KROMATOGRAFI

DIAGRAM METODA KROMATOGRAFI

SAMPEL

KOLOM DATAR

f.g CAIR f.g GAS f.g CAIR

Akiran dg TEK GLC PC Kr Kertas TLC

Grav

P P Med P

Size Excl flash * HPLC

Chromt Chromt
 Group Ion Excl HPCL
Basa Kuat CH2N(CH3)3,Cl-
Med Basa N(CH3)3,Cl-
Basa Lmh NH(R)2,Cl-
Asam Kuat SO3-,H+
Med Asam HPO3-,Na+

Excl Chromt  LC berdasar pemisahan/per

perbedaan dimensi molekul.

Contoh kompl camp protein dan estrogen 

BM beda, dpt dipisahkan dg
Chromatografi
 KROMATOGRAFI

salah satu cara pemisahan dengan

dasar analisis menggunakan :

F. Tetap (Stationary)
Dua Fasa
F. Gerak (Mobile) ~ F. Cair

Pemisahan tergantung pada gerakan

relatif dua fasa tersebut.
Dari sifat-sifat kedua fasa 
Kromatografi dapat digolongkan :
 Zat Padat = Kr. Serapan.
“ABS. CHROM”

Fasa Tetap
Zat Cair = Kr. Partisi.
“PARTITION CHROM”

Zat Cair
Fasa Gerak
Gas
Dari 4 macam bentuk fasa yang dapat
digunakan untuk an. Kromatografi 
Sistem Kromatografi dibedakan :

1. ƒG Cair ― ƒT Padat
Kr. Lapis Tipis = TLC
Krom Serapan
Kr. Penukar Ion

2. ƒG Gas ― ƒT Padat
Krom gas Padat = GC
 3. ƒG Cair ― ƒT Cair
Krom Partisis  Krom Kertas

4. ƒG Gas ― ƒT Cair
 Krom. Gas Cair = GLC
 Krom. Kolom Kapiler
.
Semua pemisahan dg kromatografi tgt
pada kenyataan bahwa senyawa-senyawa
yang dipisahkan, terdistribusi sendiri
diantara fasa-fasa gerak dan tetap dalam
perbandingan yang sangat berbeda-beda
satu sama lain.
 KROMATOGRAFI SERAPAN

ƒT = Zat padat berfungsi sebagai adsorben

ƒG = Zat cair

Permukaan partikel padat biasanya lebih

aktif daripada bagian dalam. Yang pada
umumnya dikatakan mempunyai “aktivitas
permukaan” = “Survace Activity”.

Bila partikel dimasukkan dalam larutan 

permukaan partikel mempunyai daya tarik
baik terhadap zat larut atau pelarutnya.
Daya tarik / absorbsi dalam bentuk :

 Elektrostastik (Ionik)
 Daya tarik dua dipol
 Antara dipol dan dipol induksi
 Kekuatan Vander Waals

Partikel padat yang mempunyai

aktivitas permukaan dalam
kromatografi dinamakan “Adsorben”.
 KESEIMBANGAN ADSORBSI
Bila larutan mengalir melalui permukaan aktif
terjadi proses adsorbsi dan desorbsi.
Hubungan antara konsentrasi zat yang ada
dalam larutan (CM) dan yang teradsorbsi (CS)
terlukis sebagai berikut :

Cm A

Cs
Bentuk (A) bentuk konveks, terjadi karena
adanya variasi aktivitas dari permukaan yang
ada. Hubungan demikian sering dinamakan
“Freunddlich Isotherm” yang terjadi umumnya
pada sistem padat – cair.
 Cm B

Cs
Kurve isoterm garis lurus (B) merupakan
keadaan yang dikehendaki, permukaan ≠
akan menjadi jenuh dengan zat yang
diadsorbsi.
Kemiringan (slope) dari kurve isoterm garis
lurus merupakan koef distribusi dan ≠
tergantung besarnya konsentrasi.
 C
Cm

Cs
Kurve isoterm bentuk konkaf (bentuk C)
dihasilkan dari reaksi yang terjadi
sedemikian sehingga menyebabkan
mempercepat proses adsorbsi secara
keseluruhan.
 Ketiga macam perbedaan proses adsorbsi
menyebabkan terjadinya distorsi puncak
yang dihasilkan.

