Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa

juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-
an dan awal tahun 1970-an.
HPLC adalah intrumen kromatografi yang mana fasa
geraknya adalah cairan.
Kegunaan umum HPLC:
analisis asam nukleat
analisis protein
analisis karbohidrat
analisis senyawa-senyawa kiral
analisis senyawa-senyawa yg tidak mudah menguap
penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun
zwiter ion
Isolasi dan pemurnian senyawa, dll.
Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa
solut melewati kolom menuju detektor, sebaliknya dalam
HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-
komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat
berinteraksi dengan solut-solut.
Gaya yang mendukung aliran fasa gerak pada HPLC adalah
pompa bertekanan tinggi, sedangkan pada GC berasal dari
tekanan gas yang dimampatkan.
Perbedaan pada peralatan penyuntikan.
Injektor, kolom dan detektor pada HPLC tidak harus
dipanaskan seperti pada GC, walaupun terkadang pada HPLC
digunakan pemanasan pada kolom jika diperlukan.
Kelebihan HPLC dibandingkan GC:
keampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak
menguap dan labil pada suhu tinggi.
dapat menganalisis cuplikan yang mempunyai berat
molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi, seperti
polimer.
Instrumen HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan
komponen pokok yaitu:
Wadah fasa gerak
Sistem penghantaran fasa gerak
Alat untuk memasukkan sampel
Kolom
Detektor
Wadah penampung buangan fase gerak
Tabung penghubung
Suatu komputer atau integrator atau perekam.
BAGAN SISTEM HPLC
 Separation in based upon differential
Injector
migration between the stationary and
mobile phases.
Mixer Stationary Phase - the phase which
remains fixed in the column, e.g. C18,
Silica

Pumps Mobile Phase - carries the sample

through the stationary phase as it
moves through the column.
Column

Detector

Waste
Solvents

High Performance Liquid Chromatograph

9
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

High Performance Liquid Chromatograph

10
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

11
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

12
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

13
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

14
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

15
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

16
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

17
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

18
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

19
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

20
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

21
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

22
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

23
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

24
 Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

25
to - elution time of unretained peak
tR- retention time - determines sample identity
tR

tR
mAU Area or height is proportional
to the quantity of analyte.

to

Injection time

26
Mobile Phases

Flow Rate
Composition

Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant
27
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui
kolom ke detektor.
Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan
cara penyuntikan.
Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran.
Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut
terhadap fasa diam, solut-solut yang kurang interaksinya
dengan fasa diam akan keluar terlebih dahulu dan
sebaliknya.
Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi
oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram.
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium
dapat digunakan sebagai wadah fasa gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fasa gerak
antara 1 sampai 2 l pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut
yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi.
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing
(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas
akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan
detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan
dengan fase terbalik (fasa diam lebih non polar dari pada fasa
geraknya) adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau
campuran air dengan asetonetril.
Untuk pemisahan dengan fase normal (fasa diam lebih polar dari
pada fasa geraknya), fase gerak yang sering digunakan adalah
campuran pelarut2 hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi
atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk
cuplikan yang akan dianalisis.
Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya
kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan
penyumbatan pada kolom.
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar,
dan tidak beracun.
Zat cair tidak kental
Sesuai dengan detektor, contoh un tuk detektor UV , pelarut
tidak boleh menyerap cahaya pada panjang gelombang yang
dipakai.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem pengahantar adalah
untuk menjamin proses penghantaran fasa gerak berlangsung
secara tepat, reprodusible, konstan, dan bebas dari
gangguan.
Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi
persyaratan:
Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi.
Keluaran bebas pulsa
Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
Bahan tahan korosi. Bahan yang umum dipakai untuk pompa
adalah gelas, baja tahan karat, teflon da bayu nilam.
 Pompa
Reciprocating

Pompa
Pompa
Displacement

Pompa
Pneumatic
Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut
masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup
saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong
masuk ke dalam kolom.
Untuk memasukkan cuplikan ke
dalam aliran fasa gerak (Kran
Cuplikan) perlu 2 langkah:
a. Sejumlah volume cuplikan
disuntikkan ke dalam loop
dalam posisi load, cuplikan
masih berada dalam loop.
b. Kran diputar untuk
mengubah posisi load
menjadi posisi injeksi dan
fasa gerak membawa
cuplikan ke dalam kolom.
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainstells.
Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponennya. Memiliki
panjang 5 sampai 30 cm dan diameter dalam berkisar antara
3-10 µm.
Kolom pengaman disebut juga prakolom, karena diletakkan
sebelum sistem pemasukan cuplikan, kolom ini berukuean
pendek 5 cm diameter 4,6 mm, dan biasanya dipaking
dengan silika berukuran lebih besar dari partikel kolom
utama.

Kolom
utama
Kolom
Kolom
pengaman
Sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yg
agak polar.
Partikel-partikel silica dan alumina biasanya digunakan
sebagai adsorben.
Fasa gerak yang digunakan biasanya berfisat non polar,
seperti heksana.
Untuk mengontrol retensi solut, biasanya ditambahkan
sedikit senyawa polar kepada fasa gerak misalnya
propanol atau air sebagai modifier.
Biasanya fasa gerak lebih polar dari pada fasa diam,
sehingga jenis kromatografi ini disebut juga
kromatografi fasa terbalik.
Kromatografi penukar ion merupakan teknik
pemisahan campuran ion-ion atau molekul-molekul
yang dapat diionkan.
Ion-ion bersaing dengan ion-ion fasa gerak untuk
memperebutkan tempat berikatan pada fasa diam.
Terdapat dua jenis penukar ion: anionik dan kationik.
Syarat:
Cukup sensitif.
Stabilitas dan keterulangan tinggi.
Respon linear terhadap solut.
Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung pada
kecepatan alir.
Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.
Tidak merusak cuplikan.