Teknik Evaluasi Bioaktifitas

Kelompok 8
Desy Handayani
Ella Irmayeni
Fitra Annisa
Maria Rossi
Mentari
Nia Mailani

Dosen pengampu :
Novia Sinata, M.Si, Apt.
 Pendahuluan

Uji sitotoksik dapat dilakukan dengan dua metode :

1. Metode MTT

Metode MTT menggunakan garam kuning tetrazolium,

seperti MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetra
zolium Bromide]. MTT akan direduksi oleh mitokondria pada sel
yang hidup menjadi senyawa formazan berwarna ungu dan tidak
larut dalam air oleh sistem suksinate tetrazolium reduktase.
Absorbansi larutan berwarna ini kemudian dapat diukur
menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang antara 500
dan 600 nm (Meiyanto, 1999)
 Pendahuluan
2. Metode Perhitungan Langsung

Uji sitotoksik dilakukan secara manual dengan

menghitung jumlah sel hidup dibandingkan dengan kontrol.
Perhitungan sel hidup secara manual dilakukan dengan
pengecatan menggunakan biru tripan. Sel yang mati akan
menyerap warna biru tripan sedangkan sel yang hidup tidak,
hal ini disebabkan sel yang mati mengalami kerusakan pada
membran selnya, sehingga protein dalam sel keluar dan
berikatan dengan biru tripan. Perhitungan jumlah sel yang
hidup dilakukan langsung pada hemocytometer. Perhitungan sel
hidup dengan pewarnaan biru tripan ini juga sulit dilakukan
karena sukar membedakan sel hidup dengan sel mati. Hal ini
kemungkinan disebabkan pemaparan sel dengan biru tripan
yang terlalu lama sehingga sel hidup juga akan mulai menyerap
warna biru tripan.
 Pendahuluan
Jenis Obat Antikanker
1. Zat Pengalkilasi (Alkylating Agents)
- Obat kemoterapi jenis ini memiliki mekanisme kerja
menambahkan gugus alkil berupa kation atau anion.Zat
pengalkilasi akan menambahkan gugus alkil kepada DNA sel
kanker
- hal ini akan menyebabkan penghambatan pertumbuhan sel,
inisiasi kematian sel atau apoptosis.
Namun efek samping zat pengalkilasi adalah dapat menyebabkan
mutasi, termasuk mutasi karsinogenik, hal ini menjelaskan tingginya
kejadian kanker bila terekspos zat ini tanpa pelindung.
Cth: Siklofosfamid, Klorambusil, Prokarbazin, Karboplatin
 Pendahuluan
2. Antimetabolit
golongan obat yang menghambat pertumbuhan DNA dan RNA
dengan memblok pembentukan DNA dan RNA. Golongan obat
ini merusak sel-sel selama fase S siklus sel. Pada umumnya
golongan obat ini digunakan untuk pengobatan leukemia,
kanker payudara, ovarium, dan saluran usus, serta jenis
kanker lainnya .
Cth. 5-fluorouracil (5-FU), Cladribine

3. Antibiotik anti-tumor
Anthracyclines
Adalah antibiotik anti-tumor yang mengganggu enzymes
involved dalam replikasi DNA. Obat ini bekerja di semua fase
siklus sel. Golongan obat ini juga digunakan secara luas untuk
berbagai kanker
Cth. Daunorubicin, Epirubicin
 Pendahuluan

4. Penghambat Topoisomerase (Topoisomerase Inhibitors)

Golongan obat ini dapat mengganggu enzim yang disebut
topoisomerase, enzim yang membantu pemisahan rantai DNA
sehingga dapat terbentuk 2 rantai DNA baru yang sama.
Cth. Penghambat Topoisomerase I, meliputi: Topotecan dan
Irinotecan (CPT – 11).
Cth. Penghambat Topoisomerase II, meliputi: Etoposid (VP – 16)
dan Teniposide.

5. Penghambat Mitosis (Mitotic Inhibitors)

dapat menghentikan mitosis atau menghambat enzim untuk
membentuk protein yang dibutuhkan dalam reproduksi sel.
Cth. Paclitaxel (Taxol ®) dan Docetaxel (Taxotere ®)
UJI SITOTOKSIK DAN ANTIPROLIFERASI EKSTRAK ETER DAUN
BINAHONG (Andredera cordifolia (Tenore) Steen.)
TERHADAP SEL HeLa
 Latar Belakang

Daun Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) merupakan tanaman yang

secara tradisional banyak digunakan oleh masyarakat indonesia.

