KROMATO GRAFI

Kelompok { 4 }
Aulia Rahmi
Firnanda Rizki Riasta
Klanita Sabira
Nurul Azizah

Prinsip Dasar

Cairan
yang
akan
dipisah
kan
merupa
kan
fase
cair
dan zat
padatn
ya
merupa
kan
fase
diam
(stasio

pemisa
han
molekul
berdas
arkan
perbed
aanaf
nitasny
aterha
dap
zatpad
at
tertent
u

Instrumentasi

(a) Solvent inlet flter, (b) pompa, (c) inline solvent flter, (d)
valve injeksi, (e) flter pre-kolom, (f) kolom, (g) detektor, (h)
rekorder, (i) regulator tekanan-balik, dan (j) penampung waste

Jenis - Jenis Liquid

Kromatografi
Berdasarkan
fasa
stationer

Berdasarkan
efsiensi
performance

Berdasarkan
alat

Berdasarkan
jenis

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Jenisnya

Liquid liquid chromatography

Liquid - Solid chromatography

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Jenisnya

Liquid Liquid Kromatograf
Fase gerak : liquid
Fase stasioner : liquid berupa solvent .
Contoh : air, asetonitril, metanol.

Liquid Solid Kromatograf

Fase gerak : liquid
Fase stasioner : solid.
Contoh : polimer, campuran silika atau alumina
yang diimobilisasi.

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Fasa

Stationer
Size Exclusion Chromatography
(SEC)
Ion Exchange Chromatography
(IEC)
Reverse-Phase Chromatography
Hydrophobic Interaction
Chromatography
Affinity Chromatography

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Fasa

Stationer
Size Exclusion Chromatography
Prinsip :
Komponen dari campuran dipisahkan menurut
ukuran molekul mereka, berdasarkan aliran
sampel melalui kemasan berpori.
Fungsi :
Analisis kompleks makromolekuler (protein dan
industri polimer)
Memisahkan molekul biologis
Mekanisme :
Molekul besar tidak bisa terpenetrasi ke dalam
packing material, sehingga terelusi. Molekul besar
ini terpisah dari itu, mengalir dengan fasa gerak
antarlingkup partikel dari kolom packed. Sebagian
atau seluruh molekul kecil, masuk ke dalam fase
diam. Karena molekul kecil harus melalui
antarlingkup partikel, molekul ini juga akan
terelusi dari kolom setelah terpisah dari

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Fasa

Stationer
Ion Exchange Chromatography
Prinsip :
Permukaan suatu molekul memiliki suatu gugus
muatan yang dapat berubah sesuai pH. Muatan
pada permukaan itulah saling berikatan dengan
muatan berlawanan yang ada pada kemasan
Fungsi :
Analisis, intermediate purifcation, polishing.
Diaplikasikan untuk memisahkan: protein
(terutama enzim), senyawa alkohol, alkaloid,
asam amino, dan nikotin.
Mekanisme :
Molekul yang kerapatan muatannya tinggi, akan
mengikat kuat dengan Packing. Ikatan sample
secara selektif terlepas dari fase diam dengan
perubahan pH/Konsentrasi garam dari fase gerak.
Semakin besar muatan suatu molekul dan ikatan
dengan fase diam yang kuat, semakin besar
perubahan konsentrasi garam yang ada.

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Fasa

Stationer
Reversed Phase
Chromatography

Prinsip :
Pemisahan dilakukan dengan menggunakan
interaksi hidrofobik antara sampel dan ligan pada
kromatograf.
Fungsi :
digunakan untuk memisahkan molekul kecil
dan peptida dan tidak umum digunakan untuk
protein.
Mekanisme :
Untuk fase gerak, penambahan sifat hidrofobik
dengan
membentuk
pasangan
ion
akan
mengadsorpsinya ke fase diam. Adsorpsi yang
sangat
kuat
,
terlihat
dai
penambahan
konsentrasi
pelarut.
Hal
inilah
yang
menyebabkan terjainya elusi.

