesuai, tanpa goresan, dan tidak cacat. Bersih- kan tabung dengan saksama dari semua residu antibiotik dan sisa larutan pembersih, dan sterilkan sebelum digunakan untuk penetapan berikutnya. Media Media yang diperlukan untuk periyiapan inokula mikroorganisme dibuat dari bahan-bahan yang tertera di dalam kotak. Sedikit modifikasi pada masing-masing bahan, atau media kering yang direkonstitusi, dapat takukan dengan syarat media yang dihasilkan mempunyai daya menurn- buhkan yang sama atau lebih baik dan memberikan respons kurva baku yang sama. 7 13Boku Ajar Anelisis Hayoti Larutkan bahan-bahan dalam air hingga 1 liter, dan atur pH larutan menggunakan natrium hidroksida 1 N atau asam Klorida 1 N sehingga se- sudah sterilisasi uap air didapatkan pH media yang sesuai. Media 1 Pepton 608 Digesti pankreatik kasein 40g z Ekstrak ragi 30g Ekstrak daging, 15 Glukosa ‘ log Agar 1502 Air 1000 ml pH setelah sterilisasi 6,6 + 0,1 Media 2 Pepton 60g Ekstrak ragi 30g Ekstrak daging Se ear 1508 Air 1000 mi pH setelah steriisasi 6,6 + 0,1 Media 3 Pepton 508 Ekestrak ragi Sg Ekstrak daging 15g Natrium Klori¢a 358 Glukosa le Kalium fosfat eibasa 3682 Kalium fosfae monobasa 132g Air 1000 mt pH setelah sterilisasi 7,0 + 0,05 Media S ‘Sama seperti Media 2, kecuali pH setelah sterilisasi 7,9 t 0.1. 14Bob 2 Penetapan Potensi Antibiolik Secara Mikrobiologi Media 8 ‘Sama seperti Media 2, kecuali pH setelah sterilisasi 5.9 + 0.|. Media 9 Digest! pankreatk ‘asein Digesti papaik kedelai Natrium klorida Kalium fosfar dibasa Glukosa Agr Air pH setelah storilisasi 7,2 + 0,1 Media 10 Sama seperti Media 9, kecuali menggunakan |2 g agar sebagai pengzanti 20 g agar. dan setelah pendidihan media untuk melarutkan agar, tambahkan 10 ml polisorbat 80. pH setelah sterilisasi adalah 7.2 + 0.1. Media 11 Sama seperti Media |, kecuali pH setelah sterilisasi 8,3 + 0,1. Media 13 Glukosa 2008 1 Pepton 10.08 Air 1000 mi pH setelah storilisasi 5,6 + 0,1 Media 19 Pepton Ag Ekstrak ragi 478 Ekstrak daging 24g Natrium klorida 10.02 Slukosa loog Aer 235 Air 1000 mi pH setelah storilisasi 6,1 + 0,1Buku Ajar Analisis Hayat Media 32 «Sama seperti Media |, kecuali cambahkan 300 mg mangan sulfat. Media 34 Giliserin Pepton Ekstrak daging Natrium klorida Air pH setelah sterilisasi 7,0 + 0,1 Media 35 Sama seperti Medio 34, kecuali ditambahkan |7 g agar. Media 36 Digesti pankreatik kasein 150g Digesti papaik kedelai 50g Natrium klorida 50g Age 150g Air 1000 mi pH sotolah sterilisasi 7,3 + 01 Media 39 Sama seperti Medio 3, kecuali pH setelah sterilisasi 7,9 + 0,1. Dapar Fosfat dan Larutan Lain Dapar fosfat, yang diperlukan untuk antibiotik yang ditetapkan, dibuat se- perti di bawah ini atau dengan cara lain yang sesuai. Dapar disterilkan setelah pembuatan. pH yang tertera pada masing-masing dapar adalah pH setelah sterilisasi. Dapar nomor 1; 1%; pH 6,0; Larutkan 2,0 g kalium fosfat dibasa dan 8,0 g kalium fosfat monobasa dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 6,0 + 0,05 dengan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N. Dapar nomor 3; 0,1 M; pH 8,0; Larutkan 16,73 g kalium fosfat dibasa dan 0,523 g kalium fosfat monobasa dalam air 1000 mi. Atur pH hingga 8,0 + 0,1 dengan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N. 16Bob 2. Peretapan Fotansi Antibiatik Secara Mikrobiologi Dapar nomor 4; 0,1 M; pH 4,5; Larutkan 13,61 g kalium fosfat monobasa dalam 1000 m! air, Atur pH hingga 4,5 + 0,05 dengan asam fosfat 18 N atau natrium hidroksida 10 N. Dapar nomor 6; 10%; pH 6,0; Larutkan 20,0 