Kandungan fitokima Terpenoid, steroid, glkosida, flavonoid,

saponin dan alkaloid (Leliqia, 2017).

Elsyana (2016) mengatakan bahwa senyawa-senyawa golongan

flavonoid dari tanaman dilaporkan memiliki aktivitas
menghambat pertumbuhan sel kanker.

Szliszka (2008) mengatakan bahwa flavonoid flavon, apigenin

dan genistein memiliki sifat sitotoksik terhadap sel HeLa
 Latar Belakang

Kanker Serviks merupakan kanker terbesar

kedua pada wanita. Studi epidemiologi menunjukkan
bahwa virus HPV (Human Papiloma Virus), sangat erat
hubungannya dengan kejadian kanker serviks, terlepas
dari faktor lainnya. HPV 16 merupakan HPV yang
paling umum ditemukan pada wanita dengan kanker
serviks (Bosch, 1995)

Kandungan Flavoinoid pada Binahong

berpotensi dapat menghambat pembentukan kanker
serviks. Oleh karena itu, peneliti tertarik melakukan
penelitian untuk mengetahui potensi ekstrak eter
daun binahong sebagai sitotoksi dan antiproliferasi
pada sel HeLa.
 Alat dan Bahan
Alat

Peralatan gelas Alat Soxhlet cawan porselin

ELISA
elektrik stirer Oven Sentrifus
reader

vacum
microplate
corong pisah rotarry Inkubator
96 sumuran
evaporator

corong tissue culture haemocytomet

waterbath
Buchner flask er
 Alat dan Bahan
Bahan

Sel HeLa HEPES Tripan blue

Media
penumbuh sel Serbuk PBS larutan DMSO
RPMI

Penisillin-
Streptomisin NaHCO3 Aquabides
1%

Fungison Trypsin-EDTA Reagen stopper

0,25% dalam MTT (natriumdodesil
0,5% PBS sulfat 10%)
 Preparasi Sampel
Metode

Tujuan : untuk mendapatkan sampel yang siap untuk di ekstraksi

Daun Pengeringian Simplisia kering

Diperoleh
binahong serbuk yang diperoleh
ukuran serbuk
segar di sortasi menggunakan dihaluskan dan
yang seragam
basah oven diayak
 Ekstraksi
Metode

Tujuan : untuk mendapatkan ekstrak eter dari Binahong

Sebanyak 400 gram serbuk daun Binahong diekstraksi dengan alat

Soxhlet menggunakan pelarut petroleum eter, setelah dilakukan
Soxhletasi hingga jernih kemudian ampas dikumpulkan.

Sebanyak 200 gram serbuk daun Binahong dimaserasi menggunakan

400 ml pelarut eter, distirer selama 3 jam kemudian didiamkan
selama 24 jam

Sari eter disaring menggunakan corong Buchner hingga pelarut

berwarna jernih

Diuapkan menggunakan vacum rotarry evaporator. Kemudian

diuapkan lagi di atas waterbath dengan cawan porselin, penguapan
dilakukan hingga diperoleh ekstrakkental
 Penyiapan kultur sel HeLa
Metode

Pembuatan Media RPMI

Media dibuat dengan melarutkan 10,4 gram (untuk 1

Liter) RPMI ditambah 2,0 g NaHCO3 dan 2,0 g HEPES. Larutan
selanjutnya distirer hingga homogen, kemudian di buffer dengan
HCl1sehingga pHnya 7,2-7,4 menggunakan pH meter. Kemudian
larutan tersebut disaring dengan filter polietilen sulfon steril 0,2 μm
secara aseptis.
 Penyiapan kultur sel HeLa
Metode

Pembuatan PBS (Phosphat Buffered Saline)

Serbuk PBS (Phosphat Buffered Saline) 10 gram dilarutkan ke

dalam aquabidestilata sebanyak 800 ml, diaduk dengan stirer hingga
larut sempurna. Larutan dibuat dalam pH 7,2 kemudian ditambah aqua
bidestilata hingga 1 liter. Larutan disimpan dalam lemari es dengan botol
tertutup.
 Penyiapan kultur sel HeLa
Metode

