PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

BASIC MECHANISM DESEASE

SUFIAH ASRI MULYAWATI, S.Si, M.Kes

YENTI PURNAMASARI, S.Si, M.Kes

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
2023
 KATA PENGANTAR

Mikroorganisme yang tersebar di seluruh alam ini memiliki berbagai macam jenis, hal
ini tidak dapat kita lihat langsung dengan kasat mata. Hal ini dapat dilihat dengan bantuan
mikroskop walaupun dengan uji-uji yang lain tentu juga akan sangat membantu. Klasifikasi
mikroorganisme dapat kita lihat dengan bantuan mikroskop. Dengan mikroskop kita dapat
mengetahui apakah yang kita teliti berupa bakteri, kapang atau khamir. Bakteri, kapang serta
khamir memiliki ciri-ciri tertentu yang dengan mudah dapat kita lihat dari morfologi dan
bentuk mikroorganisme tersebut. Bakteri bisa berbentuk batang, bulat, spiral, koma baik
secara berpasang-pasangan atau tunggal.
Penuntun ini dibuat untuk melengkapi bahan ajar praktikum Mikrobiologi Blok Basic
mechanism Desease dan hanya digunakan dalam lingkup Fakultas Kedokteran Universitas
Halu Oleo. Materi yang disajikan mengikuti rangkaian urutan materi yang disajikan dalam
kurikulum Fakultas Kedokteran Universitas Halu Oleo. Tentunya dalam penyusunan
penuntun ini sangat diperlukan berbagai saran yang membangun, oleh karena itu kami sangat
menghargai setiap masukan yang disampaikan guna perbaikan buku penuntun ini.

Tim Mikrobiologi FK UHO

2023

2
 TATA-TERTIB LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS KEDOKTERAN UHO

Di Laboratorium Mikrobiologi, praktikan akan bekerja dan terpapar dengan berbagai

mikroorganisme, baik yang patogen maupun tidak. Bakteri patogen dapat menyebabkan
kerusakan, penyakit bahkan kematian. Untuk itu diharapkan para praktikan mengutamakan
perlindungan dan keselamatan diri dengan memperhatikan, mengindahkan serta
melaksanakan sejumlah peraturan di bawah ini:

1. Alat Pelindung Diri (APD) berupa jas laboratorium, masker, sarung tangan dan sepatu
tertutup harus selalu digunakan pada saat bekerja di Laboratorium. Jas Laboratorium
harus digunakan dengan benar (terkancing seluruhnya). Pada kegiatan tertentu dimana
anda bekerja dengan organisme yang berbahaya atau mengerjakan pekerjaan yang sangat
rawan terhadap kontaminasi, selalu gunakan sarung tangan dan masker.

2. Rambut panjang harap diikat dan bagi yang memakai penutup kepala (kerudung) harus
dimasukkan ke dalam jas laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan bahaya api.

3. Jangan letakkan tas dan barang pribadi lainnya di atas meja kerja. Barang pribadi dapat
diletakkan di luar laboratorium, di loker atau di tempat terpisah lainnya.

4. Perlakukan semua mikroorganisme yang digunakan di laboratorium sebagai

mikroorganisme patogen.

5. Selalu cuci tangan anda dengan sabun atau cairan desinfektan sebelum dan sesudah
bekerja di laboratorium.

6. Selalu desinfeksi meja kerja sebelum dan sesudah bekerja.

7. Dilarang makan, minum dan merokok di dalam laboratorium. Praktikan juga dilarang
membawa makanan dan minuman ke dalam laboratorium. Pinsil, pulpen dan benda
lainnya yang anda gunakan selama bekerja harus dijauhkan dari mulut.
8. Semua material yang telah anda gunakan, baik yang terkontaminasi atau tidak, harus
diletakkan di tempat yang terpisah untuk kemudian disterilisasi.

9. Dilarang menggunakan telepon selular atau gadget lainnya pada saat

praktikum/penelitian, kecuali untuk kepentingan dokumentasi hasil kerja.

