Standard Operating Procedure for

laboratory malaria diagnosis &

RDT malaria
Inge Sutanto
Department of Parasitology,
Faculty of Medicine, University of
Indonesia, Jakarta
 Pemeriksaan mikroskopis
 Merupakan pemeriksaan malaria yang paling
ideal karena:
- relatif murah : lancet, kapas alkohol, gelas
obyek, Giemsa, buffer,
pipet, gelas ukur, mikroskop
 Pemeriksaan mikroskopis
 Hal yang harus diperhatikan:
1. pengambilan darah
2. pembuatan sediaan darah
3. pewarnaan sediaan darah
4. pembacaan sediaan darah
 Pemeriksaan mikroskopis
Pengambilan darah:
- dapat dari ujung jari tangan, ujung tumit
(bayi), darah vena, plasenta, tali pusat bayi
Pemeriksaan mikroskopis:

 Pengambilan darah:
- Idealnya darah langsung (tanpa
antikoagulan)
- Darah dengan antikoagulan harus
diproses secepatnya (<1 jam), karena
dapat terjadi perubahan morfologi
dan jumlah parasit
 Pembuatan sediaan darah
 Siapkan kaca obyek yang bersih dari
kotoran dan lemak, karena darah akan sulit
menempel
 Pengambilan darah
 Mula-mula kulit dibersihkan dengan alkohol
70% untuk menghilangkan kotoran →
keringkan
 Pengambilan darah

- Tusuk dengan lancet, tetes pertama dibuang,

tetes kedua buat sediaan darah
 Pemeriksaan mikroskopis
 Buat sediaan darah tebal (3 tetes) dan sediaan
darah tipis (1 tetes) pada satu kaca obyek
(supaya tidak tertukar)
Berbagai sediaan darah
Pemeriksaan mikroskopis
 Keringkan (tidak lebih dari 2 x 24 jam)
dan jaga jangan sampai dimakan serangga:
- dapat dipercepat dengan menggunakan kipas
angin (paling aman)
- atau lampu mikroskop (hanya sebentar) atau
alat pengering rambut (sebentar)
 Pengeringan sediaan darah
 Jaga jangan sampai terlalu panas, karena
sediaan darah tebal dapat terfiksasi
 Fiksasi sediaan darah
 Sediaan darah tipis difiksasi dengan metanol:
- mencelupkan obyek gelas bagian s.d. tipis
kedalam gelas beaker berisi metanol,
- atau dengan meneteskan metanol pada
sediaan darah tipis
 Pewarnaan dengan Giemsa:
 Siapkan campuran 3% Giemsa dengan
akuades atau cairan buffer (3 cc Giemsa :
97 cc akua/buffer), dan warnai sediaan darah
selama 30 menit
 Pewarnaan dengan Giemsa:
 Setiap gelas obyek memerlukan 3 cc larutan
Giemsa ( 0,1 cc Giemsa dan 2,9 cc akua/bufer)
Pengaruh pewarnaan dengan
berbagai pH
 Pewarnaan dengan Giemsa:
 Warnai sediaan darah dengan hati-hati (jangan
langsung diatas sediaan darah), kalau perlu
gunakan pipet.
 Bila jumlahnya banyak dapat digunakan bak
pewarna
 Tunggu selama 30 menit
Pelaporan hasil pemeriksaan
- Tulislah nama spesies
- Tulis nama stadium
(terutama untuk P.f)
- Hitung jumlah parasit
(terutama untuk evalusi
pengobatan)
 Penyimpanan sediaan darah
- sediaan darah disimpan
dalam slide box
- kopi laporan hasil
pemeriksaan
 Rapid diagnosis test