Respon

Konveks Lurus Konkaf

Puncak bentuk condong (Tailing) biasanya
diakibatkan adsorben terlalu aktif.
Hal ini dpt dikurangi  *) menutup sisi aktif
dengan zat lain *)menaikkan suhu, *) me(-)
banyaknya sampel yang akan dipisahkan.
 ADSORBEN
Alumina dan silika gel. merupakan dua
adsorben yang paling populair penggunaannya.
Contoh : urutan absorben sesuai kemampuan
adsorbsi    

1. Alumina 5. Kalium Karbonat

2. Charcoal / Arang 6. Sukrosa
3. Silika Gel 7. Starch / Pati
4. Magnesia 8. Serbuk Selulosa

Aktivitas permukaan setiap adsorben berbeda.

Perlakuan pendahuluan menurut cara-cara
yang ditentukan dapat menghilangkan
perbedaan aktivitas tersebut.
Contoh :
Daya adsorbsi alumina,  dapat diatur
dengan mengatur kandungan  air.
Alumina ---- 3600C / 5 jam, ----- , dibiarkan

menyerap air sampai kadar tertentu yang

dinyatakan dalam skala “Brockmann”.

Alumina berkadar air 3% mempunyai

aktifitas yang umum digunakan.
Luas permukaan alumina 150 m2/g, kadar air
cukup 5% untuk pelapisannya.
Silika gel yang memp luas permukaan  500
m2/g tetapi mempunyai aktivitas kimia lebih
kecil, banyak digunakan untuk pemisahan
senyawa organik yang peka terhadap
perubahan-perubahan karena aktivitas
permukaan yang mempunyai sifat katalik.

Hubungan skala Brockmann dan

kadar air alumina

Skala Brockmann % Kadar Air

I 1
II 3
III 6
IV 10
V 15
 ZAT PELARUT
*) Zat pelarut mempunyai peranan penting
dalam Elusi yang dapat menentukan baik-
buruknya pemisahan.
*) Zat pelarut yang mampu menjalankan Elusi
terlalu cepat  ≠ akan mampu memisahkan
secara sempurna.
*) Elusi yang terlalu lambat  menyebabkan
waktu Retensi lama.

Sebaiknya zat pelarut ≠ tergantung dari

kekuatan elusinya. Kekuatan zat elusi : 
daya penyerapan pada penyerap (zat pengisi)
kolom.
 Alumina
Penyabab Kekuatan
Ke Polaran Penyerap
Silika Gel.

Kekuatan penyerapan  dg me  polaritas zat

yang diserap.
Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deretan
pelarut dalam kolom dg silika gel,
 Air Murni  Metanol  Etanol  Propanol
 Aseton  Etil Asetat  Dietil Eter  Kloroform
 Metilenia Cl  Benzana  Toluena
 Trikloretilen  Karbon Tetra Cl  Sikloheksan
 Heksan.
Menurut Williams pelarut-pelarut dalam kolom
menggunakan “carbon aktif” untuk
pemisahan asam-asam amino dan sakarida
dalam larutan :
Adalah :
Etil Asetat , Dietil Eter , Propanol , Aseton ,
Etanol , Metanol , Air Murni .

Catatan pelarut harus betul-betul murni.

Pipet

Kertas Saring

Gambar Penanganan Cuplikan

PENGISIAN DAN CARA KERJA KOLOM
Pengisian kolom harus dikerjakan
dengan seragam. *) Penyeragaman
kepadatan dalam kolom dengan
vibrator atau planger,
*)atau adsorben dimasukkan ke dalam
kolom dalam bentuk bubur (Slurry) dan
partikelnya dibiarkan me.