10. Dilarang membawa alat, bahan dan mikroba uji ke luar laboratorium.

3
11. Baca dan pelajari modul dan penuntun praktikum sebelum anda mengikuti kegiatan
praktikum

12. Jika terjadi kecelakaan selama praktikum atau penelitian berlangsung, segera laporkan
pada instruktur praktikum/laboran/staf bagian mikrobiologi.

13. Ikuti seluruh kegiatan praktikum/penelitian dengan tertib.

4
 DAFTAR ISI

Sampul 1
Kata Pengantar 2
Tata Tertib Laboratorium Mikrobiologi 3
Daftar Isi 5
Pendahuluan Pewarnaan Bakteri 6
Pembuatan Preparat/Apusan Bakteri 8
Pengecatan Sederhana/tunggal 12
Pengamatan Majemuk/Diferensial 16
Pengecatan Spora Bakteri Menurut Metode Klein dan Wirtz 20
Daftar Pustaka 22

5
 PENDAHULUAN
PEWARNAAN BAKTERI
Untuk mempelajari morfologi, bentuk, struktur, ukuran dan susunan bakteri dari
sediaan hidup dan mati dapat dilakukan dengan cara pewarnaan.

Dalam hal ini akan dibahas tentang Pewarnaan Kuman/ Bakteri.

I. Tujuan Pewarnaan
1. Melihat bentuk dan letak susunan kuman
2. Mempelajari struktur
3. Struktur kimia
4. Pengaruh perkembangan dan pertumbuhan
Zat warna adalah zat kimia sintesis sejenis anilin (turunan fenol)
II. Tujuan Fiksasi
1. Agar sediaan kuman itu melekat pada objek sehingga tidak lepas pada
sediaan saat dibilas dengan air.
2. Agar kuman yang hidup cepat mati.
3. Karena kuman yang mati akan lebih cepat menyerap warna sehingga pewarnaan
lebih baik.
4. Bentuk kuman sebelum dan sesudah diwarnai tetap.
5. Sediaan kuman tahan lama disimpan.
III. Macam-macam Pewarnaan Bakteri
1. Pewarnaan Sederhana (Simple Staining/ Progressive Staining)
2. Pewarnaan Bertingkat (Differential Staining/ Regressive Staining)
a. Pewarnaan Gram
b. Pewarnaan Tahan Asam dengan cara: Zeihl Neelsen dan Kinyoun Gabbet
3. Pewarnaan Spora dengan cara:
a. Schaeffer Fulton
b. Klein
4. Pewarnaan Khusus (Special Staining)
a. Pewarnaan Polikromatik misal Giemsa
b. Pewarnaan Metakhromatik misal Loeffler, Neisser, Albert, Ljubinsky
5. Pewarnaan Negative
6. Pewarnaan Kapsul dengan cara Burry.

6
7
 PEMBUATAN PREPARAT/ APUSAN BAKTERI

TUJUAN PEMBELAJARAN
Setelah menyelesaikan percobaan ini, diharapkan mahasiswa dapat:
1. Membuat Preparat/apusan dengan tepat sehingga akan mempermudah proses
visualisasi bakteri secara mikroskopik dengan menggunakan semua macam pewarnaan.

