Prinsip Kromatografi

Kromatografi = cara yang sangat berguna

untuk pemisahan dan pengukuran
komponen dalam campuran yang
kompleks.

Analisis kualitatif dan kuantitatif.

Apakah kromatografi itu?

1) Ekstraksi Pelarut:
Transfer solut dari fasa 1 fasa 2
S (dlm fasa 1) S (dalam fasa 2)

Koefisien partisi:

K
s2
s1
Apakah kromatografi itu?

2) kromatografi : sama dengan ekstraksi

a) A. Satu fasa: di tahan di tempatnya
fasa stasioner (fas tidak bergerak).
material padatan (material packing)

Fasa yang lain: fasa fluida

fasa bergerak (mobile phase).
sampel gas (GC)
cairan (LC)
 Apakah kromatografi itu?
B) Solut berkesetimbangan di antara fasa gerak
dan fasa tak bergerak.
Semakin kuat interaksinya dengan fasa tak bergerak,
semakin lambat pergerakannya di sepanjang kolom.
Xm Xs
Ks = [X]s / [X]m
Solut dengan nilai Ks besar akan ditahan lebih kuat oleh
fasa stasioner.
Kita dapat memisahkan sampel bila masing-
masing komponen ditahan di dalam kolom dalam
waktu yang berbeda
Apakah kromatografi itu?
Apakah kromatografi itu?

c) Sains dan seni pemisahan

d) Pelopor : Kromatografi
adsorpsi oleh by M.Tswett
pada tahun 1903
e) Eluen, eluat, elusi.
 Apakah kromatografi itu?
CaCO3
(adsorption) detector
sample eluent eluant
in in out
column chromatogram
(mass spect. IR
spect. etc)

elution : always (100%) dilution

Apakah kromatografi itu?

3) Jenis-jenis kromatografi

Di bagi ke dalam kategori berdasar

mekanisme interaksi solut dengan fasa
stasioner (fasa tak bergerak)..
 Apakah kromatografi itu?

polar s.p.

untuk GC & LC untuk GC

Apakah kromatografi itu?

resin-SO3- filtrasi gel berdasar

resin-N(CH3)3+ ukuran
Apakah kromatografi itu?
Kromatografi yang
paling selektif

pH, dan kekuatan ion

Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram
1) Kromatogram :
Grafik yang menunjukkan respon detektor
sebagai fungsi waktu elusi: bentuk pita,
posisi dan resolusi.
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
2) Untuk setiap puncak (pita):
a) Waktu Retensi (tr) :
waktu yang diperlukan dihitung dari
setelah injeksi, suatu solut untuk mencapai
detektor.
b) Puncak kromatografi yang ideal
Bentuk Gaussian.
w = 2.35, w = 4
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
3) Untuk sepasang puncak (pita)
a) Efisiensi : dua faktor menentukan seberapa
baiknya dua komponen terpisahkan:
lebar puncak :
semakin lebar puncak, semakin jelek
pemisahannya.
jarak waktu:
semakin terpisah jauh, semakin baik
pemisahannya.
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
b) Plat teoritis(N): (dari distillation)
Semakin banyak plat dalam satu kolom, semakin
banyak tahap penyetimbangannya, semakin
baik pemisahannya.
Banyaknya plat dalam kolom:
N = 5.55(tr/w)2
Tinggi plat: H = L/N
semakin pendek tinggi plat;
puncak semakin sempit pemisahan
semakin baik
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
c) Resolusi (Rs)
tr
t r2 t r1
Rs L
w av 1 2 w 1 w 2

For quantitati ve analysis, Rs 1.5

2 length of the s.p. 2Rs
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
d) Analisi Kualitatif & Kuantitatif
Kualitatif:
Ko-kromatografi
Mass spektrometer
IR spektrofotometer
Kuantitatif:
Luasan puncak
Standard Internal
Bagaimana kita menjelaskan
kromatogram?
e) Scaling up
1.Kromatografi Analitis: Kolom yang panjang
tetapi sempit (kecil). Untuk skala kecil:
pemisahan, identifikasi, atau pengukuran.
2. Kromatografi Preparatif : kolom yang pendek
dan besar. Untuk skala besar: pemurnian
2
mass 2 r2 Vflow 2
Scaling eqn :
mass 1 r1 Vflow 1
Mengapa pita melebar?
1) Mengapa terjadi pelebaran pita?
a) difusi
b) Proses yang lambat pada penyetimbangan
solut antara m.p and s.p.
c) Jalur alir yang tidak beraturan.
Mengapa pita melebar?
2) Difusi Longitudinal :
Semakin cepat aliran
Semakin singkat pita
berada di dalam
kolom.
semakin pendek
waktu untuk difusi .
broadening 1

u
Mengapa pita melebar?