Preparasi Sel HeLa

Sel HeLa diambil dari tangki nitrogen cair dan segera

dicairkan pada suhu 37oC, kemudian ampul disemprot dengan
etanol 70%, ampul dibuka dan sel dipindahkan dalam tabung
sentrifuge dalam ruangan laminar air flow dan disentrifugasi
dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Endapan yang
terbentuk ditambah dengan media RPMI 1640-serum. Suspensi
sel dimasukan dalam tissue culture flask kecil dan dilihat dibawah
mikroskop. Sel yang hidup nampak bulat, jernih dan bersinar.
Flask yang berisi sel kemudian diinkubasi dalam inkubator suhu
37oC dan dialiri dengan gas CO2.
 Penyiapan kultur sel HeLa
Metode

Pembuatan larutan uji

Larutan stok dibuat dengan cara menambahkan 25 mg

ekstrak eter daun Binahong ke dalam 1000μl RPMI 1640 dan Pen-
Strep, sehingga konsentrasi larutan uji menjadi 25.000 μg/mL. Dari
konsentrasi tersebut kemudian dibuat seri kadar 250; 125; 62,5;
31,25; 15,625; 7,8125 μg/ml, larutan dalam berbagai kadar
tersebut dapat diujikan pada subjek uji. Pembuatan larutan uji ini
dilakukan dalam Laminar Air flow Cabinet secara aseptis.
 Uji Sitotoksikdengan metode MTT
Metode
Sel didistribusikan ke dalam 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam dengan tujuan sel
menempel pada dinding dasar sumuran, pada masing-masing sumuran ditambahkan seri
konsentrasi ekstrak eter daun Binahong, kontrol sel, dan kontrol media, kemudian diinkubasi
lagi selama 24 jam.

Larutan uji kemudian dibuang, kemudian sumuran dibilas dengan larutan PBS sebanyak
100 μl tiap sumuran sebanyak 3 kali. Setelah sumuran bersih kemudian ditambahkan 10 μl
MTT 5mg/ml. Hasil tersebut kemudian diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel
yang hidup akan memetabolisme MTT membentuk formazan yang berwarna ungu.

Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10% dalam 0,01% HCl sebanyak 100
μl, lalu diinkubasi semalam pada suhu kamar dengan ditutup dengan aluminium foil pada
tempat gelap selama 24 jam. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang
550 nm. Dihitung terhadap jumlah sel hidup dengan metode MTT.
 Uji Sitotoksisitas
Hasil

Parameter yang digunakan dalam uji sitotoksik ini adalah IC50 (inhibitory
concentration 50 %).

Penggunaan DMSO (Dimetil Sulfoksida) sebagai pelarut karena bersifat semipolar

dan ekstrak eter daun binahong tidak larut dalam air.

Uji sitotoksik dilakukan dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-

2,5-difenil tetrazoliumbromida). Dengan mekanisme pembentukan kristal formazan
yang berkorelasi dengan jumlah sel yang hidup.

MTT akan pecah menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium yang dimiliki
oleh rantai pernafasan mitokondria yang hanya aktif terhadap sel hidup. Kompleks warna
formazan tidak larut dalam air dan berwarna ungu.
 Uji Sitotoksisitas
Hasil

Untuk menghentikan reaksi diberikan reagen stopper SDS (sodium

duodecyl sulphate) 10% dalam HCl 0,01N.

Intensitas warna ungu ditetapkan secara spektofotometri dengan

ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm (Sladowski, 1993).

Intensitas warna ungu yang terbentuk sebanding dengan jumlah sel

hidup, sehingga jika intensitas warna ungu makin tinggi maka jumlah
sel hidup semakin banyak.
 Uji Sitotoksisitas
Hasil

Berdarkan grafik hubungan konsentrasi dengan persen kehidupan, dapat dilihat

bahwa semakin besar kadar senyawa uji yang diberikan pada suspensi sel, semakin
kecil pula persentase kehidupan yang dihasilkan.
 Uji Sitotoksisitas
Hasil

Nilai IC50 ekstrak eter daun Binahong terhadap sel HeLa diperoleh dengan memasukkan nilai probit 5 ke dalam
persamaan y = -1,006x + 6,944 sehingga diperoleh harga IC50 sebesar 85,506 μg/ml. Semakin kecil nilai IC50 makin
poten senyawa uji tersebut. Suatu ekstrak dikatakan poten bila nilai IC50-nya ≤ 100μl/ml (Meiyanto, 2008).
 Uji Sitotoksisitas
Hasil
Dari hasil pengamatan morfologi sel HeLa yang diberi perlakuan ekstrak eter daun
Binahong kadar 125 μg/mL menunjukkan adanya fenomena kematian sel, ditunjukkkan dari sel
yang mati akan berbentuk bulat tidak utuh dan warnanya tidak terang (panah merah)
sedangkan sel yang hidup akan berbentuk bulat berwarna terang atau bersinar dan membran
sel tetap utuh (panah hitam).
 Kesimpulan