g kalium fosfat dibasa dan 80,0 g kalium fosfat monobasa dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 6,0 = 0,05 dengan asam fosfat 18 N atau natrium hidroksida 10 N, Dapar nomor 10; 0,2 M; pH 10,5; Larutkan 35,0 g kalium fosfat dibasa dalam 1000 ml air dan tambahkan 2 ml kalium hidroksida 10 N. Atur pH. hingga 10,5 + 0,1 menggunakan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N. Daparnomor 16; 0,1 M; pH_7,0; Larutkan 13,6 g kalium fosfat dibasa dan 4,0 g kalium fosfat monobasa dalam 1000 ml air. Atur PH hingga 7,0 + 0,2 dengan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N. Larutan Jain. Untuk air, gunakan air suling; untuk natrium klorida, gunakan injeksi natrium klorida; formaldehida encer adalah larutan formal- dehida yang diencerkan dengan air 1: 3 Unit dan Baku Pembanding Potensi antibiotik dinyatakan dalam “unit” atau “ug” aktivitas antibiotik. Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI) dikalibrasi terhadap baku primer antibiotik yang bersangkutan. Antibiotik BPFI dibuat dan diedarkan oleh instansi yang berwenang. Pengertian “1g” aktivitas berasal dari sediaan antibiotik yang dipilih sebagai baku pembanding yang secara keseluruhan dianggap terdiri dari bahan kimia tunggal. Oleh karena itu, potensi dinyatakan 1000 “[ug” per mg. Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan metode pembuatan dan Pemurian antibiotik tertentu, aktivitas sediaan dapat lebih dari 1000 “yg” per mg, Oleh Karena itu, dapat dimengerti bahwa sediaan yang demikian mempunyai aktivitas yang setara dengan jumlah tertentu “jig” baku pem- banding asli. Akan tetapi, pada umumnya “yg” aktivitas adalah tepat setara secara numerik dengan ug (bobot) sediaan muni. Kesulitan timbul pada beberapa keadaan, misalnya jika antibiotik ter- diri dari bentuk basa bebas dan garamnya, dan “lug” aktivitas dinyatakan untuk salah satu dari bentuk tersebut; bahan antibiotik terdiri dari sejumlah komponen yang, memiliki sifat kimia yang sangat mirip, tetapi mempunyai aktivitas antibiotik yang berbeda; atau ‘potensi satu kelompok antibiotik dinyatakan dengan baku pembanding yang merupakan salah satu antibiotik anggotanya, tetapi sediaan itu senditi dapat tidak serba sama (heterogen). Dalam hal ini, “ug” aktivitas dinyatakan dalam “unit”. “yg” aktivitas tidak boleh dianggap sama dengan yg (bobot) bahan antibiotik Untuk amfoterisin B dan nistatin, buat larutan baku pembanding dan larutan uji secara bersamaaan, teks berlanjut ke him. 20 17Buky Ajar Analisis Hoya Bz av {ey OF Ba | Lay] “(1w8u 91) louonry (LD joruajues01 mos ra ury L aw} va (1D) uMsesyory ator ea ey OF aw) any (1D) ustuepuny 84 0c ra ey aw) ra (1D) varswequey, 3401 av ey OF ay ay GW) urstuxuey 31 9 ta e4 OF ay ea (>) usm, Bo ca Bet hd Bu 1 [eg] “(w/w 94) ounsyy CD) esnionyss 31 "0 av ais, Bw) N1'O tPHOPOUPHY Wesy (0 uippsis90q mos ra wey aw) va (7D) ese=4oPHIG ‘ator ay wey OF Bw} aw (G2) ursimorda.nsoupiyig Mor ta ey OF Bay ta (Cp) sspucede.ascspnnc 10 av yey Buy EpLOPY wesy CD) epysoppewsg Mor a ey 06 Buy Lea) “iu 91) juny (1D) uswounyeg, nwo ora Bey ri nz 0 (1D) ussunostg at 0 ea wey BOO any ) unrsicuny 3401 av ey bi ‘Bu | aw GQ) upenuy Bon ora * ‘ow EPIDOHNS UNG (7D) a uspmoyuny Tepagisg wad (used) eunnfueyas so2uaduad] rept) (gu 49d yun neve are {(eduuunyaqas (ex) [) ypeunprqara ‘seyapoye 3d) 4upre —veeunBusd ueeppasiod weydeaoup Sue pene uByeundip neve (99) Susdw9} yedua ssog — sa2uaTua, OEM SEIEG aepey sepEy) (EME wut WwN}aGas- eae] uedraued vesuysduag Ere? wep ANOIQNUY fp weanaey ves02u3 weeppasied weansey * -eduursaouadued uep ueeipasiad Supuequiad ueanue| uedeuag |°% [qeBab 2. Penetapan Potensi Antibiotik Secora Mikrobiologi nol 3H OF ast 8H 97’ BHO} Moz to's no} not nt gh ‘Bh yc0 not Sr ott Boy ad oy ‘BdsB0°0 ad's'o BHO 3 90'0 3250) wine sedep wped wiais02 Zuek UeBvaP rens—s OWOU RMP ,APAEP,, ey £ wey yt tet | ey OF ey ¢ ey ey Leu Hey IZ ueyy wey ph uey yt ey bh Haz ey OE wey yD Bey noo iw ut | Bu) wu} Su aw y 3w A000! 