3) Solut memerlukan waktu untuk

berkesetimbangan di antar fasa.
m.p.

s.p.
(s.p.m.p.) dengan temperatur.
broadening u
Tidak bisa berkesetimbangan dengan
cukup cepat.
Mengapa pita melebar?
 Mengapa pita melebar?
4) Laju yang optimum: laju alir yang menghasil-
kan pemisahan terbaik.
Mengapa pita melebar?

5) Jalur aliran solut yang beragam

Mengapa pita melebar?

6) Persamaan tinggi plat

Mengapa pita melebar?
Plate height equation
Mengapa pita melebar?
7) Kolom tabung terbuka (Open tubular column)

Packed column (A, B, C 0 in van Deemters eqn.)

Open tubular column (A = 0 in van Deemters eqn.)
resolusi ( H & column length)
kapasitas sampel ( s.p. kurang)
 Mengapa pita melebar?
8) Bentuk yang aneh

OH OH (CH3)3SiO OSi(CH3)3
polar
solute
Si O Si Si O Si
s.p. silanization
 Jenis Kromatografi
Kromatografi Cair:
Liquid liquid (teradsorp atau terikat pada
padatan)
Liquid solid
SFC-liquid (teradsorp atau terikat pada padatan)
Kromatografi Gas
Gas liquid (teradsorp atau terikat pada padatan
Gas solid
 Kromatografi adalah pemisahan- kita harus mempunyai
metode deteksi untuk mengikuti pemisahan
Detektor dasar- memberikan puncak pada waktu yang
khas untuk setiap komponen.
Yang paling diharapkan, tetapi lebih mahal, khususnya
adalah spektrometer massa, menghasilkan spektrum
yang unik untuk setiap senyawa yang keluar, sehingga
bisa diidentifikasi.
Waktu retensi= tR= waktu deteksi- waktu injeksi
Volume retensi = VR = tR x laju alir
 Partisi Cair-Cair
Kromatografi Partisi Proses pemisahan
dimana salah satu fasa cair ditahan stasioner
(tidak bergerak) pada padatan pendukung,
sedangkan fasa cair yang mengalir bebas
sepanjang kolom.
Solut mempartisi (membagi) diriantara kedua
fasa berdasar pada koefisien partisinya
masing-masing.
Contohnya adalah kromatografi cair-cair.
 Partisi Cair-Cair
Termasuk penggunaan fasa stasioner cair yang
terikat pada fasa pendukung.
Metode yang paling banyak digunakan
Reprodusibel, prediktabel.
Koefisien distribusi konstan pada rentang
konsentrasi yang lebih lebar dibanding
adsorpsi. Oleh karena itu puncak cenderung
lebih tajam dan simetri.
 Partisi Gas cair
Dalam Kromatografi GLC
Analyte terlarut dalam cairan pada kolom,
atau partisi pada fas gerak dan bergerak ke
sepanjang kolom.
 Bench-top
Ukuran partikel 50-400 mesh
Fasa normal:
Fasa Polar (sering kali mengunakan air)
dilapiskan padaa pendukung
(seringkali silika gel atau alumina)
dielusi dengan hexane, dan sejenisnya (non
polar)
Senyawa Non polar terelusi lebih dulu
 Kromatografi Kolom Gravitasi
Pelarut (eluen) dibiarkan mengalir ke bawah di
dalam kolom oleh gravitasi. Ukuran Partikel ~
200 mm

Flash chromatography
Metode "state of the art" yang digunakan di lab
riset kimia organik.
Pelarut dipaksa turun ke dalam kolom
menggunakan tekanan udara. Ukuran ~ 40 mm
Lab

