Praktikum 4

Analisis Vitamin C
Metode Spektrofotometri
Sampel: Minuman

Prinsip Analisis
Vitamin C (L-ascorbic acid dan L-dehydroascorbic acid) merupakan salah satu zat gizi mikro yang esensial
untuk menopang metabolisme tubuh. Pada umumnya peraturan pangan menetapkan agar kandungan
vitamin C dicantumkan dalam label pangan (nutrition fact) suatu produk. Vitamin ini memiliki karakteristik
sangat mudah teroksidasi akibat oksigen atau suhu tinggi. Karakteristik ini mengakibatkan vitamin ini
sangat mudah rusak akibat kondisi sekitar yang kurang terkontrol dengan baik, misalnya kerusakan akibat
terpapar panas dan oksigen selama pengolahan, pengemasan dan penyimpanan. Kecepatan kerusakan
vitamin C dapat meningkat akibat pH yang tinggi dan adanya ion Fe dan Cu. Dengan landasan karakteristik
vitamin C ini maka analisis vitamin C perlu dilakukan pada kondisi yang terkontrol, misalnya kontak
minimum dengan udara dan cahaya, kontrol pH pada level rendah, bahkan bila perlu ditambahkan
komponen pengkelat (chelating agent) agar dapat mencegah kerusakan vitamin C pada tahap persiapan
sampel. Vitamin C mudah larut dalam air, sedikit larut dalam alcohol dan gliserol, tetapi tidak dapat larut
dalam pelarut non polar seperti eter, benzene, kloroform. Vitamin ini merupakan reduktor kuat yang
mudah teroksidasi.

Tabel 1. Karakteristik vitamin secara umum

Penuntun Praktikum AEMGP-2

1
Terdapat dua metode utama analisis vitamin C tradisional yang terstandarisasi secara International, yaitu:
(1) Metode titrasi 2,6-Dichloroindophenol (AOAC method 967.21); dan (2) Metode spektrofotometri
(AOAC method 967.22).

Metode yang pertama, 2,6-Dichloroindophenol (AOAC method 967.21) merupakan metode resmi untuk
sampel sejenis jus. Untuk keperluan uji QC (Quality Control), terkadang metode indophenol ini juga sering
menjadi pilihan untuk analisis cepat untuk jenis sampel yang lain.

Prinsip dari analisis vitamin C metode 2,6-Dichloroindophenol (AOAC method 967.21) adalah sebagai
berikut:

Ascorbic acid memiliki kemampuan mereduksi indikator warna 2,6-Dichloroindophenol yang semula
berwarna merah hingga menjadi pudar warnanya (colorless). Oksidasi ringan ini dapat merubah vitamin
C dari bentuk L-ascorbic acid menjadi bentuk L-dehydroascorbic acid (lihat Gambar 1). Pada titik akhir
reaksi ini akan menyisakan indikator 2,6-Dichloroindophenol yang tidak tereduksi dalam sampel yang
ditandai dengan munculnya warna merah jambu (rose-pink). Volume titrasi dapat digunakan untuk
menghitung kadar vitamin C dengan membandingkan dengan larutan vitamin C standar.

Gambar 1. Reaksi kimia antara L-ascorbic acid dengan indikator warna 2,6-dichloroindophenol

Metode yang kedua dengan teknik spektrofotometri dilakukan berdasarkan kemampuan larutan dalam
Penuntun Praktikum AEMGP-2

menyerap/meneruskan cahaya. Diawali dengan reaksi sampel dengan pereaksi. Pereaksi berupa
ammonium molibdat 5% apabila bereaksi dengan vitamin C terbentuk warna biru molibden. Senyawa
berwarna ini dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-VIS. Konsentrasi vitamin C
dilakukan berdasarkan perbandingan antara absorbansi sampel dengan absorbansi larutan standar
dengan terlebih dahulu membuat kurva larutan standar.

2
Setiap praktikan harus selalu memakai sarung tangan dan menerapkan standar GLP dengan baik. Penting
diketahui bahwa bahan-bahan berikut (yang digunakan dalam praktikum kali ini) mengandung potensi
bahaya:

Tabel 2. Bahan pereaksi analisis vitamin C yang memiliki potensi bahaya

Bahan pereaksi CAS No. Potensi bahaya
Acetic acid (CH3COOH) 64-19-7 Korosif
Metaphosphoric acid (HPO3) 37267-86-0 Korosif

Bahan dan Alat

Sampel
Minuman (Uc 1000, oranomicin, buavita apel)
Bahan
1. Acetic acid (CH3COOH)
2. Ascorbic acid standar
3. Akuades
4. Ammonium molibdat 5%
5. Asam sulfat 5%
6. Asam oksalat 0.4%.

