ANALISIS PROTEIN DAN SENYAWA BERNITROGEN

Off G-K/H-K 2014

Penetapan Protein Kasar

Metode Kjeldahl-Mikro
Metode Biuret
Metode Lowry
Metode Pengikatan Zat Warna (Diye Binding)
Metode Kjeldahl-Mikro

PRINSIP
Penetapan protein berdasarkan oksidasi bahan-bahan berkarbon
dan konversi nitrogen menjadi amonia. Selanjutnya amonia
bereaksi dengan kelebihan asam membentuk amonium sulfat.
Larutan dibuat menjadi basa, dan amonia diuapkan untuk
kemudian diserap dalam larutan asam borat. Nitrogen yang
terkandung dalam larutan dapat ditentukan jumlahnya melalui
titrasi dengan menggunakan HCl 0,02 N
PEREAKSI
Asam sulfat pekat (Berat Jenis 1,84)

Air raksa oksida

Kalium sulfat

Larutan natrium hidroksida-natrium tiosulfat (Larutkan 60 g NaOH

dan 5 g Na S2 O2 . 5H2O dalam air dan encerkan sampai 100 ml )

Larutan asam klorida 0,02 N

Larutan asam borat jenuh

PERALATAN
Pemanas Kjeldahl lengkap yang dihubungkan
dengan pengisap uap melalui aspirator

Labu Kjeldahl berukuran 30 ml / 50 ml

Alat distilasi lengkap dengan erlenmeyer

berpenampung berukuran 125 ml

Buret 25 ml / 50 ml
CARA KERJA
Sejumlah kecil sampel
ditimbang (kira-kira akan
membutuhkan 3-10 ml HCl
0,01 N atau 0,02 N),
dipindahkan ke labu Kjeldahl
30 ml
Erlenmeyer 125 ml yang berisi
5 ml larutan H2BO3 dan 2-4
tetes indikator (campuran 2
bagian metil merah 0,2% dalam
alkohol dan 1 bagian metilen
blue 0,2 % dalam alkohol)
diletakkan dibawah kondensor
Ditambahkan 1,9 0,1 g
K2SO4, 40 10 mg HgO, dan
Ditambahkan beberapa butir
2,0 0,1 ml H2SO4. Jika
batu didih. Sampel dididihkan
sampel lebih dari 15 mg,
selama 1-1,5 jam sampai cairan
ditambahkan 0,1 ml H2SO4
menjadi jernih
untuk setiap 10 mg bahan
organik diatas 15 mg
Isi labu dipindahkan ke alat
destilasi. Labu dicuci dan Sampel didinginkan,
dibilas 5-6 kali dengan 1-2 ml ditambahkan sejumlah kecil air
air. Air cucian ini dipindahkan secara perlahan-lahan
ke alat distilasi.
CARA KERJA

Isi erlenmeyer diencerkan

Ditambahkan 8-10 ml larutan sampai kira-kira 50 ml
Tabung kondenser dibilas
NaOH - Na2S2O3 lalu kemudian dititrasi dengan HCl
dengan air, dan bilasannya
dilakukan distilasi sampai 0,02 N sampai terjadi
ditampung dalam erlenmeyer
tertampung kira-kira 15 ml perubahan warna menjadi
yang sama.
destilat dalam erlenmeyer abu-abu. Lakukan juga
penetapan blanko.
PERHITUNGAN

,
%N=

% protein = % N x faktor konversi (Lihat tabel)

Tabel Faktor Konversi Kadar Protein Berbagai Macam Bahan

No Bahan Faktor Konversi

1 Bir, sirup, biji-bijian, ragi, makanan ternak, buah-buahan, teh, malt, 6,25
anggur, tepung jagung

2 Beras 5,95

3 Roti, gandum, makaroni, bakmi 5,70

4 Kacang tanah 5,46

5 Kedelai 5,71

6 Kenari 5,18

7 Susu dan produk-produk susu 6,38

Metode Biuret

Prinsip
Metode Biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk menentukan
kadar protein suatu larutan. Dalam larutan basa Cu2+ membentu kompleks
denganikatan peptida (-CO-NH-) suatu protein yang menghasilkan warna
ungu dengan absorbansi maksimum pada 540.

