PENGEMBANGAN METODE ANALISIS

Pengembangan metode
merupakan suatu proses
merancang, mencoba, dan
menemukan metode analisis yang
baru atau memperbaiki,
meningkatkan kinerja, dan
memodifikasi metode analisis
yang telah ada.

Perkembangan IPTEK

Teknik/Instrumen Baru

Bentuk Sediaan
Farmasi Baru

Senyawa/Obat Baru

Pengembangan Metode
Analisis

Metode Analisis
Baru
Adopsi
Revisi

Metode Analisis
Ubah-suai/Kinerja Baru

METODE BAKU

Adopsi
Revisi

Tujuan pengembangan metode

analisis
Memperoleh metode analisis yang :
Bebas galat atau sumber galatnya dapat
dikenali sehingga dapat dikoreksi,
dikurangi, atau dihilangkan.
Memberikan informasi analitik yang baik
(selektivitas, kecermatan, dan
keseksamaan).
Mudah dilakukan, dapat diotomasikan atau
dapat dilakukan dalam waktu yang singkat.
Murah dan cepat.

1
Masalah Analisis
2
Pustaka

3
Teori dan Hasil
Penelitian

4
Pemilihan
Metode dan
Optimasi
Tidak

5
Penentuan
Parameter dan
Kriteria Disain
Metode Analisis
8
Pembandingan
dengan Kriteria
(Metode Analisis
Baku)
Ya
9
Metode Analisis
Telah Selesai
Dioptimasi
10
Validasi dan
Studi Kolaborasi

Metode Analisis
Selesai Divalidasi
(Metode Valid/Absah)

6
Uji Coba di
Laboratorium

7
Perhitungan dan
Uji Statistika

Klasifikasi Metode Analisis

Metode yang digunakan untuk pemeriksaan produk farmasi menurut
USP 28 tahun 2005 dapat diklasifikasikan menjadi empat katagori,
yaitu :
Katagori I : Metode analitik untuk penentuan kadar
komponen utama dalam obat ruahan atau komponen
aktif termasuk pengawet dalam sediaan farmasi.
Katagori II : Metode analisis untuk penentuan kemurnian
(cemaran) dalam obat ruahan atau hasil urai dalam
sediaan farmasi. Metode ini mencakup penentuan
kadar
dan uji batas.
Katagori III: Metode analisis untuk penentuan karakteristik
penampilan sediaan jadi farmasi seperti disolusi,
pelepasan obat.
Katagori IV :
Uji identifikasi

Metode analisis yang memerlukan

validasi

Metode analisis yang baru dikembangkan :

karakteristik untuk kerja metodenya belum
diketahui (terkait dengan persyaratan dan
penggunaannya).
Metode analisis yang dimodifikasi dan atau
diterap kan pada matriks / bentuk sediaan
yang berbeda.
Metode baku dan metode resmi yang akan
diadopsi, tidak perlu divalidasi tetapi cukup
diverifikasi.

Parameter Analisis yang

Dipertimbangkan untuk Validasi
Katagori II

Parameter
Analitik

Katagori I

Uji
Kuantitatif

Uji
Batas

Kecermatan
Keseksamaan
Spesifisitas
Batas Deteksi
Batas Kuantisasi
Linieritas
Rentang

Ya
Ya
Ya
Tidak
Tidak
Ya
Ya

Ya
Ya
Ya
Tidak
Ya
Ya
Ya

*
Tidak
Ya
Ya
Tidak
Tidak
*

Katagori
III

Katagori
IV

*
Ya
*
*
*
*
*

Tidak
Tidak
Ya
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak

* mungkin diperlukan tergantung sifat dan kebutuhan uji.

Pustaka : USP 28, 2005

Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan

penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya.

Tujuan validasi :
Untuk menjamin bahwa metode analisis yang
digunakan mampu memberikan hasil yang
cermat dan handal sehingga dapat dipercaya,
dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah,
dan kesesuaian dengan tujuan.

PRESISI / KETELITIAN

Kedekatan hasil uji yang diperoleh dari beberapa

pengulangan (replikasi) pada penetapan contoh yang
sama (homogen).