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Fasa

Stationer
Hydrophobic Interaction
Chromatography

Prinsip :
Sampel berinteraksi pada konsentrasi garam
yang tinggi, sebagai fase gerak dan fase diam
yang hidrofobik. Selanjutnya, sampel dielusi dari
fase stasioner dengan pengurangan konsentrasi
garam.
Fungsi :
Pemisahan Protein
Mekanisme :
Hampir semua molekul memiliki sisi hidrofobik
pada strukturnya, yang terlindung oleh sisi
hidroflik/kumpulan ion. Dengan penambahan
konsentrasi garam, sisi hidrofobik akan lebih
terlihat dan berinteraksi dengan ligan hidrofobik
yang ada pada packing.

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan Fasa

Stationer
Affinity Chromatography
Prinsip:
Pemisahan yang terjadi akibat interaksi
spesifk antara struktur molekul kimia / biologis
dengan afnitas ligan / molekul yang sesuai.
Fungsi :
Analisis antibodi dan antigen
Analisis enzim inhibitor dan produk
Mekanisme :
Media kromatograf memiki ligan yang
berikatan melalui spacer arm dengan packing
material. Molekul spesifk biasanya saling
teradsorpsi dengan ligan. Molekul yang
teradsorpsi biasanya terelusi oleh pemindahan
kompetitif atau perubahan bentuk dari molekul
yang disebabkan oleh perubahan pH atau
kekuatan ion.

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Pemisahnya

Colomn chromatography

Thin layer chromatography

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Pemisahnya

Colomn
Chromatography

Prinsip Pemisahan:
Perbedaaan tingkat adsorpsi
komponen-komponen sampel pada
suatu adsorben (wujud padat)
Fase Stasioner:
Adsorben yang ada di dalam kolom
Fase gerak:
Solvents (eluents)

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Pemisahnya

Colomn
Chromatography

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Pemisahnya

Thin Layer
Chromatography

Prinsip Pemisahan:
Perbedaaan tingkat adsorpsi
komponen-komponen sampel pada
suatu permukaan adsorben
Fase Stasioner:
Adsorben (Silica, alimunium oksida, berbentuk
lapisan tipis (0,1-0,3 mm)
Fase gerak:
Berbagai jenis pelarut organik atau campuran
pelarut

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Pemisahnya

Thin Layer
Chromatography

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Efsiensinya

High-performance liquid
chromatography

Low-performance liquid
chromatography

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Efsiensinya
1. High-performance liquid
chromatography (HPLC)

Menggunakan material pendukung yang kecil, dan kaku

(diameter partikel < 40 mm)

Efisiensi tinggi, plate relatif rendah

Karakteristik sistem :
a) jarak antara peak lebih dekat
b) Presentasi kemurnian rendah
c) waktu pemisahan cepat
d) kolom dapat mentoleransi tekanan tinggi dan dengan
aliran yang rendah

Kelebihan sistem :
a) waktu analisis cenderung cepat
b) automasi mudah
c) presentasi kemurnian relatif tinggi
d) aplikasi analitis
e) purifikasi

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Efsiensinya

1. High-performance liquid
chromatography (HPLC)

Kelemahan sistem :
a) Kapasitas sampel rendah
b) Biaya lebih mahal

Gambar : Sistem High-performance liquid chromatography (HPLC)

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Efsiensinya

w - performance liquid chromatography

Menggunakan material pendukung yang

besar, dan tidak kaku (diameter partikel > 40
mm)

Efisiensi sistem yang kurang baik dan

membutuhkan plate yang tinggi.

karakteristik sistem :
a) jarak antara peak lebar
b) persentasi kemurnian rendah
c) waktu pemisahan yang lama
d) kolom hanya dapat dioperasikan pada
tekanan yang rendah

Kelebihan sistem:
a) sistem lebih sederhana
b) murah
c) purifikasi sampel
d) menghilangkan gangguan pada sampel