DASAR TEORI
Pada dasarnya semua prosedur pewarnaan mikrobiologis membutuhkan preparasi smear
sebelum perlakuan pada tiap teknik spesifik pewarnaan yang tercantum dibawah ini.
Tekniknya meskipun sulit, memerlukan ketelitian yang cukup untuk preparasinya. Peraturan
dasar berikut ini harus diikuti secara cermat.
1. Preparasi pada slide: kebersihan slide merupakan hal yang penting untuk preparasi
smear mikroba. Lemak atau minyak dri jari pada slide harus dihilangkan denga
mencuci slide dengan sabun dan air atau bubuk gosok, diikuti dengan bilasan air dan
bilas dengan alkohol 95%. Slide harus dikeringkan dan diletakkan pada lap
laboratorium sampai siap digunakan.
2. Preparasi smear: hindari terlalu tebal, ketebalan smear sangatlah penting. Smear yang
baik hanya sekali, jika sudah kering, nampak lapisan putih yang tipis. Untuk
pembuatan dari kultur broth atau kultur medium padat memerlukan teknik yang
berbeda.
a. Kultur broth (cair): satu atau dua loop penuh suspensi sel langsung letakkan
pada slide dengan loop inokulasi steril dan oleskan merata pada area tertentu kira-
kira seukuran koin.
b. Kultur dari medium padat: kultur organisme pada medium padat cukup tebal,
ketebalan pertumbuhan ada di permukaan dan dianjurkan tidak langsung
dipindahkan ke slide. Kultur ini harus diencerkan terlebih dahulu dengan
meletakkan satu loop penuh air pada slide dimana kemudia sel akan diemulsikan.
Pindahkan sel dari kultur yang diinginkan menggunakan jarum inokulasi steril.
Hanya ujung jarum yang disentuhkan pada kultur untuk menghindari pemindahan
terlalu banyak sel. Suspensi dilakukan dengan menyebarkan sel dengan gerakan
sirkuler pada tetes air dengan ujung jarum. Terakhir smear harus berupa area
seukuran koin logam. Dan nampak semitransparan, rata, dan putih tipis. Sebelum

8
 melanjutkan prosedur, smear harus kering sempurna. Jangan meniup slide atau
mengayunkannya di udara.
3. Fiksasi panas: jika slide tidak difiksasi, smear bakteri akan tercuci selama prosedur
pewarnaan. Hal tersebut dihindari dengan fiksasi panas, selama melakukan fiksasi
protein bakteri terkoagulasi dan menempel pada permukaan slide. Fiksasi panas
dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-udarakan dua atau tiga
kali pada api bunsen.

Tujuan :Untuk membuat preparat/ sediaan dari sampel padat maupun cair
Alat :- Ose
- Objek Glass
- Api Spiritus
Reagen : - Pz (Phisiologi Zolution) / NaCl 0.85-0.9 %
Bahan : Biakan padat maupun cair dari kultur murni (Staphylococcus aureus,
Escherichia coli dan lainnya), sputum (dahak), usap tenggorok, usap
hidung, pus (nanah) dan lain-lain.

Prosedur :
1. Dari Media Cair
a. Menyiapkan semua Alat dan reagent dimeja kerja
b. Menyeteril /memijarkan ose dengan api spirtus dan kemudiandidinginkan
c. Mengambil bahan sebanyak 1 mata ose dan buat apusan pada obyek glass hingga
tipis dengan ukuran kira-kira 1 x 1,5 cm
d. Menyeteril /memijarkan ose kembali
e. Mengeringkan preparat dengan cara diangin-anginkan hingga terlihat bercak putih
di obyek glass

f. Menfiksasi obyek glass 3x di atas api spirtus

g. Preparat siap di warnai
2. Dari Media Agar /padat
a. Menyiapkan semua Alat dan reagent di meja kerja
b. Menyetril/memijarkan Ose dengan api spirtus dan kemudian mendinginkannya.
c. Mengambil 1-2 mata ose PZ letakkan pada slide, mengambil bahan sebanyak 1 mata
ose dan buat apusan pada obyek glass hingga tipis dengan ukuran kira-kira 1 x 1,5
cm

9
 d. Menyeteril/memijarkan Ose kembali
e. Mengeringkan preparat dengan cara diangin-anginkan hingga terlihat bercak putih
di obyek glass
f. Menfiksasi obyek glass 3x di atas api spirtus
g. Preparat siap di warnai
3. Sputum
a. Semua Alat dan reagen disiapkan dimeja kerja
b. Menyeteril/memijarkan Ose dengan api spirtus dan kemudian didinginkan
c. Mengambil bahan yang kental dengan cara sedikit menggeser ose tanpa menekan
dan membuat apusan pada obyek glass hingga tipis dengan ukuran kira-kira 1 x 1,5
cm
d. Memasukkan / mencelupkan Ose pada pasir alkohol
e. Menyeteril Ose kembali
f. Mengeringkan dengan cara mengangin-anginkan hingga terlihat bercak putih di
obyek glass
g. Menfiksasi obyek glass 3x di atas api spirtus
h. Mewarnai preparat

Catatan :
1. Ose steril adalah ose yang dibakar dalam api spirtus sampai merah membara
kemudian didinginkan.