Cara penetapan:
Dilakukan pengujian berulang kali (mulai dari
penyiapan sampel sampai perhitungan akhir)
sebanyak 6 x atau lebih terhadap contoh yang sama.
Presisi dinyatakan sebagai RSD atau SBR (koefisien
variasi) serangkaian pengukuran
Nilai RSD yang dapat diterima tergantung dari
konsentrasi analit dalam matriks contoh.

PARAMETER VALIDASI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Presisi (Ketelitian / Keseksamaan)

Akurasi (Ketepatan / kecermatan)
Sensitifitas (LOD dan LOQ)
Spesifisitas / Selektifitas
Linieritas
Range (Rentang)
Ruggednes (Kekasaran)
Robustness (Ketahanan)

TINGKATAN PRESISI

Presisi metode (Repeatability =keterulangan ) :

pengujian ulang dengan kondisi contoh, metode,
laboratorium, analis, alat dan waktu yang sama.
Presisi antara (Internal Reproducibility=ketertiruan
internal) : pengujian ulang terhadap contoh,
metode, laboratorium dan alat yang sama, tetapi
analis dan waktu pengujiannya berbeda.
Presisi antar laboratorium (External Reprodusibility
= Ruggedness) : pengujian ulang dengan
menggunakan contoh dan metode yang sama,
tetapi laboratorium, alat, analis dan waktu
pengujiannya berbeda.

UKURAN PRESISI DAN

PENETAPANNYA

Presisi Sistem (Replikabilitas) :

Penyuntikan berulang minimum 6 kali dari
contoh homogen untuk menunjukkan
kinerja alat pada kondisi dan hari
pengujian.
Presisi Metode (Repeatabilitas) :
Minimum 3 konsentrasi analit dalam
rentang tertentu, masing-masing 3
replikasi atau minimum 6 penetapan pada
konsentrasi pengujian 100 %

HASIL PRESISI YANG MASIH DAPAT DITERIMA

No.

Konsentrasi Analit
Dalam Matriks Contoh

% RSD

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

100 g / kg
10 g / kg
1 g / kg
100 mg / kg
10 mg / kg
1 mg / kg
100 g / kg
10 ug / kg
1 ug / kg
0,1 ug / kg

2
3
4
5
7
11
15
21
30
43

Presisi dapat dhitung dengan cara

sebagai berikut :
1. Hasil analisis adalah : X1, X2, X3, X4,
.Xn
maka simpangan baku nya adalah:
SD =

{ ( x x )2}
n-1

Xi
i n

X=

2. simpanganSDbaku relatif (KV) :

KV = x x 100%

Sebaiknya ketelitian ditentukan terhadap Sampel

sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan
pembawa sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat
pengaruh matriks pembawa terhadap ketelitian.

Contoh :
Suatu bets tablet parasetamol dengan kandunga 500mg
parasetamol per tablet (100%). tiga orang siswa melakukan
analisis secara spektrofotometri terhadap tablet tersebut dan
memperoleh hasil (%) untuk analisis berulang parasetamol di
dalam tablet sebagai berikut :
-siswa 1 : 99,5 ; 99,9 ; 100,2 ; 99,4 ; 100,5 ; 100,3
-siswa 2 : 95,6 ; 96,1 ; 95,2 ; 95,1 ; 96,1 ; 95,3
-siswa 3 : 94,4 ; 100,2 ; 104,5 ; 97,4 ; 102,1 ; 94,6
Hitung presisi (KV) tiap penetapan kadar yang dilakukan oleh 3
siswa tersebut.

AKURASI / KETEPATAN

Kedekatan hasil uji yang diperoleh (menggunakan

metode yang sedang divalidasi) dengan nilai
sebenarnya yang ter dapat dalam contoh uji.
Akurasi biasanya dinyatakan sebagai prosen recovery.
Metode penetapan Akurasi :
Recovery analit: untuk contoh yang komposisinya
diketahui.
Standar adisi : untuk contoh yang komposisinya
tidak diketahui.
Membandingkan hasil yang diperoleh dengan
menggunakan metode yang telah valid

CARA PENETAPAN AKURASI

Recovery Analit (metode simulasi = spiked-placebo recovery)

dan Metode Standard Adisi (standart addition method):
Minimum 3 konsentrasi analit / baku pembanding
yang ditambahkan dalam rentang 80 % 120 % ,
masing-masing 3 replikasi.