Jenis Jenis Liquid Kromatograf Berdasarkan

Efsiensinya

w - performance liquid chromatography

e) digunakan pada aplikasi analitis
f) tidak digunakan pada efisiensi yang
rendah, waktu analisis yang lama
Kekurangan sistem :
a) Sistem tidak umum karena efisiensi
rendah.
b) Waktu analitisnya lama
c) Kemampuan deteksi kurang baik

Operation Mode Liquid

Kromatograf

Adsorp
si

Elusi

Operation Mode
Dalam
kromatograf
(jenis
apapun) prinsip kerja yang terjadi
ada 2 yaitu adsorpsi dan elusi.
Operating mode bertujuan untuk
menganalisis proses pemisahan
yang
terjadi
di
dalam
kromatograf
Saat setimbang, yang diperlukan
oleh fase stasioner & fase
bergerak
untuk
berseparasi,
berbeda
untuk
setiap
jenis
solutnya.

Operation Mode
Adsorpsi adalah proses pemisahan bahan
dari
suatu
campuran
dengan
cara
pengikatan bahan tersebut pada seluruh
bagian adsorben cair yang diikuti dengan
pelarutan
Adsorpsi melibatkan fase stasioner yang
akan menarik liquid yang bergerak pada
permukaannya.
Pada adsorpsi sampel dimasukkan sedikit
demi sedikit secara kontinu sampai seluruh
kolom menjadi jenuh dengan molekul
target.
Adsorpsi peka terhadap bentuk stereometri
dari solut yang dipisahkan, sehingga cocok
untuk memisahkan campuran yang serupa
tetapi
memiliki
perbedaan
bentuk
sterometrik

Adsorpsi

Operation Mode
Elusi
merupakan
proses
pemisahan
campuran menjadi penyusun-penyusunnya,
hasil pemisahan disebut eluat, dan fase
gerak disebut eluen. Pemilihan fase diam
dan fase gerak berdasarkan distribusi
sampel kedalam dua fase tersebut.
Prinsip kerjanya adalah meluruhkan satu
jenis komponen dari campuran yang larut
pada eluen
Dalam elusi , kolom dialiri larutan bufer
kemudian sampel yang memiliki komponen
kompleks dimasukkan kedalam kolom untuk
dipisahkan. Buffer kemudian mengalir lagi
untuk mencuci komponen yang akan
dipisahkan
Komponen yang larut (komponen yang
akan dipisahkan) dalam buffer akan keluar
terakhir sehingga data yang muncul pada
monitor akan menunjukkan retention time

Elusi

Jenis Bed Kromatograf

Fixed
Bed

Expand
ed Bed

Simulat
ed Bed

Fixed bed
kromatograf
C
A
Fixed Bed memiliki zat komposit yang
ditargetkan dan teradsorbsi ke adsorben.
Proses kromatograf ini akan memisahkan
campuran ke bagian-bagian misalnya terdiri
dari senyawa A,C dimana A<C
Bed tidak bergerak namun komponen A dan C

Sebuah kolom dengan adsorben diisi dengan desorben cair

Pada kondisi ini, cairan sampel (campuran A dan C) dimasukkan pada salah
satu ujung kolom
Jika kita terus memasukkan cairan ke dalam desorben, setiap komponen dari
sampel (A dan C) akan bergerak di lapisan adsorben dengan laju
perpindahan Ua dan Uc (yang ditentukan dengan adsorpsi afnitas nya)
Dengan adanya perbedaan laju perpindahan antara Ua dan Uc yang
bergerak melalui adsorben, maka mereka akan terpisah satu sama lain
Cairan akan berturut turut menetes keluar dari kolom

Mekanis
me

Karena jenis dan densitas desorben mudah

diubah, fxed bed dapat diterapkan dalam
pemisahan untuk banyak jenis zat.
Walaupun sulit untuk menggunakan metode
ini, namun produk akhir tidak terlalu mahal
dalam prosesnya dan merupakan salah satu
bed yang masih mudah digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen.