2. Swab steril digunakan untuk mengambil specimen usap tenggorok, usap hidung dan
pus/ nanah, ose steril digunakan untuk mengambil specimen sputum.
3. Fiksasi adalah melidah apikan / melewatkan punggung slide (sediaan berada di atas)
dalam nyala api sebanyak 3 kali.
4. Tujuan fiksasi : untuk mematikan kuman, tidak merubah morfologi, melekatkan pada
obyek glass dan sediaan kuman lebih tahan lama untuk disimpan.
5. Fungsi PZ : untuk membuat suspensi kuman atau meratakan kuman pada preparat
6. Obyek glass yang dipakai harus bersih dan bebas lemak
7. Pembuatan slide / preparat harus tipis, rata, tidak ada gelembung udara, berbentuk oval
(+ 2 x 3 cm)
8. Setelah preparat difiksasi, harus didinginkan dulu kemudian baru dituangi reagen
pewarnaan

10
Untuk lebih jelasnya prosedur dapat dilihat pada Gambar 1 di bawah ini:

Gambar 1. Prosedur Pembuatan Apusan Bakteri

11
 Pewarnaan Sederhana/Tunggal

Bakteri bersifat transparan berukuran kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata
telanjang. Untuk mengetahui struktur, morfologi dan sifat kimia bakteri sehingga kita perlu
melakukan suatu pengecatan terhadap bakteri tersebut. Pengecatan bakteri tergantung dari
sifat fisik dan kimiawi zat warna tersebut. Persenyawaan zat warna harus memiliki
komponen-komponen warna dalam tiap molekulnya.

Pada pokoknya zat warna untuk melihat bakteri adalah bahan kimia dari golongan
anilin dan secara garis besar zat warna dibagi atas dua golongan, yaitu zat warna asam dan
zat warna basa. Istilah asam dan basa tidaklah menunjukkan reaksi kimianya, melainkan
untuk menunjukkan apakah zat warna tersebut bersatu dengan anion atau kation. Sebagai
contoh dalam reaksi zat warna methylene blue chlorida, yang bertindak sebagai zat warnanya
adalah kation methylene blue+.

Methylene blue chlorida ==== methylene blue+ +chlorida

Jadi dalam hal ini zat warna tersebut termasuk zat warna basa.

Pengecatan memiliki bermacam-macam jenis, ada pengecatan tunggal atau sederhana

dan pengecatan majemuk. Pengecatan tunggal atau sederhana biasanya pengecatan yang
menggunakan satu macam zat warna saja, misalnya carbol fuchsin, crystal violet atau
methylene blue. Sedangkan pengecatan majemuk ialah pengecatan yang menggunakan lebih
dari satu macam zat warna

PRINSIP
Pada pewarnaan sederhana, apusan bakteri diwarnai dengan suatu pereaksi tunggal
(menggunakan satu bahan pewarna saja), yang menghasilkan warna yang sangat kontras
antara mikroorganisme dengan latar belakangnya. Pewarna- pewarna basa dengan kromogen
bermuatan positif lebih disukai karena asam nukleat bakteri dan komponen-komponen
dinding sel tertentu bermuatan negatif sehingga kuat tertarik dan terikat pada kromagen
kationik. Pewarna-pewarna basa yang paling sering digunakan yaitu metilen biru, kristal
violet, dan karbol fuksin.