Absorbansi ini berbanding langsung dengan konsentrasi protein dan tidak

tergantung pada jenis protein karena seluruh protein pada dasarnya
mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama per satuan berat Metode ini
umumnya memerlukan 1-10 mg protein per ml.
pereaksi

Pereaksi Biuret Larutan Protein Standar

Larutan 3 g CuCO4.5H2O Buat larutan bovine serum
dalam 500 ml NAOH 0,2N albumin dalam air dengan
Tambahkan 5 g KI, konsentrasi 5 mg/ml
encerkan sampai 1000 ml Ukur kadar air serum
dengan menggunakan albumin, nyatakan
NAOH 0,2 N konsentrasi dengan dasar
berat kering
 PERALATAN
Cara KERJA
1. Spektofotometer 1. Pembuatan Kurva Standar
2. Sentrifuge 2. Persiapan Sampel
3. Waring Blender 3. Penetapan Sampel
Pembuatan kurva standar

Masukkan ke dalam tabung Tambahkan 6 ml pereaksi

Tambahkan air sampai
reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, Biuret ke dalam masing-
volume total masing-masing
0.4, 0.6, 0.8, dan 1 ml masing tabung reaksi,
4 ml
larutan protein standar campur merata

Simpan tabung reaksi pada

suhu 37oC selama 10 menit
atau pada suhu kamar selama Ukur absorbansinya pada
30 menit sampai 520 nm
pembentukan warna ungu
sempurna
Persiapan sampel
Sampel berupa cairan, apabila
padatan dihancurkan dahulu
dengan menggunakan waring
blender dan penambahan air.
Jika cairan keruh atau
mengandung bahan-bahan
yang mengganggu maka harus
dilakukan beberapa perlakuan
berikut
Jika cairan berupa larutan
Hancuran yang diperoleh
protein seperti protein
disaring lalu disentrifuse.
konsentrat, isolat yang tidak
Supernatan didekantasi untuk
keruh maka cukup dengan
dipergunakan selanjutnya.
pengenceran secukupnya
Alikuot atau ekstrak
Kedalam masing-masing tabng
didistribusikan ke dalam
reaksi tambahkan 1 ml
tabung reaksi pada waktu
Trichloroacetid acid (TCA)
penetapan standar
10% sehingga protein akan
tambahkan air sampai volume
terdenaturasi
total masing-masing 1 ml
Lanjutan...
Sentifuse pada 3000 rpm
selama 10 menit sampai
protein yang terdenaturasi
mengendap, supernatan
dibuang dengan cara
dekantasi
Tambahkan 6 ml pereaksi
Biuret, alkali dalam pereaksi
ini akan melarutkan endapan
yang tersisa
Kedalam endapan tambahkan 2
ml etil eter, sampur merata lalu Kedalam endapan kering
sentrifuse kembali. Hal ini
untuk menghilangkan residu ditambahkan air 4 ml,
TCA, biarkan mengering pada campur merata
suhu kamar
Penetapan sampel : 0,1-1 ml
sampel dimasukkan ke
dalam tabung reaksi,
kemudian diperlakukan
seperti menetapkan standar
Metode lowry
Metode Lowry

Prinsip
Reaksi antara CU2+ dengan ikatan peptida dan
reduksi asam fosfomolobdat dan asam fosfotungstat
oleh tirosin dan triftofan (merupakan residu protein)
akan menghasilkan warna biru.

Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan

fosfotungstat, oleh karena itu warna yang terbentuk tergantung pada
kadar tirosin dan triftofan dalam protein. Metode lowry 100 kali lebih
sensitif dari biuret
pereaksi

1. Natrium karbonat 2% 2. Tembaga sulfat 0.5% 3. Campuran 50 ml

dalam larutan NAOH dalam larutan Na.K pereaksi dengan 1 ml
0,1 N (50 ml) tartrat 1% (1 ml) pereaksi

4. Pereaksi Folin Pembuatan pereaksi folin Campuran ini kemudian

Ciocalteau (perekasi ciocalteau : 100 gr natrium
tungstat, 25 gr natrium
fenol), dilarutkan molibdat, 500 ml akuades, 50
dengan air 1 : 1 ml asam fosfat 85% dan 100 ml
sebelum digunakan HCL pekat kedalam labu 2 liter
direfluks dengan hari-
hati selama 10 jam
dengan menggunakan
kondenser
lanjutan
Sesudah didinginkan, tambahkan
ke dalam labu 150 gr litium
Sesudah pendinginan, volume
sulfat, 50 ml aquades dan
larutan dijadikan 100 ml dan
beberapa tetes Br2, pendidihan
saring jika perlu
dilanjutkan lagi selama 10 menit
dengan tanpa kondenser