0001 aw Ba 1.0001 IN 100 *PHOM wesy ay av IN FO PHOP! wes ay va ra Jourrspy Gal sv va ea N 10 FPHOP) Wes PpIUELLUOYROUNC, fa ed ra. N Fo tpuops wesy ay {gal owj2u oF) 210 N 10°0 epHOM Wesy. Re RRR ere Pe R eR RR ER 1 UExERLLA}Y = On “ewes Wuek wey = , -weBuesa19y (1D) upemseg 11Z, 1D) vrs woyUER ) uisnaegoL (9D) g Usted (99) Suusued (7p) usiwoworeg {upp sesn995%0 (9D) UREN (Qusiwioen, (1D) uIstuoaNy 19Buku Ajor Analisis Heyoti Untuk ampisilin, buat enceran larutan baku pembanding dan larutan uji secara bersamaan. Untuk amfoterisin B, larutan persediaan selanjutnya diencerkan de- ngan dimetil sulfoksida hingga diperoleh kadar 12,8 ug, 16 pg, 20 pg, 25 Wg, dan 31,2 yg per ml pada saat menjelang pembuatan larutan uji. Enceran larutan uji harus mengandung dimetil sulfoksida dalam jumlah yang sama seperti pada enceran larutan baku pembanding. Untuk zink basitrasin, setiap enceran larutan baku harus mengandung asam klorida sejumlah sama dengan enceran larutan uji. Untuk neomisin yang ditetapkan dengan cara turbidimetri, larutan persediaan 100 ug per ml diencerkan secara kuantitatif dengan dapar nomor 3 hingga diperoleh larutan dengan kadar setara 25,0 4g neomisin per ml. Ke dalam labu ukur 50 ml yang terpisah, masukkan masing-masing 1,39 ml; 1,67 ml; 2,00 ml; 2,40 ml; dan 2,88 ml larutan ini, tambahkan 5,0 ml asam Klorida 0,01 N pada setiap labu dan encerkan dengan dapar nomor 3 sampai garis tanda50 ml hingga diperoleh kadar larutan 0,69 j1g; 0,83 yg: 1,0 pg: 1,2 pg: dan 1,44 ig neomisin per ml. Gunakan larutan ini untuk membuat garis respons baku. Untuk nistatin, larutan persediaan selanjutnya diencerkan dengan di- metilformamida hingga diperoleh kadar 256 unit, 320 unit, 400 unit, 500 unit, dan 624 unit per ml pada saat menjelang membuat pengenceran larutan uji. Buat larutan baku untuk garis respons bersamaan dengan pengenceran larutan uji. Enceran larutan uji harus mengandung dimetilformamida dalam jumlah yang sama seperti pada larutan baku. Untuk polimiksin B, buat larutan persediaan dengan menambahkan 2 ml air untuk setiap 5 mg bahan baku pembanding. Untuk suspensi steril prokain penisilin G dengan aluminium stearat, peetapan hanya dengan cara lempeng silinder dan menggunakan penisilin G . Jika dinyatakan, keringkan lebih kurang 100 mg baku pembanding da- lam oven hampa udara pada tekanan 5 mmHg atau kurang pada suhu 60°C selama3 jam sebelum digunakan, kecuali bleomisin BPF (lakukan pengeringan pada suhu 25°C selamad jam); dibidrostreptomisin BPFI (lakukan pengeringan pada suhu 100°C selama 4 jam); geittamisin BPFI (lakukan pengeringan pada suhu 110°C selama 3 jam); dan nistatin BPFI (lakukan pengeringan pada suhu 40°C selama 2 jam). Penyiapan Baku Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah baku pemban- ding antibiotik yang ditimbang saksama dan sebelumnya telah dikeringkan seperti yang tertera pada Tabel 2.1, atau seluruh isi satu vial, jika diperlukan, dalam pelarut seperti yang tertera pada Tabel 2.1, kemudian encerkan hingga kadar yang dikehendaki. Simpan dalam lemari pendingin dan gunakan 20Bob 