Ekstrak eter daun Binahong

memiliki aktivitas sitotoksik
dengan nilai IC50 85,52 μg/mL
terhadap sel HeLa sehingga
berpotensi sebagai antikanker
serviks.
Evaluasi Sitotoksik dari Nanopartikel MgO
dan Efeknya dalam menekan Gen ROS
PENDAHULUAN
• Kemajuan dalam nanoteknologi telah mengarah pada
pengembangan bidang baru nanomedicine, yang melibatkan
penerapan nanomaterial untuk tujuan diagnostik dan
terapeutik

•Kurangnya informasi mengenai kesehatan dan implikasi lingkungan produksi

nanopartikel menunjukkan pada studi terbaru in vivo dan in vitro penggunaan
inhalasi dan dermal beberapa nanomaterial memiliki efek yang merugikan
bagi kesehatan sehingga penggunaannya harus dipertimbangkan. Efek
merugikan tersebut dapat merujuk pada terbentuknya sel-sel kanker dari
penggunaan nanopartikel ini

•Salah satu contoh nanopartikel adalah MgO. MgO memiliki potensi tinggi
sebagai agen peningkatan kontras untuk prosedur MRI dalam membantu
memberikan gambar anatomi yang sangat baik. MgO sangat menarik karena
harganya yang cukup murah dan ramah lingkungan. Toksisitas MgO telah
ditemukan lebih rendah daripada nanopartikel oksida logam lainnya
PENDAHULUAN
•Nanopartikel tersebut tidak dapat larut dalam air dan tidak cukup stabil
dalam kondisi fisiologis. Sehingga dalam penelitian ini digunakan ligand
fosfolipid polyehtyleneglycol (PEG) yang biokompatibel karena terdapat
bagian ekor yang hidrofilik dan bagian kepala yang hidrofobik

•Dalam penelitian ini dipilih glutathione S-transferase dan katalase, yang

merupakan gen stres oksidatif paling umum yang dilaporkan dalam garis sel
manusia untuk mengevaluasi sitotoksisitas melalui ekspresi gen ROS oleh
nanopartikel oksida logam rekayasa (MgO), mempertimbangkan hasil
viabilitas sel dari penelitian sebelumnya

•Sel-sel epitel sel kanker hati dipilih sebagai model in vitro karena agen kontras
MRI memiliki efek havecytotoxic pada garis sel di vivo

METODE
analisis ekspresi gen stres oksidatif yakni
menggunakan RT-PCR berbasis probe
dan molekul beacon (MB) teknologi
dalam sel hidup.
RT-PCR : Real Time PCR (Polymerase Chain
Reaction)
MB (Molecular beacon) teknologi
: berpasangan
Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi
fluoresensi yang diproduksi oleh molekul
reporter yang meningkat sejalan dengan
berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi
karena akumulasi produk PCR pada tiap siklus
amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi
meliputi pewarna yang berikatan pada double-
stranded DNA
Molecular beacon adalah oligonukleotida
berbentuk tangkai melingkar yang dilabel dengan
fluorophore dan quencher. Saat tidak ada gen
target, tangkai akan menyatukan fluorophore
dan quencher sehingga menghambat produksi
sinyal fluoresensi. Saat probe molecular beacon
berhibridisasi dengan sekuens gen target spesifik,
tangkainya akan terpisah sehingga sinyal fluoresensi
dapat dihasilkan oleh fluorophore. Ikatan antara
molecular beacon dan sekuens gen target bersifat
sangat spesifik, dan hanya sekuens yang
sempurna dapat berhibridisasi
dengan molecular beacon. Molecular beacon
dapat digunakan untuk mengukur kuantitas m-RNA.
Molecular beacon dapat mendeteksi perubahan ini
dan intensitas fluoresensinya akan berubah sesuai
peningkatan atau penurunan ekspresi gen
CARA KERJA