12
 MORFOLOGI KUMAN
➢ Berdasarkan bentuknya bakteri dibagi menjadi 3 kelompok:
1. Coccus : Bulat
2. Bacil : Batang
3. Spiral : Batang melengkung atau melingkar
➢ COCCUS
a. Diplococcus/ berduaan :
b. Streptococcus/ berderet :
c. Staphylococcus/ bergerombol :
d. Tetracoccus/ berempat :
e. Sarcina/ seperti kubus :
➢ BACIL
a. Diplobacil/ berdua : -- -- --
b. Streptobacil/ berderet : ------ ------- -------
c. Roset :
d. Palisade/ pagar : lllll lllll lllll
➢ SPIRAL
a. Koma : ,,,,,
b. Spiral :

Tujuan Praktikum

1. Mengerti teknik membuat preparasi dan dan pewarnaan dengan satu macam zat
warna

2. Mengetahui morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat
warna

A. Alat dan Bahan

Bahan :

1. Biakan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus

2. Zat warna crystal violet, methylene blue, safranin, carbol fuhsin

3. Minyak imersi

Alat :
Gelas objek
ose

13
 Gelas penutup

lampu spiritus

Mikroskop

B. Prosedur kerja :

a. Pembuatan apusan

Untuk mendapatkan hasil pengamatan yang baik, pembuatan apusan memegang peranan
penting. Bakteri yang terlalu bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas objek akan
menghasilkan gambaran yang kurang jelas setelah pengecatan

Cara membuat apusan

1. Bersihkan gelas objek dengan kapas yang sudah diberi alkohol 95% untuk
menghilangkan lemak dan mikroorganisme yang menempel, lalu keringkan di
udara
2. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi apusan

3. Ambil satu ose suspensi bakteri secara aseptik (ose dibakar di atas lampu spiritus
sampai memijar, kemudian didinginkan sebentar), lalu tempelkan pada bagian
dalam dari tabung biakan sebelum mengambil suspensi bakteri. Buat apusan
setipis mungkin di atas gelas objek di dalam batas lingkaran tadi
4. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan apusan di atas api secara cepat 2 sampai
3 kali. Maksudnya untuk membunuh bakteri secara cepat sehingga tidak
mengalami perubahan bentuk. Disamping itu fiksasi dapat melekatkan bakteri pada
gelas objek. Langkah-langkah pembuatan apusan di atas senantiasa dilakukan
sebelum kita melakukan pengecatan

b. Pengecatan

1. Tambahkan salah satu zat warna di atas apusan tadi dengan waktu yang sesuai,
yaitu untuk carbol fuchsin 15-20 detik, untuk safranin 30-45 detik dan methylene
blue 3-5 menit, cristal violet 45 menit – 1 menit.

2. Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan air untuk menghilangkan zat warna
yang tidak terpakai
3. Keringkan dengan kertas saring/tisu

14
 4. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x). Untuk
perbesaran kuat (lensa objektif 100x). Untuk perbesaran kuat ini harus selalu
dipakai immersion oil yang berguna untuk mengumpulkan cahaya
5. Catat dan gambar apa yang anda lihat

C. Hasil Pengamatan

Jenis Bakteri Deskripsi Mikroba Gambar Mikroba

E. coli

Staphylococcus
aureus

Pertanyaan :