2. Penetapan Potensi Antbiotik Secara Mikrobiologi Tabel 2.2 Mikroorganisme uji untuk penetapan antibiotik Antibiotike Mikroorganisme uji Nomor ATCC Amfoterisin B Sacchoromyces cerevisioe 9763 + Amikasin Stophylococeus aureus 29737 Ampisiin Micrococcus luteus 9341 Basitrasin Micrococars luteus 10240 Bleomisin ‘Mycobacterium smegmatis 607 Daktinomisin Boils subtilis 6633 Demeklosikiin Stophylococcus aureus 29737 Dihidrostreptomisin (CL) Bacillus subtilis 6633 z Dihidrostreptomisin (T) Klebsiella pneumoniae 10031 Diktoksasitin Stophylococeus aureus 29737 Doksisiklin Staphylococcus aureus 29737 Eritromisin Micrococcus luteus 934) Gentamisin Stophylococeus epidermidss ¥2228 Kanamisin Staphylococcus aureus 29737 Karbenisitin Pseudomonas cenuginesa 25619 Klindamisin ‘Micrococcus luteus 9341 Kloksasilin Stophylococeus aureus 29737 Kloramfenikol Escherichia coli 10536 Klortetrasiklin Staphylococaus aureus 29737 Kolistin Bordetella bronchiseptica 4617 Linkomisin Stophylococaus aureus 2737 Minosiklin Staphylococcus aureus 29737 Mirornisin Bocilus subuiis 6633 Neomisin (CL) Staphylococcus epidermidis 12228 Neomisin (T) Kiebsiello pneumonioe 10031 Nistatin Socchoromyces cerevisioe 2601 Oksitetrasiktin Staphylococcus aureus 29737 Paramomisin Staphylococcus epidermidis 12228 Penisilin G Staphylococcus oureus 29737 Polimiksin B Bordetella bronchiseptica 4617 Sefaleksin Stophylococeus aureus 29737 Sefradin * Staphylococcus aureus 29737 Streptomisin (T) Klebsiella pneumoniae 10031 Tecrasiklin Staphylococcus oureus 29737 Tebramisin Staphylococcus aureus 29737 ‘Yankomisin Boils subtilis 6633 dalam waktu yang ditentukan. Pada hari penetapan, buat pengenceran dari larutan persediaan sebanyak lima atau lebih larutan untuk pengujian de- ngan perbandingan kadar 1:1,25 untuk penetapan dengan cara lempeng silinder, atau lebih kecil untuk penetapan turbidimetri. Gunakan pengencer akhir yang dinyatakan dan urutan kadar dengan dosis tengah yang di- tentukan. 21Buku Ajar Anolisis Hoyati Penyiapan Contoh Dari informasi yang ada untuk penyiapan sediaan yang akan diuji (contoh), berikan perkiraan potensi setiap satuan bobot atau volume. Berdasarkan perkiraan ini, buat larutan persediaan dan enceran larutan uji pada hari penetapan, seperti tertera untuk setiap antibiotik dengan pengencer akhir yang sama seperti untuk baku pembanding. Penetapan menggunakan 5 tingkat dosis baku, memerlukan hanya 1 tingkat dosis contoh pada kadar perkiraan sama dengan aras dosis tengah baku. Mikroorganisme dan Inokula Mikroorganisme Uji ’kroorganisme uji untuk setiap antibiotik beserta nomor identifikasi Amte- rican Type Culture Collection (ATCC) yang bersangkutan tertera pada Tabel 2.2. Metode penetapan dengan mikroorganisme uji tersebut tertera pada Tabel 2.1. Pelihara biakan pada media agar miring dengan kondisi inkubasi seperti tertera pada Tabel 2.3, dan pindahkan setiap minggu pada agar miring yang baru. Untuk Klebsiella pneumoniae, gunakan biakan tidak berkapsul. Penyiapan Inokula Untuk persiapan penetapan, inokulasikan biakan segar mikroorganisme dari agar miring atau biakan lain ke permukaan 250 ml media agar yang tertera pada Tabel 2.3 dalam sebuah botol Roux, kecuali untuk Streptococcus faeciure yang dibiakkan dalam media cair. Sebarkan suspensi secara merata ke atas permukaan agar dengan bantuan butiran kaca steril dan inkubasikan pada suhu yang ditetapkan selama waktu tertentu. Pada akhir periode inkubasi, ‘buat suspensi persediaan dengan mengumpulkan biakan permukaan ke dalam 50 mi larutan