1. Preparasi nanopartikel MgO dan kultur sel

2. Analisis RT-PCR TaqMan

3. Kurva Kalibrasi Standar RT-PCR

4. Analisis kuantitatif pada Agarose Gel

5. Uji Genotoksisitas Seluler Menggunakan Teknologi MB

Cara kerja
1. Preparasi nanopartikel MgO dan kultur sel
Nanopartikel didispersikan dalam kloroform dan dienkapsulasi
menggunakan cangkang phospholipid PEG agar nanopartikel bersifat
biokompatibilitas (dapat diterima oleh sel hidup dan tidak memicu respon
imun). Kemudian 2 ml nanopartikel oksida organik terdispersi dalam CHCl3
(5 mg / mL) dicampur dengan 1 mL CHCl3 yang mengandung 10 mg
distearoyl1,2 - sn-glycero-3 phosphoethanolamine-N- [methoxy
(polyethylene glycol). Lalu pelarut diuapkan dan diinkubasi pada suhu 75
°C dalam vakum selama 50 mnt. Selanjutnya ditambahkan 4 ml air lalu
menghasilkan suspensi berwarna coklat kehitaman. Kemudian Setelah
filtrasi dan sentrifugasi, nanopartikel yang dihasilkan kemudian didispersikan
dalam salin buffer fosfat (PBS, pH 7,2). Cell lines berasal dari karsinoma
hepatoseluler manusia - sel HepG2 (ATCC HB-8065) . jenis sel antara 15 dan
25 dari bagian subkultur digunakan sebagai sel yang dapat dimodifikasi
sesuai keinginan. jenis sel di ujikan dengan 25, 75 dan 150 μg / mL
konsentrasi MgO nanopartikel dalam medium kultur bebas serum dan
diinkubasi selama 24, 48 dan 72 jam.
1. Preparasi nanopartikel MgO dan
kultur sel
Cell lines ditumbuhkan dan dijaga dalam medium
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ditambahkan
dengan 10% serum janin sapi (FBS) dan 1% penicillin (10.000 IU / mL)
- streptomisin (10.000 µg / mL). Lalu Sel dicuci dengan PBS (Phosfat
Buffer Saline) dan diinkubasi dalam 3 mL asam trypsin-
ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 0,2%) selama 3-5 menit pada 37
° C dalam inkubator CO2. Suspensi sel kemudian disentrifugasi
selama 3 menit pada 1300 rpm. Kemudian pellet itu disuspensikan
kembali dengan medium segar dan densitas benih kultur sel
disesuaikan menggunakan hemositometer dan penghitungan sel
dengan mikroskop terbalik. Untuk kuantisasi RT-PCR dari ROS, sel-sel
dikultur dalam 24 mikro-well plate (1 × 105 sel / mL).
 2. Analisis RT-PCR TaqMan
Sel-sel yang diberi perlakuan terhadap nanopartikel MgO
digunakan untuk isolasi RNA total menggunakan Qiagen RNeasy mini kit.
RNA total yang terisolasi dikumpulkan dalam 20 µL Rnase bebas air dan
dikuantifikasi dengan spektrofotometer nanodrop. Selanjutnya dilakukan
analisis RT-PCR menggunakan reaksi dua langkah yang terdiri dari sintesis
DNA komplementer (cDNA) dengan reaksi transkripsi terbalik dan
kemudian analisis RT-PCR untuk ekspresi gen kuantitatif . cDNA disintesis
dengan menambahkan 1 µg RNA total ke tabung premiks reverse
transkriptase (AccuPower ™ Cyclescript RT premix dT20, Pelopor, Daejeon,
Korea) dengan volume reaksi yang dibuat hingga 20 µL dengan Rnase
bebas air. Tabung ditempatkan dalam termocycle dan diinkubasi pada 45
° C selama 50 menit untuk sintesis cDNA dan diikuti oleh 90 ° C selama 5
menit untuk inaktivasi reverse transkriptase . cDNA yang disintesis
digunakan sebagai pola dalam analisis waktu yang sebenarnya (nyata).
Gen ini selanjutnya digunakan untuk analisis RT-PCR.
 2. Analisis RT-PCR TaqMan
Probe TaqMan dikonjugasi dengan fluorophore, 5-
carboxyfluorescein (FAM) pada ujung 5 'dan black hole quencher
(BHQ1) pada akhir 3'. Campuran reaksi 20 μL terdiri dari 1 μL template
cDNA, 0,25 μL probe TaqMan (20 μM), 0,5 μL dari di homogenkan (10
μM), 10 μL Mastermix (Dynamo ™ probe qPCR kit, Finnzymes,
Finlandia) dan 7,75 μL RNase bebas air. RT-PCR dilakukan dalam
thermocycler qPCR (Bio-RAD, Hercules, CA, USA, CFX96TM sistem
real-time) dengan inisiasi pada 90 ° C selama 15 menit diikuti oleh 40
siklus amplifikasi pada 90 ° C selama 15 detik (denaturasi ) dan 50 ° C
selama 50 detik (anil dan elongasi). Sampel dianalisis dengan