Pembandingan Metode :
Minimum 6 kali pengujian menggunakan metode analisis
yang sedang divalidasi dan 6 kali pengujian menggunakan
metode standard atau metode resmi

Metode simulasi :
Sejumlah analit bahan murni (BP) ditambahkan kedalam
campuran bahan pembawa sediaan farmasi (plsebo)
lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibanding
kan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar sebenarnya).

Metode penambahan baku :

- Sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang
diperiksa ditambahkan kedalam sampel dicampur dan
dianaisis lagi. Sellisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar
yang sebenarnya ( hasil yang diharapkan)
-

Metode addisi :
Sejumlah analit dengan konsentrasi tertentu
ditambahkan pada sampel yang diperiksa, lalu di analisis
dengan
metode tersebut.

Persen perolehan kembali ditentukan dengan

menentukan
berapa persen analit yang ditambahkan tadi dapat
ditentukan.

HASIL AKURASI YANG MASIH DAPAT

DITERIMA
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Konsentrasi Analit
Dalam Matriks Contoh
>
>
>
>
>
>
>
>
>

100
%
10
%
1
%
1000 ppm
100 ppm
10 ppm
1 ppm
100 ppb
10 ppb
1 ppb

Rentang % Recavery
98 - 102
98 - 102
97 - 103
95 - 105
90 - 107
80 - 110
80 - 110
80 - 110
60 - 115
40 - 120

SENSITIFITAS

Batas deteksi (LOD)

Kadar terendah analit dalam contoh yang
masih dapat dideteksi, namun tidak harus
kuantitatif.
Batas kuantitasi (LOQ)
Kadar terendah analit dalam contoh yang
masih dapat ditetapkan kadarnya dengan
presisi dan akurasi yang masih dapat
diterima.

CARA PENETAPAN
SENSITIFITAS

Prosedur non instrumen

Contoh dengan konsentrasi yang diketahui
dilakukan analisa melalui evaluasi visual.
Prosedur instrumen
Rasio signal to noise: membandingkan hasil
uji contoh yang mengandung analit dengan
kadar rendah terhadap hasil uji blanko
LOD = 3x noise
LOQ = 10 x noise
Berdasarkan simpangan baku respon analit
dengan slope kurva kalibrasi

Menurut Miller :
LOD = 3 . Sy/x / b
LOQ = 10 . Sy/x / b

Menurut IUPAC :
LOD = 3 . Sa / b
LOQ = 10 . Sa / b

Sy/x = SD yang didapat dari nilai y disekitar garis regresi

SPESIFISITAS / SELEKTIFITAS

Spesifisitas : Kemampuan metode analisis

membe dakan suatu analit yang ditetapkan dari
komponen lain yang berada dalam matriks
contoh.

Selektifitas : Kemampuan metode analisis

memberi kan signal analit pada campuran
analit dalam contoh tanpa adanya interaksi
antar analit.

Metode selektif merupakan seri metode

spesifik.
Prosedur spesifisitas tergantung pada tujuan
penggunaan prosedur analisis.

Spesifisitas / Selektifitas
(Lanjutan)

Metode yang memiliki kespesifikan rendah,

dapat berakibat pada analisis kualitatif akan
terjadi kekeliruan positif (positive false) dan
pada analisis kuantitatif akan terjadi hasil
pengujian lebih besar dari sebenarnya.

Contoh metode yang memiliki kespesifikan

tinggi adalah penetapan logam dalam berbagai
matriks sampel secara Spektrofotometri
Serapan Atom (AAS).

CARA PENETAPAN
SPESIFISITAS

Untuk uji identifikasi dan penetapan kadar

:
Contoh blangko dan contoh yang
ditambah sejumlah analit untuk
mengetahui tidak adanya gangguan dari
komponen lain (produk hasil urai,
metabolit, senyawa aditif dll) dalam
contoh terhadap analit.
Untuk uji kemurnian :
- Cemaran/impurity tersedia
- Cemaran/impurity tidak tersedia

Cara penetapan Spesifitas

( Lanjutan )

Cemaran / impurity tersedia : dibandingkan hasil

uji contoh yang mengandung cemaran dengan
contoh tanpa cemaran. Spesifisitas merupakan
derajat bias / penyimpangan perbedaan hasil uji
tersebut.