Kekurangan fxed bed

dalam skala besar

Karena
kekurangankekurangan
ini, banyak
upaya inovatif
untuk
memperbaiki
fxed bed
sehingga
dapat
digunakan
sebagai
perangkat
industri.

Untuk mendapatkan pemisahan

yang sukses, dibutuhkan
perbedaan yang cukup besar
pada afnitas adsorpsi dari
adsorbat

Operasi yang tidak kontinyu

Expanded Bed Kromatograf

aliran
mengandung
senyawa sebagai
target kontaminan
yang dimasukkan
ke dalam sebuah
kolom yang diisi
dengan
matriks
padat fungsional
atau adsorben.

Padatan
harus
memiliki
ukuran
yang terdistribusi
merata
agar
fluidisasi stabil.

Mekanisme
Expanded beddapat berfluidisasi dengan mengenalkan aliran
dasar kolom dan memungkinkan perluasan area dalam bed.
Ekspansi ini dapat meningkatkan voidage/ kekosongan dalam bed.
Di bawah kondisi ini, bahan padat, koloid dan molekul yang sangat
besar yang terdapat dalam bahan baku baku dapat melewati
expanded bed. Jika produk telah terikat ke dalam matriks, maka
produk dapat terkonsentrasi dengan menggunakan expanded bed.

Feed
dimasukkan
dari bawah
kolom
kromatograf

Apabila feed
mengandung
padatan,
padatan akan
terfluidisasi

Cairan akan
mengalir ke
kolom

Mekanisme

http://pubs.acs.org/subscribe/
archive/tcaw/09/i11/html/11in
stru.html

Pada
mulanya, partikelpartikel saling berdekatan
Saat partikel terfluidisasi,
terbentuk
gradien
konsentrasi
Sampel dimasukkan dan
melewati
partikel-partikel
dan terjadi interaksi antara
sampel dan partikel
Kolom
dikemas
ulang,
senyawa
dielusi
dari
partikel-partikel

Simulated Moving Bed

Simulated Moving Bed : Teknik kromatograf yang
didasarkan pada aliran fluida pada fase gerak
yang bergerak berlawanan dengan fase diam.
Simulated Moving Bed: Teknik pemurnian
kontinyu yang membutuhkan lebih
sedikit
pelarut dibanding kromatograf batch biasa.
Digunakan untuk memisahkan partikel dan/atau
senyawa kimia yang sulit dipisahkan.

Kekurangan
Simulated Moving
Bed
Kelebihan
Dapat menghemat
pelarut
Mendapatkanrecovery
dan kemurnian yang
tinggi
Memiliki produktivitas
yang tinggi
Konsentrasi produk
yang tinggi
Konsumsi daya yang
rendah

Kekurangan

Proses lebih rumit

Hanya dapat
memisahkan menjadi
2 produk
Cost yang mahal
(skala lab)

Mekanisme

Mulutsetiapkolomterhubung
untuk membentuk sebuah
loop yang melingkar, dengan
empat
bukaan
untukmasukan
dan
gambaran fluida di setiap
kolom.

http://www.organo.co.jp/technology
/hisepa/en_hisepa/chromato/c5.htm
l

Ketika fluida berada di dalam

kolom, campuran feed
F,
desorben D, komponen A dan
komponen
C
terus
diperbolehkan
untuk
memasuki atau meninggalkan
kolom dari masing-masing
bukaan.

Kecepatan migrasi di setiap

pembukaan (Uv = panjang
kolong/peralihan waktu) diatur
sehingga akan lebih kecil
daripada
tingkat
migrasi
komponen A, Ua, dan lebih
besar dari tingkat migrasi
komponen C, Uc, yaitu (Ua >
Uv>Uc).
Di bawah kondisi ini, adsorben
pindah pada tingkat migrasi Us
(= -Uv) dalam arah yang
berlawanan untuk aliran fluida.
http://www.organo.co.jp/technol
ogy/hisepa/en_hisepa/chromato
/c5.html

Oleh karena itu,

komponen A dan
C bergerak dalam
arah
yang
berlawanan dari
feed (F).