natrium klorida 0,9% steril kecuali untuk bleomisin (gunakan 50 mi Media 34). Untuk penetapan, encerkan sebagian suspensi persediaan dengan me- nambahkan sejumlah volume air steril atau Iarutan natrium klorida 0.9% steril seperti tertera pada Tabel 2.3 dan ukur transmitansnya pada 580 nm. Atur perbandingan hingga inokula mempunyai transmitans 25% terhadap larutan natrium klorida 0,9% sebagai blangko. Untuk penetapan secara tur- bidimetri, jika perlu, buat beberapa komposisi suspensi persediaan hingga diperolch hubungan optimal antara dosis dan respons. Untuk penetapan dengan cara lempeng silinder, tetapkan dengan per- cobaan untuk mengatur jumlah suspensi persediaan yang dimasukkan un- tuk inokula, dimulai dengan volume yang tertera pada Tabel 2.3 hingga menghasilkan batas daerah hambatan yang memuaskan dengan diameter lebih kurang 14 mm sampai 16 mm dan memberikan suatu hubungan dosis yang reprodusibel. Buat inokula dengan menambahkan sejumlah suspensi 22Bob 2. Penetopan Fotensi Antibiot Secare Mikrobiclogi persediaan ke dalam media agar yang telah dicairkan dan didinginkan hing- ga suhu 45°C sampai 50°C, putar hingga diperoleh suspensi homogen. Pada penetapan karbenisilin untuk Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619), lebih baik menggunakan suspensi pengenceran inokula dengan transmitans 25% daripada menggunakan suspensi persediaan untuk membuat suspensi inokula. Untuk penetapan bleomisin, suspensikan mikroorganisme uji Myco- bacterium smegmatis (ATCC 607) dalam Media 34 sebagai pengganti larutan natrium klorida 0,9% untuk pengukuran transmitans. Perlu diingat bahwa pengenceran suspensi persediaan untuk mem- peroleh transmitans 25% adalah untuk memeriksa kualitas suspensi dan tidak digunakan untuk pembuatan suspensi inokula, kecuali seperti yang tersebut di atas, Pada semua hal lainnya, masukkan sejumlah suspensi per- sediaan yang tidak diencerkan, dalam media yang dinyatakan dengan no- mor, untuk pembuatan inokula seperti dalam susunan awal yang disaran- kan. Cara Pengujian Rancangan Penetapan Penetapan secara mikrobiologi akan menghasilkan presisi yang meyakinkan melalui pemisahan sumber-sumber penyebab kesalahan potensial dan yang relatif besar dengan menggunakan rancangan penetapan yang sesuai Pada penetapan dengan metode lempeng silinder, perbandingan pokok di- batasi oleh hubungan pengukuran diameter hambatan antarlempeng, tidak termasuk variasi di antara lempeng pada penyiapannya dan penanganan berikutnya, Untuk melaksanakan penetapan turbidimetri schingga perbeda- an kekeruhan yang diamati akan menggambarkan perbedaan kadar anti- biotik, diperlukan keseragaman suhu tabung melalui pengendali termostatik dalam inkubator dan penghindaran bias sistematik dengan penempatan tabung secara acak dalam rak terpisah; setiap rak terdiri atas satu set per- lakuan yang lengkap. Perbandingan pokok kemudian dibatasi pada hubung- an antara kekeruhan yang diamati pada setiap rak. Perlu diingat bahwa untuk beberapa tujuan, rancangan penetapan di- atur sedemikian rupa sehingga setiap satu set perlakuan terdiri atas tidak kurang dari 3 tabung untuk setiap kadar contoh dan kadar baku, dan setiap set ditempatkan dalam satu rak. Dengan pembatasan ini, dianjurkan untuk menggunakan rancangan Penetapan satu aras dosis dengan suatu kurva baku. Pada penetapan dengan kurva baku, buat pengenceran larutan sebanyak 5, 6, atau lebih, di antaranya satu kadar yang sesuai dengan kadar rujukan (S;) baku dan larutan uji dengan satu aras dosis tengah seperti tertera