ISOLASI DNA

Oleh : Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Rita Puspita Dewi : B1J010001 :V :2 : Kiki Ayuningrum.

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTRIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2012

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3 suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya. Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida. Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3 suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida. Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan

isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.

B. Tujuan Tujuan praktikum ini adalah untuk mengisolasi DNA buah dan bakteri E.coli, mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah kantung plastik, gelas beaker 200 ml, corong plastik, kain kasa (perban), tabung plastik bertutup, pipet plastik, sarung tangan, tabung mikrosentifuga 1,5 ml, saringan (kain), botol, sendok plastik, Bahan yang digunakan adalah buah mangga, buah strawberry, buah naga, bawang bombay, buah alpukat, deterjen cair, Nacl (garam dapur), alkohol 96%, tenderizer dan akuades. B. Metode
A. Isolasi DNA buah

1. Buah dimasukkan kedalam kantung plastik 2. Ditambahkan 1 sendok Nacl dan akuades kedalam plastik, kemudian buah dihancurkan dengan cara diremas-remas 3. Ditambahkan deterjen secukupnya dan buah diremas-remas kembali 4. Setelah halus, kemudian buah disaring dan diberi tenderizer 5. Diambil 2 ml sampel dan ditambahkan 2 ml alkohol 96% 6. Diamati DNA kromosom yang berbentuk kabut putih
B. Isolasi DNA bakteri

1. Diambil 1,5 ml sampel E.coli dan diletakkan pada eppendorf 2. Disentrifuge pada 5000 rpm selama 10 menit 3. Supernatan dibuang 4. Ditambahkan 10 l deterjen dan 90 l akuades 5. Dipanaskan pada suhu 100 C selama 10 menit 6. Disentrifuge lagi pada 12000 rpm selama 10 menit 7. Disimpan pada suhu -20 C 8. Uji elektroforesis

III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil

B. Pembahasan Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan

campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Bull, 2001). DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Doyle, 1978). Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA (deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiap organisme (Brolle, 1997). Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011). Lodish (2001) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapantahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini

dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Pengisolasian DNA kromosom diperlukan E.Coli dalam jumlah yang besar karena apabila E.Coli yang tersedia jumlahnya sedikit maka pengisolasian DNA kromosom akan sulit dilakukan oleh karena itu sel E.Coli harus dibiakkan terlebih dahulu. Medium untuk menumbuhkan bakteri dalam percobaan ini digunakan ekstrak Yeast dan Bacto pepton. Medium dan alat-alat yang digunakan harus steril, agar biakan E.Coli tidak terkontaminasi dengan bakteri lain. Sterilisasi merupakan suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan dari segala bentuk mikroorganisme. Seperti diketahui penyelidikan terhadap suatu spesies atau galur mikroba selalu berdasarkan atas pengamatan terhadap sifat biakan murni, dalam arti biakan yang hanya berisi satu jenis spesies atau galur saja. Oleh karena itu, untuk menghindari terjadinya kontaminasi (tumbuhnya mikroorganisme lain selain mikroba yang akan diamati) dalam melaksanakan penelitian perlu digunakan peralatan yang steril (Sambrook, 1989). E. coli sering ditemukan disaluran usus pada hewan dan manusia. Strain E.coli ini banyak terdapat pada tanah, air dan makanan. Isolat E.coli adalah kontaminan makanan yang sering berasal dari hewan (Momtaz, 2012). Tahap-tahap isolasi DNA buah yaitu buah dimasukkan ke dalam plastik dengan menambahkan 1 sendok Nacl dan akuades, kemudian dihancurkan dengan cara diremasremas, untuk isolasi DNA bawang Bombay, bawang tersebut harus di hancurkan menggunakan blender dengan ditambahkan akuades dan Nacl secara langsung. Setelah itu ditambahkan deterjen cair dan diremas-remas kembali, kemudian disaring dan ditambahkan tenderizer, setelah itu diambil sampel sebanyak 2 ml dan ditambahkan 2 ml alkohol 96%, kemudian diamati kabut putihnya. Sedangkan tahap isolasi untuk DNA bakteri adalah dengan cara mengambil 1,5 ml E.coli dan ditempatkan pada eppendorf, kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm, setelah itu supernatan dibuang dan ditambahkan 10 l deterjen dan 90 l akuades. Kemudian

dipanaskan pada suhu 100 C selama 10 menit, dan disentrifuge lagi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit, setelah itu disimpan pada suhu -20 C dan dilakukan elektroforesis. Fungsi perlakuan: Deterjen cair : untuk menghancurkan lemak pada membran sel Nacl Akuades Tenderizer : sebagai buffer (menjaga pH agar tetap) : sebagai pelarut : memecah ikatan protein histon dari DNA kromosom

Alkohol 96% : untuk mempresipitasi protein agar menggumpal Sentrifuge Dipanaskan Didinginkan : memisahkan antara supernatan dan natan : presipitasi : pemurnian dan presipitasi

Berdasarkan hasil praktikum tiap-tiap isolasi buah yang menggunakan buah alpukat, buah naga, buah mangga, buah strawberry dan bawang Bombay menunjukan hasil yang berbeda-beda, pada saat pemberian aquades setiap buah tidak sama pemberiannya karena kandungan air pada setiap buah tersebut berbeda-beda. Hal tersebut sesuai dengan pustaka yang menyatakan bahwa isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Achmmad, 2010). Hasil praktikum pada rombongan I adalah secara keseluruhan untuk isolasi DNA buah dapat menghasilkan kabut putih yang terlihat jelas, yaitu pada DNA buah naga, strawberry, dan mangga, sedangkan pada DNA bawang bombay terdapat kabut putih namun tampak kecil-kecil (tidak terlihat jelas). Hal ini dikarenakan tekstur bawang bombay yang keras, sehingga kabut putih tidak terlihat jelas.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan praktikum Osmoregulasi, maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Isolasi DNA adalah suatu proses untuk memisahkan DNA dari komponenkomponen sel lainya. 2. Tahapan isolasi DNA adalah perusakan dan pembuangan dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein dan RNA

B. Saran Saran untuk praktikum selanjutnya adalah agar semua praktikan tahu mengenai isolasi DNA bakteri E.coli hendaknya semua praktikan mengikuti untuk melalukan isolasi DNA tersebut.

DAFTAR REFERENSI Brolle et al. 1997. Microbiology Biotechnology. Germany : University of Tubingen.

Bull. Jusuf M. 2001.Genetika 1 Struktur dan ekspresi Gen. Bogor : Sagung Seto. Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of freshleaf tissue. Phytochem. Lodish, Harvey, et al. 2001. Molecular Cell Biology, Fourth Edition. W.H. Freeman and Company. New York.

Momtaz, H.,E. Rahimi, S. Moshkelani. 2012. Molecular detection of antimicrobial resistance genes in E. coli isolated from slaughtered commercial chickens in Iran.
Veterinarni Medicina, 57 (4): 193197.

Sambrook J, Frisch EF & Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory.