PRESERVASI DAN KRIOPRESERVASI

SEMEN dan EMBRIO

Dr. Drh. Asmarani Kusumawati, M.P

 PENDAHULUAN
Kualitas semen

Kuantitas semen
Keberhasilan
Inseminasi Buatan
Performa reproduksi
betina

Ketrampilan tenaga
pelaksana
 Program IB
Θmetabolisme
sperma
fertilitas ok!
Semen
Pembekuan semen

Kemampuan bertahan Dehidrasi

pada proses pembekuan sperma
rendah/tinggi Pembentukan
kristal es

↓ kualitas
spermatozoa

Krioprotektan
 PRESERVASI SEMEN

Preservasi adalah teknik pengawetan,

pemeliharaan, penjagaan, dan perlindungan
semen pada temperatur tertentu

TUJUAN
menyimpan, memelihara dan menjamin
kelangsungan hidup dari suatu materi (semen)
agar daya hidup spermatozoa dapat
dipertahankan.
SYARAT PRESERVASI SEMEN
Fungsi Syarat
pengencer pengencer

Memperbanyak volume Murah, sederhana, praktis

semen

Melindungi spermatozoa dari Mempunyai daya preservasi

cold shock tinggi

Megandung unsur fisik dan

Menyediakan sumber energi kimia yang sama dengan
semen

Sebagaibuffer, mempertahankan
tekanan osmosis Mempertahankan daya
fertilitas spermatozoa

Mencegah terjadinya
pertumbuhan bakteri
 Jenis Pengencer
a. egg yolk-sitrat
b. homogenized whole milk
c. fresh & dried skim milk
d. coconut milk (santan kelapa)
e. Tris (hydroxymethl) aminomethane

 Buffer : Sitrat, phosphat, tris, dll

 Pelindung terhadap cold shock : Egg yolk, skim milk
 Antibakteri  antibiotika : penicillin, streptomycin,
polymyxin B, dll
 KRIOPRESERVASI SEMEN
Kriopreservasi merupakan teknik penyimpanan
sel hewan, tumbuhan atau materi genetika lain
(semen dan oosit) dalam keadaan beku melalui
reduksi aktivitas metabolisme tanpa
mempengaruhi organel-organel di dalam sel
sehingga fungsi fisiologis, biologi dan morfologi
tetap ada.
Krioprotektan
Lanjutan…
Zat kimia nonelektrolit yang berperan dalam mengurangi
pengaruh mematikan selama pembekuan baik berupa pengaruh
larutan maupun adanya pembekuan kristal es sehingga
viabilitas sel dipertahankan
Berat Molekul
kecil

Krioprotektan
Ideal Mudah larut
dalam air

Toksisitas
rendah
Mekanisme kriopreservasi
Semakin lambat Semakin banyak Dehidrasi ↑
Suhu ↓ ↓ suhu waktu pengeluaran
air
↓ suhu cepat
Kerusakan, ↑
Di luar sel membentuk kristal (rapid cooling)
kons zat
es, air di dalam sel cair (super terlarut
cooling) Θ dehidrasi
& ↑ kons zat
terlarut

Tekanan osmotik lingk

sperma ↑ (↑ kons. Zat Merusak membran &
terlarut di luar sel) mempengaruhi fungsi
sperma

Air dalam krioprotektan

spermatozoa akan
(Critser and Benson, 2004).
keluar (kepala) 
dehidrasi
 Lanjutan….
Krioprotektan
penetrating (bekerja di dalam
 cara kerjanya dan luar sel)

Non penetrating (bekerja

hanya diluar sel) (

 bahan terkandung di dalamnya

kelompok alkohol (etilen glikol, gliserol,
dan lain-lain).

kelompok amida (dimetilformamid,

asetamid, metilformamid dan lain-lain)
 Lanjutan….
Peranan krioprotektan
Melindungi sel saat pembekuan
Bobot molekul kecil  mudah & cepat
penetrasi ke dalam sel  ↓ toksisitas
EG; DMF; gliserol
 62,07; 73; 92,1 (Alvarenga et al.,
2005).
 Mekanisme kerja Gliserol & EG
• bulk water  90%
Gliserol & EG dr isi air yang
keluar
• bound water
10%

Masuk sel Menggantikan

Vol air tidak Air keluar
membran (difusi) posisi molekul air
semua keluar semua sel
yang keluar
kering mati

Mencegah molekul Diikat gliserol & EG

air intraseluler Membeku
(gugus hidroksil)
membeku
Permukaan
Tidak halus
Membentuk kristal es besar &
merusak membran merusak
membran sel
Langkah-langkah Kriopreservasi Semen
Koleksi Semen