pada Tabel 2.1, Suatu penetapan dianggap sebagai penetapan pendahuluan jika potensi yang dihitung kurang 23Buky Ajar Analisis HayatiBob 2. Penelopan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi Bahan dongs hak citeBuku Ajar Analisis Hayat dari 80% atau lebih dari 125% dari yang diperkirakan pada penyiapan la- rutan uji persediaan. Dalam hal ini, tentukan perkiraan potensi yang sesuai dan ulangi penetapan. Penetapan potensi secara mikrobiologi dipengaruhi oleh variabel antar- penetapan dan intra-penetapan, sehingga diperlukan dua atau lebih pene- tapan yang berdiri sendiri untuk perkiraan potensi yang dapat dipercaya dari penetapan sediaan tertentu atau sediaan‘uji. Diawali dengan penyiapan terpisah larutan persediaan dan pengenceran baik baku maupun sediaan Uji, ulangi penetapan sediaan uji pada hari yang berbeda. Jika potensi perkiraan pada penetapan kedua berbeda secara signifikan dari yang pertama, di- tunjukkan oleh kesalahan baku terhitung, lakukan satu atau lebih penetapan tambahan, Gabungan hasil suatu seri kecil penetapan yang berdiri sendiri dalam sebaran beberapa hari merupakan perkiraan potensi yang lebih di- percaya daripada satu penetapan yang besar dengan jumlah keseluruhan cawan atau tabung yang sama. Metode Lempeng Silinder Pada penyiapan lempeng penetapan menggunakan cawan petri, tuang 21 ml Media 2 ke dalam sejumiah cawan yang diperlukan dan biarkan memadat sebagai lapisan dasar yang licin dengan ketebalan seragam, kecuali untuk amfoterisin B dan nistatin yang tidak menggunakan lapisan dasar yang terpisah. Untuk ampisilin, klindamisin, eritromisin, gentamisin, linkomisin, neomisin B, dan paromomisin, gunakan Media 1]; untuk bleomisin, gunakan 10 ml Media 35; untuk dihidrostreptomisin, gunakan Media 5; untuk dakti- nomisin, gunakan 10 ml Media 5; untuk mitomisin dan vankomisin gunakan 10 ml Media 8; dan untuk karbenisilin, kolistin, dan polimiksin B, gunakan Media 9. Tambahkan 4,0 ml lapisan inokula seperti tertera pada Penyiapan Inokula dalam Tabel 2.3, buat seperti yang tertera pada masing-masing anti- biotik, kecuali bleomisin (gunakan 6 mi), netilmisin (gunakan 5 ml), serta natamisin, nistatin, dan amfoterisin B (gunakan 8 ml), putarkan lempeng untuk menyebar-ratakan inokula pada permukaan dan biarkan memadat. Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan yang telah diinokulasi dari ke- tinggian 12 mm, menggunakan alat mekanik atau alat lain untuk menjamin penempatannya pada radius 2,8 cm, kemudian lempeng ditutup untuk men- cegah kontaminasi. Setelah ke-6 silinder pada setiap cawan petri diisi dengan enceran larutan antibiotik seperti yang tertera dalam Tabel 2.3, lempeng diinkubasi pada suhu 32°C sampai 35°C, atau pada suhu seperti tertera di bawah ini sesuai dengan masing-masing antibiotik selama 16 jam sampai 18 jam. Ambil semua silinder, ukur dan catat diameter setiap hambatan per- tumbuhan hingga mendekati 0,1 mm. Inkubasi lempeng pada suhu 29°C sampai 30°C untuk amfoterisin B, nistatin, dan rifampisin. Inkubasi pada suhu 36°C sampai 37,5°C untuk karbenisilin, klindamisin, kolistin, daktino- misin, dihidrostreptomisin, gentamisin, mitomisin, neomisin, paromomisin, polimiksin B, dan vankomisin 26Bob 2. Penetopan Polensi Antibiot Secara Mikrabiologi Pada penetapan satu aras dosis dengan kurva baku, buat pengenceran dengan 5 aras dosis baku (S, sampai $.) dan satu aras dosis uji (U3) yang sesuai dengan S, kurva baku, seperti yang tertera pada Tabel 2.1. Untuk memperoleh kurva baku, isi silinder