1. Bagaimana morfologi dari kedua bakteri tersebut? Bisa anda deskripsikan!

2. Apakah ada perbedaan dari kedua bakteri tersebut ketika dilihat di bawah
mikroskop? Jelaskan!

15
 Pengecatan Majemuk/Diferensial
A. Pendahuluan
Latar Belakang
Christian Gram seorang bakteriologi pada tahun 1844 menemukan
penggolongan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Pewarnaan Gram merupakan
contoh pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif
dan Gram negatif. Teknik pewarnaan Gram ini dikembangkan oleh Christian Gram
untuk mencari suatu metode untuk memperlihatkan bakteri pneumokokus pada jaringan
paru- paru pasien yang mati karena pneumonia. Selain itu dia melihat bahwa beberapa
spesies bakteri dapat dibedakan dengan prosedur pewarnaan ini.
Bakteri yang diwarnai dengan metode Gram ini dibagi menjadi dua kelompok.
Salah satu di antaranya, bakteri Gram positif, yang mempertahankan zat pewarna ungu
kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri Gram negatif,
kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna
tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna merah. Bakteri Gram positif
banyak ditemukan Mg, sedangkan pada bakteri Gram negatif tidak.
Pewarnaan Gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak
digunakan untuk mencirikan banyak bakteri, terutama sangat diperlukan di laboratorium
diagnostik rumah sakit karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang
diwarnai dengan pewarnaan Gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan
organisme penyebab suatu infeksi.
Bakteri Gram positif dan Gram negatif berbeda dari struktur dan komposisi
dinding sel, kerentanan terhadap antibiotik pun berbeda-beda serta persyaratan
nutrisinya pun antara Gram positif dan negatif juga berbeda. Banyak pewarnaan
differensial lain digunakan secara luas dalam bakteriologi, contohnya pewarnaan Ziehl-
Nielsen, yaitu pewarnaan tahan asam.

PRINSIP
Pewarnaan differensial memerlukan penggunaan sedikitnya tiga pereaksi kimia
yang diberikan secara bertahap pada apusan yang telah difiksasi dengan pemanasan.
Pereaksi pertama disebut pewarna primer. Fungsi pewarna primer adalah untuk
memberikan warna kepada semua sel. Untuk menghasilkan kontras warna, pereaksi
kedua yang digunakan adalah senyawa pemucat. Pereaksi terakhir adalah pewarna
tandingan. Pewarnaan differensial yang paling penting yang digunakan pada
16
 bakteriologi adalah Pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram adalah suatu cara mewarnai
bakteri, dimana dengan pewarnaan ini bakteri dapat dibedakan menjadi 2 kelompok
yaitu kelompok Gram Positif dan Gram Negatif. Pada bakteri Gram Positif dapat
mempertahankan bahan pewarna basa (Pewarna primer) yaitu ungu (Kristal violet)
walaupun telah diberi bahan peluntur alkohol, maka bakteri tampak ungu tua. Sedang
pada bakteri Gram Negatif kehilangan ungu Kristal ketika dilunturkan dengan alkohol.
Sewaktu diberi bahan pewarna pembanding (pewarna tandingan) yaitu safranin atau air
fuchsin bakteri akanmengikatnya, maka tampak merah.

Tahapan pewarnaan Gram

Zat warna dan urutan Reaksi bakteri

penggunaannya Gram (+) Gram (-)
1. Kristal violet/ carbol Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu
gentian violet
2. Lugol Ikatan komplek Kristal Ikatan komplek Kristal
Violet - Iodium terbentuk Violet - Iodium terbentuk
dalam sel, sel tetap dalam sel, sel tetap
berwarna ungu. berwarna ungu.

3. Alkohol 70/ 96% Dinding sel dehidrasi, Lipid terekstraksi dari

pori-pori menciut, daya dinding, pori-pori
rembes dinding sel dan mengembang, Ikatan
Ikatan komplek Kristal komplek Kristal Violet -
Violet - Iodium tidak Iodium keluar dari sel
keluar sel tetap ungu sel tidak berwarna.

4. Safranin Sel tidak berpengaruh/ Sel menyerap warna

tidak terwarnai (tetap tersebut dan menjadi
berwarna ungu) merah.

Tujuan Intruksional
1. Mahasiswa mampu mengetahui pewarnaan Gram
2. Mahasiswa mampu mengetahui bakteri Gram positif dan Gram negatif
B. Alat dan Bahan
Bahan : Alat :
Biakan murni Bacillus subtilis dan Esherichia coli Gelas objek
Zat kimia/warna carbol Fuchsin/safranin, Ose
Cristal violet, Larutan lugol , alkohol 96% Lampu spiritus