Simpan Semen
pada suhu 30°C

Sebagian Tambah
Sebagian dievaluasi
Extender

Simpan pada suhu

30°C, 30 menit

1 jam menurnkan suhu Penambahan Gliserol

30°C menjadi 5°C bertahap
Dikemas kedalam
straw/pellet

Penurunan suhu
-15°C -150°C -196°C
bertahap
 KRIOPROTEKTAN
- DMSO, gliserol, sediaan krioprotektan siap pakai
- Pemakaian krioprotektan secara bertahap
- Pembuatan larutan yang mengandung
krioprotektan  secukupnya saja
- Larutan yang mengandung serum  tidak dapat
disimpan > 3-5 hari  denaturasi protein
- Larutan disimpan dalam refrigerator atau frozen
sampai saat digunakan
 TEKNIK KRIOPRESERVASI

Penampungan Semen Pengenceran Semen

Ekuilibrasi
(3-5C; 4 jam) Pengemasan

Pembekuan Penyimpanan
(uap N2cair ; 10-15 menit)

Thawing
 EVALUASI SEMEN

• Warna, volume, konsentrasi,

Sebelum pH
• Gerakan massa, motilitas,
pembekuan hidup mati, abnormalitas

Setelah • Motilitas (min. 40 %)

• Hidup dan mati ( > 50 %)
pembekuan • Abnormalitas ( < 20 %)
 KRIOPRESERVASI EMBRIO
• Merupakan suatu metode untuk penyimpanan
embrio yang akan digunakan untuk embrio
transfer.
• Keuntungan kriopreservasi dalam program
embrio transfer adalah lebih efisien dalam
penggunaan resipien, mengurangi kebutuhan
memindahkan sapi, efisien dalam
menyebarkan genetic yang baik, dan
memfasilitasi persebaran genetic sapi secara
internasional.
 ALUR PROSES