selarig-seling. pada setiap 3 lempeng, dengan dosis tengah baku (S3) dan setiap silinder dari 9 silinder sisanya dengan satu dari empat pengenceran larutan baku, Lakukan hal yang sama untuk 3 pengenceran baku lainnya. Untuk setiap sediaan uji, isi silinder selang-seling pada setiap 3 lempeng dengan dosis tengah baku (S;) dan 9 silinder sisa dengan enceran larutan uji yang sebanding (U3). Metode Turbidimetri Pada hari penetapan, dipakai dosis yang diperlukan dengan mengencerkan larutan persediaan baku dan setiap larutan uji seperti tertera pada Tabel 2.1 ‘Tambahkan 1 ml setiap dosis pada masing-masing 3 tabung reaksi yang telah disiapkan dan tempatkan 3 replikat tabung dengan posisi secara acak pada tak tabung. Secara bersamaan, letakkan 1 tabung atau 2 tabung kontrol yang berisi 1 ml pengencer (lihat Tabel 2.3) pada setiap rak, tetapi tanpa antibiotik, Setelah semua pengisian larutan selesai (untuk kandisidin dalam waktu 30 menit ketika air ditambahkan pada larutan persediaan metilsulfoksida), tambahkan 9,0 ml inokula ke dalam setiap tabung pada rak, dan setelah pengisian lengkap, rak segera ditempatkan dalam inkubator atau tangas air dengan suhu yang dipertahankan pada 36°C sampai 37,5°C selama 2 jam sampai 4 jam, kecuali untuk kandisidin (inkubasi pada suhu 27°C sampai 29°C selama 16 jam sampai 18 jam). Setelah inkubasi, tambahkan 0,5 ml larutan formaldehida encer ke dalam setiap tabung pada satu rak dalam waktu yang bersamaan, dan ukur transmitans atau serapan pada 530 nm. Pada penetapan satu aras dosis dengan kurva baku, buat pengenceran hingga lima aras dosis larutan baku (S, sampai S) dan satu aras dosis larutan uji (Us) dari setiap sediaan sampai dengan 20 sediaan uji yang sama dengan 5) baku. Buat juga 1 5; lain sebagai uji pertumbuhan. Tambahkan 1 ml ma- sing-masing larutan uji pada 3 tabung dan 1 ml pengencer bebas-antibiotik pada 6 tabung sebagai kontro}. Letakkan secara acak satu set lengkap, ter- masuk 2 tabung kontrol, pada satu rak tabung. Tambahkan 9,0 ml inokula, inkubasikan, tambahkan 0,5 m! fomaldehida encer dan lanjutkan penetapan seperti di atas. Tetapkan masa inkubasi yang pasti dengan mengamati per- tumbuhan pada kadar rujukan (dosis tengah) pengenceran baku (S;). Cara Menghitung Potensi Penghitungan potensi dari data yang diperoleh dengan metode lempeng silinder atau turbidimetri dilakukan dengan menggunakan metode garis lurus transformasi log dengan prosedur penyesuaian kuadrat terkecil dan uji inearitas. Jika sejumlah penetapan bahan uji yang sama dilakukan meng- gunakan kurva baku yang sama, hitung koefisien variasi dari hasil semua 27Buku Ajar Analisis Hoyat! penetapan bahan uji. Jika lebih dari satu penetapan dilakukan untuk bahan uji yang sama dengan kurva baku yang berbeda, buat rata-rata dari dua atau lebih nilai potensi. Pemasangan silinder/cakram filter pada lapisan agar di dalam cawan petri dilakukan dengan meletakkan silinder besi tahan karat atau cakram kertas dengan jarak satu sama lain +20-25 mm. Gambar 2.1. Posisi peletakan cakram standar dan cakram uji pada cawan peeri. Cara meneteskan larutan uji (U) dan larutan standar (S) adalah dengan 1. ‘Menyusun urutan penetesan seperti pada Gambar 2.1, 2. meneteskan setiap pengenceran 20 pil pada silinder atau cakram kertas (diameter 6 mm), 3. pada waktu meneteskan larutan pada silinder besi tahan karat, jangan kena dinding silinder, dan 4. inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C, Perhitungan Potensi Antibiotik dengan Metode Lempeng Silinder Cara Untuk pengujian 