17
C. Prosedur Kerja
1. Buat Apusan (seperti pada praktikum pengecatan tunggal)
2. Tambahkan pewarna crystal violet selama 1 menit, buang pewarna
3. Tambahkan larutan lugol 1 menit
4. Cuci dengan alkohol sampai tidak ada zat warna yang larut
5. Cuci dengan air dan tambahkan fuchsin/safranin 1-2 menit
6. Cuci dengan air lagi dan keringkan dengan kertas saring/tisu (dilap pelan dan lembut
saja)
7. Beri minyak imersi 1-2 tetes untuk perbesaran kuat (1000x)
8. Amati dengan mikroskop. Gram positif akan berwarna ungu (violet) dan Gram
negatif akan berwarna merah
9. Tuliskan reaksi pengikatan antara zat warna dan bakteri (baik bakteri Gram
positif dan Gram negatif)

D. Hasil Pengamatan

Bakteri Perbesaran Gambar dan Warna

E.coli

B.subtilis

18
19
 Pengecatan Spora Bakteri Menurut Metoda Klein dan Metode Wirtz

A. Pendahuluan

Beberapa bakteri memiliki spora dimana spora tersebut dapat berada di tengah
(central), berada di pinggir (terminal) atau tepi sel. Pelczar (1986), menyatakan bahwa
spora merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi, dihasilkan
pada fase lanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel
vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi.
Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh vegetatif bakteri disebut sebagai
‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh.
Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami
dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan
tambahan.

Pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus

dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan tersebut adalah dengan
penggunaan larutan hijau malakit 5% carbol fuchsin dan untuk memperjelas pengamatan.
Sel vegetatif juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetatif ini
berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi
spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat diidentifikasi.

B. Tujuan Intruksional
1. Mahasiswa mampu melakukan pengecatan pada bakteri yang berspora
2. Mahasiswa mampu melihat posisi spora yang berada di dalam sel

C. Alat dan Bahan

Bahan : Alat :
Biakan murni Bacillus subtilis atau spesies Bacillus lainnya Gelas objek , Ose
Zat kimia/warna carbol gentian violet, Lampu spiritus
Malachite green, Methylene blue, Safranin Tabung reaksi
Asam Sulfat alkohol 95% Penangas air
Termometer

20
D. Prosedur Kerja
I. Metode Klein I
1. Campuran suspensi bakteri dengan carbol fuchsin dalam tabung reaksi dengan
perbandingan 1:1, panaskan dalam penangas air selama 10 menit pada suhu
60oC
2. Buat apusan dari campuran suspensi tadi
3. Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik
4. Cuci dengan air, tambahkan metilen biru 3 menit
5. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring
6. Amati dengan perbesaran kuat. Spora berwarna merah sedangkan bentuk
vegetative berwarna biru
II. Metode Klein II
1. Buat apusan dari suspensi bakteri
2. Tambahkan carbol fuchsin, panaskan sampai keluar uap (80oC selama 10 menit)

3. Langkah-langkah selanjutanya sama dengan metode Klein I dari langkah 3-6

4. Amati dengan perbesaran kuat, spora merah, vegetative biru
III. Metode Wirtz
1. Buat apusan dengan cara difiksasi dahulu
2. Tambahkan malachite hijau, panaskan sampai menguap 2 menit
3. Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 45 detik
4. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring dan
5. Amati dengan perbesaran kuat. Spora berwarna hijau dan badan bakteri
berwarna merah muda

E. Hasil Pengamatan

Bakteri Perbesaran Gambar dan Warna

Bacillus subtilis

Bacillus spp

21
 Daftar Pustaka
1. Lay. W. B., 1990. Analisis Mikroba di Laboratorium.
2. Madigan, Martinko, Stahl dan Clark. 2012. Biology of Microorganisms. Pearson
Inc.Publishing
3. Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. Dasar-dasar Mikrobiologi. 2006. UI Press
4. Willey, J.M., Sherwood L.M., Woolverton, C.J., 2008. Microbiology. Prescott, Harley & Klein
5. Cappucino, J.G. dan Sherman N., 2005. Microbiology, A Laboratory Manual. Pearson Inc.
Publishing

22