Filtrat tidak boleh ada warna

kehijauan, jika ada maka
5. Larutan protein standar 0,25
pendidihan harus dilakukan
mg/ml (larutan bovine serum
sekali lagi. Ini merupakan stock
albumin)
reagen, larutkan dengan air 1 :
1 sebelum digunakan.
Cara kerja
1. Pembuatan Kurva Standar
2. Persiapan Sampel
3. Penetapan Sampel
Pembuatan kurva standar
Masukkan ke dalam tabung
reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2,
0.4, 0.6, 0.8, dan 1 ml
larutan protein standar
Tambahkan 0.5 ml pereaksi
(4) ke dalam masing-maisng
tabung reaksi, kocok merata
dengan tepat sesudah
penambahan
Tambahkan air sampai
volume total masing-masing
4 ml
Biarkan selama kurang lebih
30 menit sampai warna biru
terbentuk
Tambahkan 5.5 ml pereaksi
(3) ke dalam masing-masing
tabung reaksi, campur
meratabiarkan selama 10-15
m3nit dalam suhu kamar
Ukur absorbannya pada
650 nm. Buat kurva standar
 Persipan Penetapan
sampel sampel
Persiapan sama seperti 0.1 1 Ml dipipet
mempersiapkan sampel tepat,masukkan ke dalam
penetapa protein metode tabung reaksi kemudian
biuret diperlukan seperti
penetapan standar
METODE PENGIKATAN ZAT WARNA (DYE BINDING)
Metode ini hanya
dapat diterapkan Prinsip
untuk menetapkan
kadar protein susu
secara tidak langsung Zat warna mempunyai kemampuan bergabung dengan gugus
polar protein yang bermuatan ion berlawanan
Untuk itu diperlukan
kalibrasi dengan
Kompleks tidak larut yang terbentuk kemudian dipisahkan dengan
metode Kjeldal cara sentrifugasi atau penyaringan dan konsentrasi zat warna yang
tidak terikat dapat diukur densitasi optisnya

Dengan menggunakan kurva standar yang menyatakan hubungan antara

densitasi optis dengan kadar protein yang ditetapkan dengan metode
Kjeldahl, maka kadar protein dalam sampel dapat ditentukan
ALAT DAN BAHAN

Alat Bahan

Sentrifuge 5 ml susu
Spektrofotometer 200 ml aquades
Batang pengaduk Larutan DYE :
Tabung erlenmeyer 0,6165 g amido black atau 1 g orange
G
Beker glass
1L asam sitrat 0,3 M
Cara kerja
Encerkan 5 ml susu menjadi 100
ml dengan air
Tentukan kadar protein sample
berdasarkan kurva standar
hubungan antara densitas optis
dengan kadar protein susu yang
ditetapkan dengan metode
Kjedahl yang telah dibuat
sebelumnya
Campurkan 5 ml larutan susu
Dengan cara yang sama buat
dengan 10 ml larutan DYE
blanko, terdiri dari 5 ml air+10
dalam tabung sentrifuge 15 ml,
ml larutan DYE
kocok
Encerkan 3 ml supernatan
Sesudah dibiarkan selama 10
menjai 100 ml, kemudian ukur
menit, sentrifuge pada 2500 rpm
densitas optisnya pada 615 nm
selama 5 menit. Ambil
(amido black) atau 485 nm
supernatannya
(Orange G)
PENETAPAN ALFA-AMINO NITROGEN
METODE TBNS
Pendahuluan
Metode ini dapat diterapkan untuk bahan pangan hewani. Jika
diterapkan pada bahan pangan yang banyak mengandung
karbohidrat maka perlu membuat blanko
Metode ini dapat juga digunakan untuk menetapkan kadar
protein ekstrak lipid, asam amino bebas dalam cairan biologis
dan untuk menggambarkan sidik jari (fingerprint) tryptic
peptide
Prinsip
Pada pH 8, asam trinitobenzensulfonat bereaksi
dengan gugus alfa-amino bebas komponen
bernitrogen berbobot molekul rendah
menghasilkan senyawa berwarna yang dapat
diukur absorbansinya pada 340 nm
 Peralatan Pereaksi

Penangas air yang Larutan asam 2, 4, 6

dilengkapi dengan trinitrobenzensulfonat
stirer, heater, dan (TNBS) 0,1%
kontrol suhu. Larutan buffer, pH 8,2
Spektrofotometer Larutan HCl 1N
Larutan glisin standar
CARA KERJA
Pembuatan Kurva Standar
Larutan glisin standar
diencerkan sehingga
menghasilkan sederet larutan
yang mengandung 1,0: 2,5: 5,0:
10,0; dan 15,0 ug glisin/ml
Ditambahkan 1 ml HCl 1N dan
diukur absorbansinya pada 340
nm
Di pipet 1,0 ml masing-masing
larutan ke dalam tabung reaksi
20 ml bertutup. Ditambahkan 1
ml larutan buffer dan 1 ml
larutan TNBS. Dicampurkan
merata, ditutup, direndam dalam
penangas 400c selama 2 jam
Buat kurva standar
CARA KERJA
Penetapan Sampel

Dilarutkan 1 ml ekstrak
Ditambahkan 1 ml
malt wort atau bir
buffer dan 1 ml larutan
menjadi 100 ml dengan
TNBS
akuades,