3 desis setiap sediaan ‘Standar (5) Jumlah zona kons, rendah $i Jumlah zona kons. menengah S Jumlah zona kons. tinggi Jumlah sediaan S(4 S25 Kontras linear Sy-S= ls 238past ly (d—1)Inh Ss Veen ond Rasio potensi Ry= antilog My Potensi = Ry = 100% Keterangan Bab 2. Penetopan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi U Yrs ve" nd b = slope (kemiringan) regresi zona log konsentrasi semua sediaan d= banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3 h = banyaknya sediaan termasuk standar = 2 n= banyaknya penggandaan setiap perlakuan = 6 1 = interval log konsentrasi berdampingan (log S,- log 5; = log 5, - log S:) Contoh perhitungan potensi 3 dosis setiap larutan sediaan: Data zona hambatan (mm) larutan standar dan larutan uji (U) No. petri §) U, 1 1050-1263 14,63 10.63. 1240 14.63 2 1065" 1263 14,55 11,04 12,50 14.63 3 1053 1263) 15.45 10,70 1265 4465 4 1063 - 12,50 15,68 1065-1265 14,60 4 1063 12,58 14,60 1060. 1258 14,53 6 1054.7 12,70 14,55 10,68 1265 14,25 Dengan menggunakan rumus pengujian 3 dosis setiap sediaan, diperoleh Jumiah zona Kons: rendah Jumlah zoha kons. menengah Jumiah zona kons. tings) Jumiah sediaan Kontras linear ‘Standar (S) 63,48 75.64 89,46 228,58 25,98 iL (Y) 64.3 75,43 87,29 227,02 299 29Buku Ajor Analisis Hayat : - 12,612 — 12,699 M 2 25,7628 =~ 0,0034 Rasio potensi Ry = 0,922 Potensi = 99,22% 227,02 Yy= ag 712612 Untuk menghitung batas keyakinan potensi yang diperoteh, digunakan ru- mus di bawah ini. Perhitungan ini baru dapat dilakukan jika dilakukan uji duplo atau triplo. = MO = SMe .. Batas keyakinan = antilog (2+ tSM) Harga t lihat pada tabel untuk f= 2 Data hasil uji potensi (triplo) M-= log potensi M -Mrata-rata n=jumlah percobaan Potensi (%) M w eM 100,23 2.001 72,0006 0,0004 16 * 107 100,092 2,0004 -0,0002 0,4 « 107 100,069 2,0003 -0:0003 09 « 107 229 * 107 -My 7 gm =ZMaMY 29x10" 145x107 n-1 3-1 SM= af 145x107 =3,81 x 104 30Bab 2. Penetapan Potensi Antibiofik Secara Mikrobiologi Batas keyakinan = antilog (2+ t SM) = antilog (2 + 4,3 « 381.10) = antilog (2 + 0,0016) = antilog 2,0016, dan antilog 1,9984 = 100,38%; 99,62% Batas keyakinan = 99,62% - 100,38% Tabel 2.4 Daftar nila f dant f t f ¢; I 1271 ira 24 2 4,30 18 210 2 3,18 19-20 2,09 4 2,78 2 2,08 5 2,57 22-23 207 6 245 24-26 2,06 7 2,36 27-29 2,05 8 231 30-32 2,04 + 2,26 33-37 2,03 10 2.23 3844 3,02 uw 2.20 45-53 2,01 2 218 54-69 2,00 13 216 70-95 199 14 24 96-159 1,98 1s 213 160 \,97 16 212 Tidak terhingga 1,96 Cara2 Untuk 2 dosis setiap sediaan og Uw SACS Ot Dio 3” U5) — Urs) i , logP U, dan S, = diameter hambatan dosis tinggi U, dan S; = diameter hambatan dosis rendah Si=1 pg + 4x => log 4 S=4 ug 34EGC 1743 ‘ BUKU AJAR ANALISIS HAYATI, Ed. 3 Oleh: DR. Harmita, Apt. & DR. Maksum Radji, M.Biomed. Editor: July Manurung, S.Si., Apt. Copy Editor: Tri Indah Marty Rahayu, A.Md.Pb. Diterbitkan pertama kali oleh Penerbit Buku Kedokteran EGC © 2006 Penerbit Buku Kedokteran EGC P.O. Box 4276/Jakarta 10042 ‘Telepon: 6530 6283 Anggota IKAPI Desain kulit muka: Yohanes Duta Kurnia Utama Hak cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip, memperbanyak, dan menerjemahkan sebagian atau seluruh isi buku ini tanpa izin tertulis dari penerbit. Cetakan I: 2008 Perpustakaan Nasional: Katalog Dalam Terbitan (KDT) Harmita ‘Buku ajar analisis hayati / Harmita, Maksum Radji ; editor, July Manurung. — Ed, 3.— Jakarta ; EGC, 2008. x, 167 hm. ; 15,5 « 24 em. ISBN 978-979-448-875-1 1. Farmakologi. I. Judul. Il, Maksum Radji. 11. July Manurung. 61SEdisi 3 CRT ANOIisis