BAHAN2 KLONING GEN

 Enzim restriksi : Untuk memotong DNA

plasmid dan DNA yang mengandung gen
yang diinginkan
 Enzim ligase : menggabungkan molekul
DNA~ ikatan kovalen
 Vektor : plasmid atau bakteriofage
 Inang (Host)
 Metode untuk memasukkan DNA ke dalam
sel inang
ENZIM RESTRIKSI ENDONUKLEASE
 Few Restriction Enzymes
Target sequence
Enzyme Organism from which derived (cut at *)
5' -->3'
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T
Mbo I Moraxella bovis *G A T C
Pst I Providencia stuartii CTGCA*G
Sma I Serratia marcescens CCC*GGG
Taq I Thermophilus aquaticus T*CGA
Xma I Xanthamonas malvacearum C*CCGGG
PENYAMBUNGAN DNA
Enzim Ligase digunakan untuk
menyambung (pasting) DNA
 Gabungan yang dibentuk dengan
ujung lengket akan bertahan
sementara ~ hanya sedikit ikatan
hidrogen yang menyatukan
fragmen
 Pembentukan ikatan-H pada
ujung-ujung yang komplemen
(sticky ends)
 Ligase membentuk ikatan
fosfodiester untuk merekatkan
benang-benang DNA
Langkah-langkahnya..
1. Pengisolasian vektor dan DNA sumber gen
◦ Plasmid yang akan digunakan sebagai vektor Misalnya : Bakteri
E. coli yang membawa 2 gen yaitu
 ampR : resisten terhadap antibiotik ampisilin sel inang E.coli
 lacZ : mengkode β-galaktosidase, yang
menghidrolisis gula laktosa ~ pengenalan
restriksi
◦ DNA yang mengandung gen yang diinginkan Misalnya: DNA
yang diambil dari sel jaringan manusia (kultur laboratorium)

Daerah pengenalan Restriksi

2. Penyelipan DNA ke vektor
A. Pemotongan plasmid maupun
DNA manusia dengan enzim
restriksi yang sama. Aktifitas
enzim restriksi ini akan
memotong DNA plasmid pada
tempat restriksi tunggal dan
mengganggu gen lacZ serta
memotong DNA manusia,
menghasilkan ribuan fragmen.
B. Pencampuran fragmen DNA
manusia dengan plasmid yang
digunting.
C. Penggunaan enzim DNA ligase
untuk menggabungkan DNA
melalui ikatan kovalen.
3. Pemasukan vektor pengklon ke
dalam sel Inang ( Transformasi
) Gen lacZ-- yang
bermutasi
Sel bakteri mengambil plasmid
rekombinan melalui transformasi
(penyerapan DNA telanjang dari
larutan sekeliling)
Bakteri berupa lacZ – mutasi di dalam
gen lacZ membuatnya tidak dapat
menghidrolisis laktosa Sel E.coli
 4. Pengklonan sel-sel inang (dan gen asing)
1. Menempatkan bakteri hasil transformasi pada medium nutrient
padat yang mengandung ampisilin dan gula (X-gal)
2. Setiap bakteri yang bereproduksi akan membentuk klon sel yang
terlihat sebagai koloni pada medium
3. Melakukan identifikasi koloni:
 Ampisilin memastikan hanya sel yang mengandung plasmid yang
akan tumbuh, karena memiliki gen ampR (resistan terhadap
ampisilin)
 X-gal yang dihidrolisis oleh β-galaktosidase menghasilkan produk
ampR & gen
warna biru ampR & ≠ gen asing ≠ ampR
asing

Bakteri dengan plasmid rekombinan

akan membentuk koloni putih pada
medium
Koloni bakteri dengan plasmid rekombinan yang berhasil dikloning

lacZ lacZ insert

Enzim berfungsi Enzim tidak berfungsi

X-gal Produk X-gal Produk

(potong) (tdk potong)
Plasmid sebagai Vektor Kloning
 Pada umunya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom
bakteri berupa DNA sirkular atau DNA yang berbentuk lingkaran.
Disamping satu kromosom, berbagai jenis bakteri juga memiliki
DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil dari pada
DNA kromosomnya. DNA sirkuler selain kromosom yang
terdapat pada bakteri dinamakan plasmid.
 Plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah dari
kromosomnya. Plasmid dapat bereplikasi sendiri dan
mengandung berbagai gen.
 Plasmid mulai digunakan sebagai vektor tidak lama setelah David
Jackson, Robert Simon dan Paul Berg membuat molekul DNA
rekombinan (1972).
 Plasmid rekombinan pertama kali berhasil direplikasi adalah
pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert
Boyer (SC = Stanley Cohen)
 REKAYASA GENETIKA

Vektor kloning
Potong dengan
Sumber DNA enzim
Potong dengan enzim
Vektor DNA

Gabungkan: DNA
target dg vektor
DNA terkonstruksi

Masukkan ke
dalam sel

Protein hasil klon

Cloning Strategy
 PAGE DNA sequencer Agarose gel Elec.

Gel Documentation UV transilluminator Gene gun

 promoter
mcs
poly A
kan
RT-PCR PCR
Ligation
ori
Vector Cytokine gene Brucella gene

DNA
DNA
Vaccine
Vaccine
construct

Insert release
Transfection Immunization
 KEGUNAAN BIOLOGI MOLEKULER

 DETEKSI SECARA MOLEKULER

 MASALAH BIOLOGI DAPAT DITANGGULANGI
DENGAN LEBIH CEPAT DAN MURAH
 TRANSFER GEN SECARA NON
KONVENSIONAL
 MUNCULNYA SESUATU YANG BARU
SEKIAN DAN TERIMA KASIH