Diperlakukan sampel
dan blanko dan blanko
selanjutnya seperti
pada pembuatan kurva
standar
PERHITUNGAN
14
Alfa-amino Nitrogen (mg/100ml) = 10.000
75

Dimana:
Ekivalen glisin didapat dari kurva standar
14 = berat atom Nitrogen
75 = bobot molekul Glisin
Nitrogen Non-Protein
Pendahuluan
Metode ini dapat digunakan pada semua jenis makanan
dan bahan pangan
Prinsip
Sampel diekstrak dengan. Protein diendapkan dengan
tembaga asetat dan komponen bernitrogen non-protein
tinggal dalam larutan. Sesudah dan penyaringan nitrogen
dalam filtrate ditetapkan dengan metode kjeldahl.
 Labu Kjedahl 800 ml

Peralatan
Corong berdiameter 4 inci atau 12 cm
Labu Buchner
Kertas saring Whatman No. 541 / S&S No. 1505
berdiameter 18 cm

Larutan tembaga asetat monohidrat 3% (w/V)

Pereaksi Larutan Alumunium postasium sulfat 24 H2O 10%

(w/v)
Silikon antibusa
 Cara kerja
Timbang sampel dengan
ketentuan : 2g u/ yg
mengandung protein sampai
25% , 1g u/ yg mengandung
protein 25-50%, 0,5 g u/ yang
mengandung protein diatas 50%
Sementara hasil ekstrak masih
panas tambahakan 2ml larutan
alumunium sulfat, campur
sampai merata
U/ sampel susu dan sejenisnya
kocok dg cepat, hangatkan
dalam penangas sampai 40o C, Pindahkan sampel dalam labu
kocok lagi, dinginkan sampai 20o kjeldahl
C, ambil alikuot secuknya /
11ml
Digest campurkan campurkan Tambahkan 50ml akuades ,
dg mendidihkannya selama h sedikit batu didih dan 1-2 tetes
(jangan sampai kering) silicon antibusa
 Next.

Tambahkan 50ml
Panaskan kembali
larutan tembaga sulfat, Biarkan sampai dingin
sampai mendidih
campur merata

Saring melalui kertas

Cuci labu kjeldahl dan saring dengan
Pindahkan filtrate dari
endapakan dg 50ml air menggunakan corong
labu Buchner
dingin beriameter 4inci dalam
labu Buchner
Penetapan Total Volatile Base Nitrogen (TVN)
dan Tri-Methylamine
 Prinsip
Sampel di ekstrak dengan TCA 5% sehingga seluruh proteinnya mengendap dan
seluruh komponen volatile bernitrogen larut dalam larutan TCA. Ekstrak TCA
kemudian didistilasi sehingga komponen volatile bernitrogen ditangkap oleh
larutan HCl 0,01 M. destilat ini kemudian dititrasi dg NaOH 0,01 M sehingga
kadar TVN dapat ditentukan.
Untuk menetapkan TMA, kedalam distilat yang sudah dititrasi dg NaOH
ditambahkan formaldehid 16% sehingga seluruh komponen yang mengandung
gugus NH2 terikat oleh formaldehid, TMA sendiri tidak terikat. Dengan
mentitrasi kembali campuran yang sudah ditambah formaldehid ini maka kadar
TMA dapat diketahui.
Pereaksi Peralatan
Larutan TCA 5% (w/v) Alat distilasi
NaOH 2M Waring blender
HCl 0,01 M Sentifuge
NaOH 0,01M Buret + Statip
Formaldehid 15% (w/v) netral
Indikator merah fenol
Timbang 100g sampel yg Tambahkan 300ml larutan Pisahkan ekstrak TCA dg
sudah digiling masukan TCA 5% jalankan waring cara penyaringan atau
dalam waring blender blender sampai homogen sentrifuge

Ambil 5ml ekstrak TCA

Tambahkan beberapa
masukkan ke dalam alat
tetes merah fenol ke Lakukan distilasi dg 15ml
disilasi kjeldahl
dalam destilat, titrasi dg HCl 0,01 M standar
semimikro. Tambahkan
NaOH 0,01 M
5ml NaOH 2M

Tambahkan 1ml
formaldehid 16% u/ Cara kerja
setiap 10ml campuran
sesudah titrasi pertama,
kocok, titrasi dg NaOH
0,01 M
Perhitungan

14 300+ 15 1 0,01 100

TVN (mg/100g) = x
5
14 300+ 2 0,01 100
TMA (mg/100g) = x
5
14 = bobot atom nitrogen
V1 = volume NaOH 0,01 M yg dibutuhkan untuk titrasi I
M = berat sampel (g)
W = jumlah air yang ada dalam bahan (g)
V2 = volume NaOH 0,01 M yg dibutuhkan untuk titrasi II
 Sembah Nuwun

Monggo ingkang badhe tanglet