Pengisian ≠seragam menimbulkan

rongga di tengah-tengah kolom.
Bagian dasar / bawah dan atas dari
isian kolom diberi glasswool atau
sintered glass disc untuk menyangga
isian.
 Cad Zat Pelarut
Pelarut / f.grk Kertas Saring// Pasir

Isian Kolom
Kertas Saring
Glass Wool

Penampung Eluat

Kecepatan elusi sebaiknya :*) konstant, dan

*)tgt dari :  ukuran partikel bhn isian kolom
 Dimensi kolom
 Viskositas cairan
 Tekanan untuk mengalirkan zat pelarut
 PENANGANAN CUPLIKAN
Memasukkan cuplikan dari atas kolom
merupakan hal yang sangat penting
 Cuplikan harus rata
Dlm keadaan larutan yg sepekat
mungkin???
 Dicegah terjadinya 
Dicegah terjadinya penggoncangan
kolom
Untuk mendapatkan permukaan rata 
permukaan penyerap / bahan isian
diberi kertas saring atau pasir yang
bersih hingga membentuk lapisan tipis.
Pemasukan cuplikan melalui pipet
kecil – ujung pipet ditempelkan pada
dinding kolom. Selama zat cair lepas
dari pipet, ujung pipet digerakkan
berkeliling dalam kolom, dan
diupayakan ≠ menyentuh penyerap /
bahan isian.
Cuplikan yang tertinggal dalam
dinding kolom dicuci dengan cara
yang sama menggunakan pelarut
murni. Bila semua cuplikan telah
turun ke bagian bahan penyerap,
bahan pelarut / ƒG dapat dimasukkan
melalui corong pisah.
 Kromatografi ƒG Cair
Partisi ƒT Cair

Dlm kromatografi ini fasa tetap /

stasioner ≠ berupa zat padat tetapi
cairan.
Fasa geraknya juga berupa cairan ~
HPLC “High Performance Liquid
Chromatography”.
= Liq-liq Partition Chromatogra phy

Zat yang dilarutkan akan terdistribusi

dg sendirinya diantara 2 fasa zat cair
Dan sesuai dengan koef partisinya.
Perbedaan koef partisi dari berbagai
komponen  campuran dapat
dipisahkan.

Keuntungan kromatografi partisi

dengan adsorbsi, karena :
- Daya ulangnya lebih baik
- Dari data kelarutan, hasil dapat
diramalkan
- Koef distribusi konstant dalam
jangka [ ] yang agak luas 
dapat menghasilkan puncak yang
simetris lebih tajam
Keunggulan “HPLC”
1.Dapat menangani senyawa-2 yang stabilitas
terhadap suhu dan volatilitasnya terbatas,
bila tanpa menggunakan derivatisasi.
Contoh : analisis beberapa jenis gula, dg
HPLC tanpa derivatisasi
2. t pemisahan singkat  5 – 10 menit untuk
satu sampel.
3. Dapat digunakan untuk anal. Kuantitatif dg
presisi yang cukup tinggi.
4. Merup teknisi analisis yg peka,mempunyai
resolusi yang baik untuk pemisahan
senyw
serupa.
Efisiensi maksimal dapat dicapai dg
*) mengatur kecepatan aliran fasa
gerak yang kecil, sehingga analisis
memakan waktu yang lama. Untuk
menanggulangi hal ini perlu
diperhatikan :

*) Me  P aliran ƒ gerak
*) Me(-)jarak tempuh zat yg dianalisis
*) dlm proses partisi,dg menggunakan
bahan isian atau penyangga
(Packing Material)
Bahan isian sebagai penyangga harus inert
thd senyawa-2 yang akan dipisahkan.
fT (stasr). Berupa cairan yang dilapiskan
pada permukaan bahan penyangga (Packing
Material).
Ikatan antara bahan penyangga dg ƒT , dapat
berupa ikatan fisik maupun kimiawi.
Dua tipe bahan isian yang ada dipasaran 
Pellicular Beads dan Microporous Prarticle.