Cemaran/impurity tidak tersedia : diuji kemurnian

contoh misalnya secara kemurnian kromatografi.
Uji kemurnian puncak menunjukkan puncak analit
yang tidak diakibatkan oleh lebih dari satu
komponen / komponen lain.

LINIERITAS

Definisi : kemampuan untuk menghasilkan hasil

uji yang sebanding / berbanding lurus terhadap
konsentrasi analit dalam contoh pada kisaran
konsentrasi tertentu.
Cara penetapan :
Ditetapkan terhadap min. 6 konsentrasi pada
rentang 50 150 % dari kadar analit.
Hitung regresi linier dan koefesien korelasi (R)
Harga R menunjukkan linieritas.
Kriteria : R > 0.997 (bahan aktif)
R > 0.98 (cemaran / impurity)

Data uji linearitas zat A dengan KLT-Densitometri

no.
1
2
3
4
5
6

Konsentrasi (bpj)
40
80
120
160
200
240

Luas bercak
2280
3470
4906
6723
7988
9190

Hitung : - regresi linear ( y=a + bX )

- koefisien korelasi (r atauR)

RANGE / RENTANG

Kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang

kadar analitnya masih linier dengan presisi
dan akurasi yang masih dapat diterima.
Ditetapkan bersamaan dengan penetapan
linieritas dengan melakukan pengujian
terhadap contoh yang kadarnya dibawah dan
diatas normal.
Buat kurva regresinya dan tentukan batas
bawah dan batas atas dari kadar analit yang
masih memberikan garis linier.

RUGGEDNESS /
KEKASARAN

Definisi : kemampuan untuk memberikan

hasil uji yang sama pada contoh yang
sama, tetapi keragaman kondisi
pengujian berbeda.
Tujuan: untuk mengetahui pengaruh
faktor eksternal terhadap metode (contoh
dan metode sama, tetapi laboratorium,
alat, analis dan waktu pengujian
berbeda).
Cara penetapan : melakukan uji
kolaborasi antar labotorium, lalu
membandingkan presisi dan akurasi dari
hasil uji antar laboratorium tersebut.

ROBUSTNESS /
KETAHANAN

Definisi : ukuran kemampuan metode untuk

tidak terpengaruh oleh perubahan kecil dari
parameter metode yang sengaja dibuat.
Tujuan : untuk mengetahui pengaruh faktor
internal terhadap metode (dilakukan sedikit
pengubahan pada metode seperti: kecepatan
laju alir pada kolom, komposisi fase gerak,
suhu kolom, lama penguapan).
Cara penetapan : membandingkan presisi dan
akurasi hasil yang diperoleh dengan hasil yang
dilakukan pada kondisi normal.

Verifikasi Metode

Verifikasi metode analisis :

Proses konfirmasi kembali untuk menunjukkan metode
telah sesuai dan memenuhi kebutuhan laboratorium.

Verifikasi diperlukan karena :

- Data verifikasi sebagai bukti metode tersebut telah sesuai
dan memenuhi kebutuhan laboratorium.
- Adanya perbedaan dalam personel, instrumen, pereaksi
yang dipakai dalam metode baku dan metode resmi
dengan
laboratorium yang akan menggunakannya kecuali jika
terhadap metode tersebut dilakukan modifikasi dan atau
dilakukan dalam matriks yang berbeda.

Tugas :
Membuat tulisan perbandingan cara uji dan
persyaratan UJI pada Validasi Metode Analisis
berdasarkan Pustaka :
- FI IV (1995)
- ICH = International Conference On Harmonisation
(2005)
- USP 36 (2013)
Tugas dibuat dalam kelompok dengan pembagian sbb:
PARAMETER
KELOMPOK (NO: ABSEN)
1.Presisi
2.Akurasi
3.Linearitas

1- 5
6 - 10
11 - 15

PARAMETER
NO: ABSEN
1.Rentang
16 - 20
2.Batas Deteksi
21 - 25
3.Batas Kuantitasi
26 - 30
4.Spesifisitas
31 - 35
8. Selektivitas
36 - 40
9. Regudness
41 - 45
10. Robustness
46 - 51
11. Uji Kesesuaian Sistem
52 - 57

TERIMA KASIH