Alat
1. Pipet mohr
2. Gelas ukur
3. Labu ukur (10 mL, 25 mL, 100 mL, dan 500 mL)
4. Timbangan analitik
5. Kuvet
6. Spektrofotometer UV-VIS

Prosedur Percobaan
a. Pembuatan Pereaksi

1. Ammonium molibdat 5%

Ammonium molibdat ditimbang sebanyak 5 g

Penuntun Praktikum AEMGP-2

Dimasukan ke dalam labu ukur 100 mL

Ditambahkan akuades hingga tanda tera

Dihomogenkan

3
 2. Asam sulfat 5%

Asam sulfat pekat dipipet sebanyak 5,26 mL

Dimasukan ke dalam labu ukur 100 mL

Ditambahkan akuades hingga tanda tera

Dihomogenkan

3. Asam oksalat 0.4%

Disiapkan asam oksalat dan ditimbang sebanyak 2 g

Dimasukan ke dalam labu ukur 500 mL

Dilarutkan dalam 50 mL akuades

Dikocok hingga larut

Volume ditepatkan hingga 500 mL dengan akuades

b. Pembuatan Larutan Baku Vitamin C 1000 ppm

Asam askorbat baku ditimbang sebanyak 25 mg

Dimasukan ke dalam labu ukur 25 mL

Dilarutkan dengan asam oksalat 0.4% hingga 25 mL

c. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Larutan baku vitamin C 1000 ppm dipipet 0.8 mL

Dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL (konsentrasi 80 ppm)

Penuntun Praktikum AEMGP-2

Ditambahkan H2SO4 5% sebanyak 4 mL

Ditambahkan ammonium molibdat hingga tanda tera

Dihomogenkan

4
 Diinkubasi selama 30 menit

Diukur serapan dengan spektrofotometer UV-VIS pada rentang panjang gelombang 530 – 590 nm

d. Pembuatan Kurva Standar

Larutan baku vitamin C 1000 ppm dipipet sebanyak 7 kali, yaitu 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, dan 0.8 mL

Masing-masing dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL

Ditambahkan H2SO4 5% sebanyak 4 mL

Ditambahkan ammonium molibdat 5% sampai tanda tera

Dihomogenkan

Diinkubasi selama 30 menit

Diukur serapannya pada panjang gelombang 570 nm

e. Pengukuran Kadar Vitamin C

1 mL larutan sampel dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL

Ditambahkan H2SO4 5% sebanyak 4 mL

Ditambahkan ammonium molibdat 5% sampai tanda tera

Dihomogenkan

Diinkubasi selama 30 menit

Diukur serapannya pada panjang gelombang 570 nm

Dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali

Penuntun Praktikum AEMGP-2

Sumber:
Sudjarwo. 2017. Optimization and validation of visible-spechtrophotometry method for determination ascorbic acid in Jeruk
Bali (Citrus maxima) fruit from Indonesia. International Journal of Pharmaceutical Quality Assurance. 8 (2): 44 – 48.

5
Hasil dan Cara Perhitungan
Tentukan kadar vitamin C pada minuman yang diclaim mengandung 1000 IU vitamin C

Tabel 3. Hasil pembacaan absorbansi larutan standar metode spektrofotometri (percobaan 1)

Konsentrasi asam askorbat (ppm) Absorbansi
Blanko 0
20 ppm 0.005
30 ppm 0.007
40 ppm 0.009
50 ppm 0.014
60 ppm 0.032
70 ppm 0.028
80 ppm 0.024

Tabel 3. Hasil pembacaan absorbansi larutan standar spektrofotometri (percobaan 2)

Konsentrasi asam askorbat (ppm) Absorbansi
0 0
0.1 0.008
0.5 0.041
1 0.052
2 0.145
3 0.213
4 0.262
5 0.292
6 0.289
7 0.389
8 0.400
9 0.444
10 0.534
20 0.912
30 1.260
50 ppm 1.950
70 ppm 2.913
80 ppm 2.945
100 ppm 3.057

Tabel 4. Hasil pembacaan absorbansi sampel metode spektrofotometri

Ulangan Absorbansi
Penuntun Praktikum AEMGP-2

Minuman segar
1 0.123
2 0.96
3 0.81
Minuman + pemanasan
1 0.542

6
 Ulangan Absorbansi
2 0.561
3 1.210
Minuman + soda
1 0.242
2 0.311
3 0.250

Langkah perhitungan:
 Menentukan persamaan kurva standar
 Dari dua data kurva standar tersebut pilih salah satu dan jelaskan alasan pemilihan ini
 Cek data hasil: nilai z-score di atas +2 atau di bawah -2  outlier
Nilai z-score dihitung dengan menggunakan rumus:
𝑥1 − 𝑥̅
𝑧 − 𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒 = | |
SD
 Hitung absorbansi rata-rata
 Hitung kadar vitamin C berdasarkan persamaan kurva standar

Simulasi Analisis
Simulasi analisis vitamin C metode spektrofotometri dapat diakses melalui tautan berikut:
http://ipb.link/analisis-vitamin-c-indophenol

Analisis Data
1. Apakah kadar vitamin C berdasarkan analisis yang dilakukan sesuai dengan kandungan yang
tertera dalam label minuman?
2. Ulas apakah kandungan vitamin C dalam label sesuai dengan konsep kecukupan gizi?
3. Berdasarkan hasil analisis yang dilakukan, apa yang dapat disimpulkan?
Penuntun Praktikum AEMGP-2