Koleksi Larutan Persiapan

Embrio Krioprotektan Precooling

Freezing,
Prosedur
Thawing Seeding, dan
Pendinginan
Plunging

Penghilangan
Krioprotektan
 KOLEKSI EMBRIO
• Diperoleh dari sapi pendonor yang sudah
diseleksi, kemudian dikoleksi embrionya
menggunakan metode secara surgical, non
surgical atau postmortem.
• Embrio diletakkan dalam media kultur steril,
setiap 2 jam sekali cairan media harus diganti.
Embrio disimpan pada suhu 37°C.
• Dilakukan evaluasi secara mikroskopik dan
diklasifikasikan.
 Klasifikasi kualitas embrio
Embrio memiliki bentuk yang simetris dan spherical
dengan blastomere yang seragam dalam ukuran, warna,
dan kepadatan. Jika terdapat vakula sitoplasma yang
ireguler, paling tidak 85% sel embrio menunjukan
Kualitas 1 kenormalan, tidak lebih dari 15% sel embrio yang
(sangat baik menonjol menuju perivitelline space. Zona pelusida
atau baik) berbentuk spherical, halus, dan tidak ada cekungan
atau permukaan yang datar sehingga embrio tidak
menempel pada cawan petri atau straw.
Memiliki kelainan yang sedang pada seluruh
massa embrio, seperti pada ukuran, warna, dan
Kualitas 2 kepadatan individual sel. Pigmentasi sitoplasma
(cukup) yang tidak begitu merata dalam individual
blastomere, atau adanya vakuola dalam
sitoplasma blastomere. Paling tidak 50% sel
embrio utuh, memiliki kemampuan hidup, dan
memiliki masa embrio yang kompak.
 Memiliki kelainan yang banyak pada seluruh massa
embrio, seperti pada ukuran, warna, dan
kepadatan individual sel. Pigmentasi yang tidak
rata pada sitoplasma individual blastomere atau
Kualitas 3 ditemukan banyak vakuola dalam sitoplasma
(jelek) blastomere. Paling tidak 25% sel embrio utuh,
memiliki kemampuan hidup, dan memiliki masa
embrio yang kompak. Terdapat multiple tonjolan
sel dengan berbagai ukuran yang mengindikasikan
Embrioadanya
tidak abnormalitas yang persisten.
memiliki kemampuan untuk hidup
dan sebaiknya tidak ditranferkan kepada betina
Kualitas 4
resipien atau di kriopreservasi. Embrio yang mati
(mati atau
atau mengalami degenerasi akan memiliki
degenerasi)
sitoplasma yang gelap, membrane sel yang tidak
utuh, dan berbagai kelainan yang signifikan.
 krioprotektan
• Krioprotektan didefinisikan sebagai berbagai
substansi yang dapat membantu sel untuk
bertahan selama freezing dan thawing.
Penetrasi
(glyserol, ethylene glycol, DMSO,
isopropyl alcohol)
Non-Penetrasi
(gula: sukrosa,
galaktosa, dan
Krioprotektan trehalosa)
Media lain
Tissue Culture Medium
(TMC 199), Dulbecco’s
phosphate-buffered
saline (PBS)
• Krioprotektan yang digunakan harus disuplementasi
dengan bovine serum albumin (BSA).
• Krioprotektan yang sudah ditambah dengan serum tidak
diperbolehkan untuk disimpan lebih dari 3-5 hari, karena
protein akan mengalami degenerasi ketika tidak dalam
suhu yang optimal.
• Larutan ini harus disimpan dalam suhu dingin atau beku
sebelum digunakan.
• Krioprotektan ditambahka pada suhu 0° atau 20°C dan
kemudian didinginkan sampai suhu -7°C yang merupakan
titik pembekuan yang diinisiasi oleh penambahan kristal
es pada media (seeding).
 Persiapan precooling
• Embrio dipindahkan pada larutan
krioprotektan dengan serial
konsentrasi
• Straw ditautkan pada syringe
menggunakan rubber adapter
untuk mengaspirasi
media/gelembung udara dan
embrio
• Straw dan cane diberi label untuk
identifikasi lanjut
• Straw dihangatkan atau diisi
dengan phosphate-buffered saline
• Straw dicelupkan ke dalam PVS
biru atau merah pada kedua ujung
 Prosedur pendinginan
•Slow cooling : rata-rata penurunan suhu 0,5-
1,6°C/menit.
•Rapid cooling : rata-rata penurunan suhu 17-
30°C/menit.
•Penurunan suhu rata-rata 1°C/menit sampai
suhu -7°C.
FREEZING, SEEDING, DAN PLUNGING
• Sraw diletakan pada freezer dengan suhu -6°C selama 10
menit
• Forceps didinginkan dalam nitrogen cair
• Straw digenggam dengan forceps pada bagian dekat dengan
embrio sampai terbentuk kristal es
• Straw yang telah membeku, ditempatkan pada programmable
freezer dan pendinginan
• Kanister dengan embrio beku dipindahkan dari freezer dan
dicelupkan dalam nitrogen cair
• Straw disimpan dalam tangki nitrogen cair dan disimpan pada
suhu -196°C.
 Thawing embrio
• Kenaikan suhu saat thwing sekitar 20°C/menit
(slow warming) sampai 36-50°C/menit (rapid
thawing).
• Suhu optimal untuk thawing adalah 37°C
• Embrio akan berada dibawah vial dan dapi
diobservasi dibawah mikroskop, dihitung, dan
dipindahahkan dengan mikropipet
• Straw harus dithawing selama 4 detik pada
suhu 37°C pada water bath dan
menghilangkan es yang meleleh.
 Penghilangan krioprotektan
(analisis ketahanan embrio)
•Segel panas atau PVC pada straw dipotong
•Embrio dicuci dengan serial dilution dari campuran
krioprotektan dan di ratakan dalam cawan petri steril.
•Embrio sudah siap untuk diperiksa kualitasnya
menggunakan stereoscope.
•Pemeriksaan ketahanan embrio didasarkan pada:
1. Karakter morfologi sebelum dan sesudah
freezing/thawing
2. Ketahanan embrio setelah thawing
3. Presentasi kehidupan pada media
4. Perlakuan dan waktu interaksi (2) dan (3)
 Tinjauan
Fisiologi Semen Pustaka
Lanjutan…

(Morel, 1999).
34
gustari2012 35
 Kemasan :
- straw  0,25 ml; 0,5 ml
- ampul  0,5 ml & 1 ml
- pellets  0,1 – 0,2 ml
Thawing
- pellets  media cair 40 °C
- ampul  air es selama 8 menit °C
- straw  mulai dari air es sampai T : 65 °C, paling
optimal T : 37 °C
• Evaluasi post thawing
 PTM : > 40%

36
Pemrosesan semen
koleksi semen

Simpan pada T : 30 °C
 
Tambahkan extender sebagian untuk evaluasi

simpan pada T : 30 °C
30 menit

1 jam
T : 30 °C     T : 5 °C

+ gliserol 5% - 10%
bertahap/one step
 
pellets straw/ampul

T : -15 °C

T : -150 °C

T : -196 °C

37
38
• Quickly
• Warm water
– 10-30 seconds
• Ice water
– Few minutes

gustari2012 39
40
41
Gambar . Contoh rekording penggunaan semen beku.

42
43