http://www.organo.co.jp/technol
ogy/hisepa/en_hisepa/chromato
/c5.html

METODE
PERHITUNGAN HPLC

HPLC

Analisis Kualitataif

Dasarnya adalah
waktu retensi atau
volume retensi suatu
senyawa
Membandingkan
waktu retensi atau
volume suatu senyawa
dalam sampel yang
dianalisis dengan
waktu retensi atau
volume senyawa

Analisisis Kuantitatif

o Analyses Based on Peak

Height
o Analyses Based on Peak
Areas
o Calibration and
Standards
o The Internal Standard
Method
o The External Standard
Method
o The Area Normalization

ANALISIS KUANTITATIF
Metode pengukuran tinggi puncak
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan
kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Hasil
normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan
komposisi campuran dianalisis.
Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus pengukuran
tinggi suatu segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik
tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi
segitiga kromatogram tersebut.

ANALISIS KUANTITATIF

Metode pengukuran luas puncak

Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan
cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti
menghitung luas segitiga yaitu :
Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika kromatogramnya
berbentuk lancip. Cara lain menggunakan rumus :

BESARAN YANG
MERUPAKAN UKURAN
EFISIENSI KOLOM

Waktu Retensi
Waktu retensi adalah
waktu yang dibutuhkan
oleh senyawa untuk
bergerak melalui kolom
menuju detektor

Untuk beberapa
senyawa, waktu retensi
akan sangat bervariasi
dan bergantung pada:
a. panjang kolom (L)
b. Laju alir fase
gerak
c. koefsien distribusi
d. Volume fase diam
e. Vm

Teori Pelat
1941, Martin dan Synge
mengemukakan teori
pelat yang
membayangkan bahwa di
dalam kolom
kromatograf terdapat
bagian-bagian tipis. Teori
ini berawal dari teori
Di dalam tiap pelat
destilasi
terjadi kesetimbangan
distribusi komponen di
dalam fase gerak dan
fase diam.
Semakin banyak jumlah
pelat (N), semakin baik
kemampuan memisahkan
(semakin efsien)

Perhitungan Jumlah Pelat

Persamaan yang digunakan untuk menghitung jumlah pelat
pada kolom adalah:

Di mana:
tR = waktu
retensi
W = lebar peak

Di mana:
tR = waktu
retensi
W0,5
= lebar
peak pada tinggi
setengah

Height Equivalent of a Theoretical

Plate
HETP adalah tinggi dari
pelat bayangan yang ada
dalam kolom.
Semaki kecil harga HETP,
maka akan semakin
efsien kolom

Dimana:
H = panjang kolom (mm)
N = jumlah piringan
teoritis
Dimana:
UTE (%) = Utilization of
Theoritical Efficiency

Koefsien Partisi
Teori kromatografi didasarkan
pada kesetimbangn distribusi
sampel antara fasa yang
ditetapkan oleh konstanta
kesetimbangan K, disebut
dengan koefisien distribusi
(koefisien partisi) yang
dinyatakan sebagai berikut:

Di mana:
Cs = konsentrasi solut dalam
fase diam
CM = konsentrasi solut dalam
fase gerak

Pemisahan dapat terjadi

apabila
koefsien
distribusi
komponen
sampel berlainan .
Komponen dengan nilai K
lebih besar akan terpisah
lebih lambat daripada
komponen dengan nilai K
lebih kecil

Faktor Kapasitas dan Selektivitas

Kolom
Selektivitas kolom adalah
kemampuan kolom
kromatograf untuk
membedakan atara dua
atau lebih komponen
sampel. Erat kaitannya
dengan a (faktor pemisah)

k = faktor kapasitas
Faktor kapasitas adalah faktor yang
menyatakan perbandingan mol
komponen analit dalam fasa diam
terhadap mol komponen dalam fasa
gerak

RESOLUSI

Resolusi adalah tingkat

pemisahan atau derajat
pemisahan dua komponen
sampel pada kromatograf

Resolusi dua puncak

2 t R B t R A
2Z
RS

W A WB
W A WB
Nilai resolusi yang baik
adalah 1,5 yang disebut
resolusi garis dasar atau
Base Line Resolution