Hal yang harus diperhatikan

1. Transportasi pada suhu < 300C
Rapid diagnostic test
Hal yang harus diperhatikan
2. Penyimpanan sebaiknya di lemari es (tidak beku)
Rapid diagnostic test
Hal yang harus diperhatikan
3. Uji cepat dilakukan pada suhu ruang
(tidak lebih dari 300C)
 Rapid diagnostic test
Hal yang harus diperhatikan
4. Semua langkah harus sesuai petunjuk/manual:
- Darah ujung jari diambil sebanyak 2 – 50 µl
dengan pipet kapiler (tergantung jenis kit)
- Kadang-kadang dapat juga digunakan darah
dengan antikoagulan atau plasma
 Rapid diagnostic test
Hal yang harus diperhatikan
4. Semua langkah harus sesuai petunjuk/manual:
- Darah dicampur dengan buffer pada well/pad
yang akan melisiskan dinding sel darah merah
dan antibodi spesifik yang dilabel
 Rapid diagnostic test
Hal yang harus diperhatikan
4. Semua langkah harus sesuai petunjuk/manual:
- Ag yang ada dalam darah akan bermigrasi
berdasarkan sifat kapiler ke daerah yang
mengandung reagen/monoklonal yang spesifik
terhadap P. falciparum atau non P. falciparum
(Biasanya tidak lebih dari 15 menit)
 Rapid diagnostic test
Hal yang harus diperhatikan
4. Semua langkah harus sesuai petunjuk/manual:
- Ditambahkan cairan pencuci untuk
menghilangkan hemoglobin, dan bila positif
terlihat lebih dari 1 garis, bila negatif hanya
terlihat 1 garis (kontrol)
 Rapid diagnostic test
Hal yang harus diperhatikan
4. Semua langkah harus sesuai petunjuk/manual:
- Bila terlihat garis postiif (> 1 garis) lebih dari
waktu yang ditentukan (biasanya > 15 menit),
hasilnya tidak valid atau positif palsu
 Rapid malaria test

 Three antigens used for

diagnosis:
1. PfHRP2
2. Aldolase
3. Lactate dehydrogenase
 PfHRP-2 (Histidine Rich
Protein-2)
 A water soluble protein that is
produced by asexual stages and
young gametocytes of P.falciparum
 could remain in the blood until 28
days from initiation malaria therapy
Jamshaid Iqbal et al. Persistent Histidine-Rich Protein 2, Parasite Lactate Dehydrogenase, and
Panmalarial Antigen Reactivity after Clearance of Plasmodium falciparum Monoinfection. JOURNAL
OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Sept. 2004, p. 4237–4241 Vol. 42, No. 9
 Plasmodium aldolase

 Is an enzyme of the parasite

glycolytic pathway expressed by
the blood stages of P. falciparum
as well as the non-falciparum
malaria parasites
 Plasmodium aldolase

 Monoclonal antibodies against

Plasmodium aldolase are pan-
specific in their reaction and
have been used in a combined
Pf/Pv immuno-chromatographic
test that targets the pan
malarial antigen (PMA) along
with PfHRP2
Microscopy Number HRP-2+ Sensitivity Aldolas Sensitivity
of e+
patients of HPR-2 of aldolase

(%) (%)

Monoparasitic P.f. 52 52 100.00 25 48.08

P.f. ‡40,000/ll 25 25 100.00 20 80.00
P.f. <40,000/ll 27 27 100.00 5 18.52
Mixed infections 4 4 100.00 2 50.00
P.f.+P.o. 3 3 100.00 1 33.33
P.f.+P.m. 1 1 100.00 1 100.00
All P.f. 56 56 49.09 27 48.21
Monoparasitic non-
13 0 0.00 3 23.08
falciparum malaria
P.v. 8 0 37.50 3 37.50
P.o. 3 0 0.00 0 0.00

P.m. 2 0 0.00 0 0.00

Joachim et al. Parasitol Res (2004) 94: 384–385
 Parasite lactate
dehydrogenase (pLDH)

 It has been found in all 4 human

malaria species, and
different isomers of pLDH for each of
the 4 species exist
 Parasite lactate dehydrogenase
(pLDH)

 A soluble glycolytic enzyme

produced by the asexual and sexual
stages of the live parasites
 PfHRP2 PfHRP2/PMA pLDH

Control

PfHRP2

PMA

pLDH

pfLDH
 Rapid malaria test

 The pLDH test is formatted to detect a

parasitemia of < 100 to 200 parasites/µl
 Only some of the PfHRP2 tests are said
to detect asexual parasitemia of < 40
parasites/µl
( in general < 100 parasites per
microliter)
Alonso Soto Tarazona et al
Evaluation of the Rapid Diagnostic Test OptiMAL for Diagnosis of
Malaria due to Plasmodium vivax
The Brazilian Journal of Infectious Diseases 2004;8(2):151-155

The sensitivityof the OptiMALÒ test progressively decreased when parasitemia

was lower than 1,000 parasites/microliter.

Table 2. Sensitivity of OptiMAL related to parasitemia levels

Parasitemia (parasites/ul) Number of patients Sensitivity

< 500 3 33%
501-1,000 6 83%
1,001-5,000 18 100%
5,001-10,000 3 100%
<10,000 9 100%