Pemisahan Uranium VI
Kolom Silika gel
Asam nitrat 6 M
U dielusi dengan methyl isobutil ketone (MIBK)
Ion lain dapat dicuci dengan air
Spesies yang bergerak adalah: UO2(NO3)2.2 keton
Digunakan dalam reprosesing bahan bakar nuklir
Sekarang menggunakan tri-n-butil fosfat secara
industri
 Reverse Phase (Fasa Terbalik)
Fasa stasioner hidrofobik
Khususnya rantai C-18 membentuk serabut
seperti sikat di permukaan partikel silika
Eluen Polar sering kali menggunakanair, metanol,
asetonitril
Senyawa yang paling polar akan terelusi lebih dulu
Senyawa non polar akan tertahan lebih lama,
karena afinitasnya yang rendah terhadap fasa gerak
 Eluen untuk fasa (ter)balik
Air, metanol, asetonitril
Mempunyai UV-cut-offs yang rendah
Semakin polar eluen, senyawa organik yang
mempunyai afinitas rendah dengan eluen
akan cendenrung terikat lebih kuat dengan
kolom hidrpfobik.
Jadi dengna meningkatkan kandungan air di
dalam eluen, waktu retensinya akan
bertambah.
 Eluen
Eluen dapat berubah/berganti dari satu eluen
ke eluen yang lain untuk mengelusi satu set
senyawa lebih dulu baru kemudian kelompok
senyawa yang lain.
Selalu ke arah peningkatan kekuatan elusi
Bila mempunyai dua pompa atau katup
pembagi, dapat dilakukan perubahan
bertahap pada eluen.
 Gradien penggantian eluen bertahap
Selalu meningkatkan
persentase eluen yang paling
kuat
Mencoba mempercepat elusi
senyawa yang lambat
Tidak baik menurunkan
kekuatan, apabila senyawa
yang lambat tidak terpisah
dengan baik. Maka diperlukan
penggantian pelarut atau
bahkan fasa diamnya.
 Kromatografi Pertukaran Ion
Pada kromatografi pertukaran ion, spesies yang
bermuatan dipisahkan melalui material kolom yang
muatanya berlawanan.
Gugus ionik pada kolom penukar ion terikat secara
kovalen ke dalam matriks gel dan dinetralkan
dengan konsentrasi ion lawan (counter ion) yang
ada di dalam buffer.
Bila sampel dimasukkan ke dalam kolom, terjadi
pertukaran ion dengan ion lawan yang terikat
lemah.
 Resin

Dua tipe dasar penukar ion:

Yang mengikat kation, permukaannya
merupakan gugus yang bermuatan negatif
Yang mengikat anion, permukaannya
merupakan gugus yang bermuatan positif.
 Polystyrene-divinylbenzene resin (PS-DVB)
Most common polymer base for ion-exchange
chromatography. Ionic groups are incorporated by
chemical reactions. Porosity and mechanical
stability are altered by varying the cross-linking
through the variation of the DVB content.
Low crosslinking resin swells a lot, changes size
with different ions.
High crosslinking solubility decreases
- selectivity increases
 Anion exchangers
R-NR3+ OH- + A- R-NR3+ A- + OH- strong
base pH 0-12

R-NH3+ OH- + A- R-NH3+ A- + OH- weak base

pH 0-9
 Cation exchangers
R-SO3- H+ + Na+ R-SO3- Na+ + H+
The higher the charge density, the more
tightly an ion is bound
Al3+ > Ca2+ > Na+
For ions of the same charge, the smaller the
hydrated ion, the more strongly it is bound
 Hydrated ions
In any group of elements, those of lower atomic
weight bind more water and therefore have a bigger
hydrated radius and smaller charge density and less
electrostatic attraction.
Selectivity (which is bound more):
Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li +

With a lot of crosslinking (small pores), some large

ions are excluded. This helps increase selectivity.
 Weak acid exchanger
R-CO2- H+ + Na+ R-CO2- Na+ + H+

H+ is bound more strongly than are other

cations
Certain clay minerals have been used for
years as ion exchangers.
 Retention
is based on the affinity of different ions for the
site and on a number of other solution
parameters
pH,
ionic strength,
counterion type,
etc
 Processes occurring during ion exchange
include

Diffusion to surface of bead

-through pore to exchange site
Exchange - rapid
Diffusion out of pore
-leave surface

The bigger the pores, the faster equilibrium is

reached
 What affects these rates :

size of pores,
diffusion coefficients,
`thickness' of ion exchange polymer layer,
charge,
etc.
 Strong exchange equilibria

HR Na NaR H
a NaR a H
[ NaR][ H ] f NaR f H
K
X
a HR a Na [HR ][ Na ] f HR f Na
 Distribution Coefficient
A measure of the strength of binding of a
metal ion to the resin

mmol metal ion / g dry re sin

D
mmol metal ion / mL solution
Weakly bound ions will elute faster
Selectivity Rules & Distribution Coefficients

Ion exchangers are not specific - only selective

R H+ + Na+ R Na+ + H+

[ RNa ][ H ]
Separation factor KA
[ RH ][ Na ]
KA
A/ B
KB
 No adequate theory for activity in strong
electrolytes
- make approximations
- have certain rules to help
 Ion-exchange capacity
The number of ionic sites on the packing that
can take part in the exchange process.
Expressed in mequiv/g;
Typical strong anion-exchange resin may have
3-5 mequiv/g capacity.
Once capacity is used up, resin must be
regenerated with a concentrated
solution to reverse the equilibrium
 Applications summarized
Deionisation, water softeners
Separation of Ions of opposite charge
Separation of Ions of similar charge
Concentration of Trace constituents
(preconcentration)
Chelating Resins
Ion exchange membranes - electrodialysis
Analysis
 Applications