panjang gelombang eksitasi / emisi pada 488/530 nm sehubungan
dengan fluorophore FAM, dan hubungan dari nomor salinan cDNA
yang diperkuat versus nilai siklusnya (Ct) diplot dalam grafik.
 3. Kurva Kalibrasi Standar RT-PCR
Kurva kalibrasi standar untuk analisis waktu nyata diperoleh
dengan menggunakan RNA total yang diisolasi dari sel HepG2. cell
lines HepG2 diuji dengan konsentrasi 1 mM hidrogen peroksida dan
diinkubasi selama 7 jam. Kemudian isolasi RNA total dan reaksi reverse
transkiptase dilakukan seperti yang dijelaskan di atas. Primer khusus
untuk GST (primer forward dan primer terbalik) dan katalase (primer
forward dan primer terbalik digunakan untuk mendapatkan produk
besar (923 bp untuk GST dan 2115 bp untuk katalase) yang mendekati
seluruh ukuran gen (1155 bp untuk GST dan 2300 bp untuk katalase)
untuk meniru gen GST dan katalase yang sebenarnya. Pita-pita yang
dihasilkan dengan ukuran 923 dan 2115 bp ini dielusi dari gel dan
dikuantifikasi menggunakan spektrofotometer nanodrop untuk
menentukan jumlah salinan persis dari template. Template dilarutkan
secara berurutan dari 109 menjadi dan digunakan untuk reaksi RT-PCR
untuk memperoleh kurva kalibrasi.
 4. Analisis kuantitatif pada Agarose
Gel
Tingkat ekspresi GST dan gen katalase pada gel agarosa dikonfirmasi oleh PCR.
PCR dilakukan dalam volume reaksi 20 μL, yang terdiri dari 2 μL template (cDNA
dari sel MCF7), 1 μL dari primer forward dan reverse (10 μM), 0,3 μL enzim (i-
StarMAX ™ II DNA polimerase (5 U / mL), Intron Biotech., Sungnam, Korea), 2 μL
dNTP (2,5 mM masing-masing), 2 μL buffer reaksi 10 × (300 mM Tris-HCl, 300 mM
garam yang terdiri dari K+, NH4+ dan 20 mM Mg2+ ), dan 11,7 μL air RNase. PCR
kemudian dilakukan dalam termocycler pada 90°C selama 2 menit, diikuti oleh 30
siklus amplifikasi pada 95°C selama 60 detik, 55°C untuk 30 detik dan 70°C selama
5 menit. Produk tersebut kemudian dipisahkan dalam elektroforesis gel agarose
1,5% dengan 1 × TBE buffer (87 mM Tris, 90 mM asam borat, dan 2 μM EDTA) pada
100 V selama 60 menit. Gel diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan disinari
di bawah UV untuk mendeteksi pita gen yang diekspresikan. Gen housekeeping
200 bp, gliseraldehida dehidrogenase 3-fosfat (GAPDH) (primer forward dan primer
reverse) digunakan sebagai kontrol.
 5. Uji Genotoksisitas Seluler
Menggunakan Teknologi MB
MB (untuk ekspresi gen GST dirancang sebagai 5'-CGCGATCACGAAGGATA
GTGGGTAGCTAGGCGATCGCG-3 'dengan 25 bp loop (italic) dan 7 bp urutan batang.
Sebuah fluorophore FAM dan quencher BHQ1 diberi label pada ujung 5 'dan 3', masing-
masing (Bioneer, Korea). Garis sel dikultur dalam piring mikro-mikro 96 pada konsentrasi 5 × 104
sel / mL. Setelah 24 jam inkubasi, sel-sel diuji dengan berbagai konsentrasi nanopartikel MgO
dan waktu inkubasi yang berbeda seperti yang dijelaskan sebelumnya. MB dikirim ke sel hidup
dengan metode permeabilisasi terbalik dengan mengaktifkan Streptolysin O (SLO). Pertama,
SLO diaktifkan dengan menambahkan 5 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ke 2 U / mL SLO
selama 30 menit pada 37 ° C. Kemudian, sel-sel diinkubasi selama 10 menit dalam 200 μL
medium bebas serum yang mengandung 0,2 U / mL SLO aktif dan 3 μL MB (1 μM) untuk
permeabilisasi sel dan pengiriman MB. Setelah inkubasi dengan MB, sel-sel itu disegel kembali
dengan menambahkan 0,5 mL media pertumbuhan khas dan diinkubasi selama 1 jam pada
37°C sebelum melakukan analisis mikroskopik dan mikroskopi confocal. Pencitraan fluoresensi
hijau sel hidup dilakukan oleh mikroskop confocal pemindaian laser (Nikon ECLIPSE C1si,
Melville, NY, USA). Pelat kultur dibaca di bawah spektrofluorometer lempeng (Spectra Max M2,
Perangkat Molecular, Silicon Valley, CA, USA). Sinyal fluoresensi MB yang di hibridisasi dengan
gen target GST dianalisis dengan eksitasi pada 488 nm dan deteksi emisi pada 530 nm.
 HASIL