N
RS
4

k 'B

1 k 'B

Resolusi dipengaruhi oleh

3 faktor:
Efsiensi
Seletivitas
Faktor kapasitas

CONTOH SOAL

Mencari Resolusi
suatu minyak lemon, dianalisis secara kromatograf.
Mempunyai waktu retensi 8.36 min. dengan lebar garis
dasar 0.96 min. g-Terpinene yang dielusi pada 9.54 menit,
dan luas dasar 0,64 min. berapa besar resolusi antara dua
puncaknya?

Mencari Faktor Kapasitas dan Faktor

Pemisah
Dalam analisis kromatograf asam rendah, elusi asam
butirat dengan waktu retensi 7,63 menit. Dan waktu kolom
void adalah 0,31 menit. Hitung faktor kapasitas untuk asam
butirat

Dalam analisis kromatograf sama untuk asam butirat

(sama seperti contoh sebelumya), waktu retensi untuk asam
isobutyric adalah 5,98 menit. Berapa faktor selektivitas
asam isobutyric dan asam butirat?

Mencari Banyak Pelat dan Tinggi

Kolom
Analisis kromatograf untuk dieldrin pestisida klor
memberikan puncak dengan waktu retensi 8,68 menit dan
lebar dasar 0,29 menit. Berapa banyak pelat teoritis terlibat
dalam pemisahan ini? Mengingat bahwa kolom yang
digunakan dalam analisis ini adalah 2,0 meter panjang, apa
ketinggian pelat teoritis?

Mencari Panjang Kolom bila Rs = 1,5

Dari contoh soal sebelumnya, carilah panjang kolom yang
dibutuhkan bila resolusi awal 1.88 (Rs1) berubah menjadi
1.5 (Rs2)?

A dan kB konstan, sehingga

Mencari Koefsien Partisi

Dalam satu analisis dengan kromatograf, dengan packed
column sepanjang 40 cm, dengan konsentrasi solut fase
diam 5,6 mM dan konsentrasi solut fase gerak 12,8 mM.
Perkirakan koefsien partisinya

APLIKASI

Optimasi Ekstraksi Vitamin E dari

Minyak Kelapa Sawit
Saponifkasi

Ekstraksi dengn
metanol

Pemisahan
senyawa
(dengan
kromatograf
kolom)

Analisis
kualitatif
vitamin E (TLC)

Mikroenkapsula
si

Analisis aktiftas
antioksidan

Hasil TLC dengan eluen

petroleum eter : dietil
eter : asam asetat
(70:30:0,2, v/v/v)

Daftar Pustaka
Skoog, DA; Holler, FJ; Crouch, SR.Principles of Instrumental
Analysis, 6th ed.Belmont, CA. Thomson Higher Education.
2007.
Anonim. Formula for Calculating the Number of Theoretical
Plates. Diakses dari:
http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/34/34tec.h
tml
pada Tanggal 11 November 2013, pukul 22.30 WIB
Anonim. Number of Theoritical Plate. Diakses dari:
http://www.chem.agilent.com/Library/Support/Documents/f39
250232446.pdf
pada Tanggal 11 November 2013, pukul 22.37 WIB
Anonim. Theoretical Plates. Diakses dari:
http://toolboxes.flexiblelearning.net.au/demosites/series5/50
8/Laboratory/StudyNotes/snTheoreticalPlates.htm
pada Tanggal 11 November 2013, pukul 22.42 WIB
http://download.portalgaruda.org/article.php?

Pertanyaan
Etri: waktu retensi pada soal dan arti Tm
Dwini: bagaimana mencari konsentrasi
dan yang dimaksud dengan kolom void
Denia: Batas waktu resolusi
Retno: Perbandingan petroleum eter
kenapa ga 100:...
Lucia: Apakah seluruh perhitungan
kromatograf menggunakan rumus yang
sama, apa yang membedakan