WATER TREATMENT
Deionization of water with a mixed-bed resin
Ca2+ replaced by H+, Cl- by OH-
Resins must be separated before regeneration
Water softeners
Ca2+ repaced by Na+. Regeneration with NaCl

Removal of certain ions prior to an analysis

 Desalination of water by electrodialysis

 Preconcentration
Collect ions on the column
Elute in a smaller volume
eg Trace elements from seawater
131 Iodine from milk (~4 L) to check
contamination from radioactive fallout
 Separation
Can easily remove ions of opposite charge

Separation of ions of like charge takes more

effort

In Ion Chromatograph
 Chelating Resins
Special functional groups
eg iminodiacetate
Divalents are adsorbed from brine, sodium is
not.
 Applications contd
PETROCHEMICAL / CHEMICAL
METALS
Used to recover uranium from leaching streams.
Gold, nickel, and other metals are recovered from
waste. Heavy metals are removed from solution.
PHARMACEUTICALS
A wide variety of important drugs, such as
antibiotics and vitamins, are isolated and purified
from fermentation using ion exchange as the
critical purification step.
 HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Can use all types of column exclusion, affinity,
ion exchange, partition
Most common column: Reverse phase
Silica with C-18 alkyl chains covalently bonded
all around to form a hydrophobic liquid
stationary phase
Particles are small this is what gives high
performance-10 um down to 2 um
 HPLC
http://www.youtube.com/watch?v=kz_egMtd
nL4http://www.youtube.com/watch?v=kz_eg
MtdnL4
Reading to prepare for HPLC lab
Harris eighth edition Harris seventh edition
p 596-600, 603-605, p 557-561, 563-565, 570-571
611-612
Injection Loop
Ion Chomatography:
HPLC with an ion exchange column

Reading for IC Lab

Harris, eighth edition. Harris seventh
p 635-644 edition
p 589-597
 Ion Chromatograph System Configuration
Eluent
Reservoir
Suppressor
Eluent Device
Delivery
Pump
Detection

Conductivity
Cell
Sample
Injection

Guard Column
Data
Analytical Chromatograp Aquisition
Separation Analytical Column hy and
Workstation Instrument
Control
11811
 Anion separations
Most commonly used eluent is NaHCO3/Na2CO3
Also use NaOH
The eluent anions compete with the anions for
the active sites on the column and gradually all
the analyte anions are displaced.
Cation separations
Eluent might be HNO3
Or HNO3/EDTA
 The Role of Chemical Suppression

Without Suppression

Eluent Sample F-, CI-, SO42- Counter Ions

(NaOH)
F- CI SO42-
-

m
Analytical S
Column

Tim
NaF, NaCI, e
Na2SO4 in With Chemical Suppression
NaOH CI SO42-
F- -
Anion Waste
Suppressor
H+
m
S

HF, HCI, H2SO4 Tim

in H2O 11309
e
 FOOD PROCESSING

Cane sugar, beet sugar, glucose, citric acid,

apple and citrus juice, dairy products, and
aminoacids are a few of the products that
would not be available in the same high
quality if ion exchange resins were not used
for their production.
 Another reason for differential hold-up:

Liquid-liquid partition
Harris p. 555-556, 616-617
Requires a different column and very likely a
different eluent.
Most common method in HPLC High
performance liquid chromatography
 Reading for GLC Lab
Harris, seventh Harris, eighth
edition. edition
Equations: p 516 Equations: p 554
538-539 GC: p 566 on
GC sample
570-571
injection: p 577
 Gas Chromatography
http://www.youtube.com/watch?v=08YWh
LTjlfo
Capillary column Coated on inside
Liquid is injected with sharp syringe into heated area
is volatilized
Gas washes components along column: 10 100 m
Separates by differential holdup. More volatile
compounds tend to spend more time in mobile
phase and come off faster moderated by
interaction with coating
Detected Flame Ionization Detector
Capillary columns
Capillary columns are a thin
fused-silica (purified silicate
glass) capillary (typically
10-100 m in length and 250 m inner
diameter) that has the stationary phase
coated on the inner surface. Capillary
columns provide much higher separation
efficiency than packed columns but are
more easily overloaded by too much
sample.