1. Sintesis Nanopartikel MgO Biokompatibel

Monodispersi, nanopartikel MgO yang dapat terdispersi dalam air berdiameter

20 nm, seragam dalam ukuran dan disintesis oleh dekomposisi termal
kompleks logam-oleat. Nanopartikel yang dihasilkan distabilkan
menggunakan ekor hidrofobik dari surfaktan (asam oleat dan oleylamine) dan
disperseda dalam pelarut organik nonpolar seperti kloroform. Kemudian,
nanopartikel dienkapsulasi oleh shell PEG-fosfolipid untuk meningkatkan
biokompatibilitas.
 HASIL
2. Kuantitas Real-Time Gen GST dan Katalase
Gambar 1.
Genotoksisitas nanopartikel MgO pada
ekspresi GST dalam sel HepG2. (a) profil
RT-PCR dengan cDNA yang diencerkan
secara seri sebagai template (● 1.0 × 109, ○
1.0 × 108, ▼ 1.0 × 107, 1.0 × 106, ■ 1.0 ×
105, □ 1.0 × 104, ♦ blank) dan kurva kalibrasi
salinan cDNA △ number sehubungan
dengan nilai-nilai yang berhubungan (inset).
Profil RT-PCR yang diperbesar bergantung
pada waktu inkubasi nanopartikel MgO dari
(b) 24 jam, (c) 48 jam dan (d) 72 jam, dan
konsentrasi MgO (merah: kontrol, hijau: 25
µg / mL, biru: 75 µg / mL, merah muda: 150
µg / mL).
HASIL

Genotoksisitas nanopartikel MgO pada

ekspresi katalase dalam sel HepG2. (A) profil
RT-PCR dengan cDNA yang diencerkan
secara seri sebagai template ● (1,0 × 109, ○
1,0 × 108, ▼ 1,0 × 107, 1,0 × 106, ■ 1,0 ×
105, □ 1,0 × 104, ♦ kosong) dan kalibrasi
kurva nomor cDNA copy with sehubungan
dengan nilai-nilai yang sesuai (Inset). Profil
RT-PCR tergantung pada waktu inkubasi
nanopartikel MgO (b) 24 jam, c () 48 jam dan
(d) 72 jam, dan konsentrasi MgO (merah:
kontrol, hijau: 25 L, µg / mblue: 75 µg / mL,
merah muda: 150 µg / mL).
 Table 1. The expressed gene with variationin MgO
GST number concentration and
incubation time.

cDNA Copy
Number

MgO Conc. (μg)

24 h 48 h 72 h

0 8.40 × 102 9.57 × 102 2.88 × 103

25 1.15 × 103 4.60 × 103 4.10 × 103

75 2.34 × 103 7.83 × 103 5.37 × 103

150 catalase gene3.90

Table 2. The expressed × 103 with variationin
number 8.40 × 103 MgO 5.90 × 103

concentration and incubation time.

cDNA Copy Number

MgO Conc. (μg)
24 h 48 h 72 h

0 0.23 × 105 0.62 × 105 0.68 × 105

25 0.57 × 105 1.63 × 105 1.32 × 105

75 1.11 × 105 3.207 × 105 1.61 × 105

150 1.63 × 105 5.26 × 105 3.25 × 105

 3. Analisis kuantitatif GST dan Katalase
pada Agarose Gel
cDNA yang disintesis dari sampel sel
MCF7 setelah perawatan MgO diamplifikasi oleh PCR
untuk ekspresi GST dan katalase dengan 30 siklus
termal. Gambar 3 menunjukkan pita produk yang
diperkuat dari GST dan gen katalase di sepanjang
gen housekeeping GAPDH. Peningkatan konsentrasi
dari 25 hingga 150 µg / mL MgO nanopartikel
menunjukkan peningkatan yang progresif dalam Gambar 3. ekspresi gen GST dan Katalase HepG2
intensitas pita pada gel agarosa. Intensitas band pada agarose gel. Ekspresi GST dan pita katalase
tertinggi dinyatakan dalam sampel yang diperlakukan sampel sel HepG2 pada 30 siklus amplifikasi cDNA
dengan 150 µg / mL MgO nanopartikel pada waktu .Ekspresi gen GST (130 bp) dan katalase (105 bp)
menunjukkan variasi dalam intensitas pita
inkubasi tetap. intensitas pita tertinggi diamati pada sehubungan dengan konsentrasi MgO dan waktu
inkubasi 48 jam, sedangkan pita intensitas terendah inkubasi. The house keeping gene (GAPDH) untuk
dan sedang diamati pada 24 dan 72 jam, masing- produk 200 bp juga digunakan sebagai kontrol
referensi.
masing, baik untuk GST dan katalase. Hasil ini
konsisten dengan data RT-PCR.
4. Ekspresi GST dalam Sel Hidup
Berdasarkan Teknologi Molecular Beacon
Gambar 4. Gambar mikroskopis confocal
ekspresi gen GST di HepG2 diobati dengan
nanopartikel MgO. Molecular beacons yang
menargetkan gen GST dikirim ke sel hidup
dengan metode permeabilisasi terbalik
menggunakan SLO yang diaktifkan. Citra sel
hidup neon pada 24 jam (panel atas), 48 jam
tengah (panel) dan 72 jam bagian bawah (panel)
disajikan dengan eksitasi pada 488 nm dan
deteksi emisi pada 530 nm. Intensitas sinyal
fluorescent dimaksimalkan pada 48 jam inkubasi
timenproportion ke konsentrasi MgO (skala
ukuran bar: 10 µm). Intensitas sinyal fluoresen
ditemukan menjadi lemah karena ekspresi gen
target yang rendah.
 Gambar 5. Analisis ekspresi gen gen GST
dari setiap baris sel dengan penentuan
intensity
Relative fluorescence

fluorometrik. Hasil fluorometri

menunjukkan bahwa ekspresi gen dari cell
lines (HepG2), yang bergantung pada
konsentrasi MgO dan waktu inkubasi.
Molecular beacons yang menargetkan gen
GST dikirim ke sel hidup dengan metode
permeabilisasi terbalik menggunakan
pengaktifan SLO. Gen GST dinyatakan
maksimum pada 48 jam waktu inkubasi
dengan proporsi konsentrasi MgO.
Incubation time (h)
 kesimpulan

Evaluasi sitotoksisitas nanopartikel MgO berlapis PEG-fosfolipid pada cell lines kanker
manusia (HepG2) dengan konsentrasi dan waktu inkubasi yang berbeda. Menargetkan
dua gen stres oksidatif (GST dan katalase), peneliti melakukan analisis kuantitatif ekspresi
gen pada tingkat mRNA dengan menggunakan RT-PCR dan pada tingkat sel dengan
menggunakan teknologi MB. Hasil ini konsisten pada inkubasi 48 jam, mengungkapkan
ekspresi gen maksimum sebanding dengan konsentrasi MgO, sedangkan pada 72 jam,
ekspresi gen berkurang dua kali jumlah dari kontrol. Selain itu, rasio kenaikan GST yang
diekspresikan dan jumlah gen katalase dibandingkan dengan kontrol tidak signifikan,
menunjukkan stabilitas tinggi, biokompatibilitas, dan toksisitas rendah, menunjukkan
bahwa nanopartikel MgO direkayasa sebagai agen kontras yang sangat baik untuk
resonansi magnetik di bidang biomedis. Untuk studi sitotoksisitas lebih lanjut, berbagai sel
primer dan tes in vivo juga harus dilakukan untuk mengeksplorasi hubungan linear
antara ekspresi gen dan tingkat protein dalam sel.