 Pellicula Beads terdiri dari bagian dalam

yg padat, ≠ berpori, biasanya dari bahan
silika, kulit luar tipis bersifat porous, dg
ketebalan 1/30 – 1/40 dari  bagian dalam.
Besar partikel keseluruhan  40 .m.
Kelemahan tipe ini  luar permukaan dari
kulit yang berpori   1-25 m2/g  jarang
dipakai

 Microporous Particle / Mikropartikel

Ukuran antara 3-10 .m  memberikan luas
permukaan besar antara 200-300 m2/g

 Efisiensi tinggi karena  plat teoritis dapat

mencapai 10.000 dalam kolom sepanjang 25
cm.
Kromatografi partisi cair - cair  ƒT dan ƒG
harus ≠ bercampur.
Pelarut lebih polar digunakan sebagai ƒStat 
sistem dinamakan Krom Fase Normal.
Contoh :
Air sebagai ƒT yang melapisi silika gel
secara tipis. Air ter-ads. 50% dari berat
silika gel. kadang-2 dipakai sistem buffer.
Untuk menghasilkan tR yang diharapkan
jumlah fraksi terlarut dalam ƒG berkisar 0,05
– 0,5.
Bila ƒT dipakai senyawa non polar, dan ƒG
polar merupakan kebalikan fase normal.
“Reverse Phase Chromatography” untuk ini
penyangga padat yang non polar dapat
digunakan bubuk karet dengan lapis tipis
benzen sebagai ƒT dan air sebagai ƒG.
 SUSUNAN PERALATAN
Pada HPLC dan GLC ≠ jauh berbeda.
Komponen utama :
 Reservoir pelarut untuk fase gerak
 Pompa untuk mengalirkan fase gerak
/ mobile dg kecepatan dan tekanan
tetap
 Injector untuk memasukkan sampel
Ada 2 macam   On Coloum
Injection / Langsung
 Holding Loop Injection / ≠ langsung
 Kolom
 Detector :  D. Ultraviolet
 D. Fluoresens
 D. Konduktivitas
 D. Indeks Refraksi
 D. FID. “Flame Ionitation
Detector”.
 Recorder
 KOLOM KROMATOGRAFI
Dapat berupa pipa gelas dg kran dan gelas
penyaring di dalamnya.
Ukuran kolom dan efisiensi kolom dapat
dihitung secara teoritis.
Skema pemisahan dua campuran A danB
dengan kolom kromatografi
Solven

SAMPEL
A+B
B
A
Bahan
Pengisi B
Kolom A B

Detektor
t0 t1 t2 t3 t4
Signal

A B
t

t1

[ ]
A t2
B

B
A

Jarak Migrasi 
 KESEIMBANGAN DISTRIBUSI
Perbedaan migrasi merup hsl distribusi
keseimbangan dr senyawa A, B, C, …
diantara fTdan fG.
Distribusi molekul cuplikan antara dua
fasa dinyatakan dlm tetapan
keseimbangan dikenal sbg koef Distr
atau partisi = KD
K
CS
KD 
A S
1 CM A M
CS = Kadar senyawa dlm fT (Diam), (fo)
CM = Kadar senyawa dlm fG (Mobil), (fa)
K, meliputi berbagai macam
mekanisme tgt sifat-2 fasa dan
interaksi cuplikan dengan setiap fasa.

Proses : Harga K merupakan

Penukaran ion populasi relatif
Serapan Senyawa dlm 2 fasa
Partisi

k   populasi CS  CM 
Mol cuplikan akan tinggal
lebih lama di ƒSts = ƒo
 Migrasi
Saat Seimbang 
BM AM
BS  BM Kecepatan migrasi
ditentukan  mol
AM  AS dalam fasa gerak

BS AS

Migrasi senyawa dipengaruhi

Sus Fasa Tetap Suhu kolom

Sus Fasa Gerak

Sebagai dasar retensi
Keseimbangan dinamik
sebenarnya yang ada 

ΣMol dalam fasa gerak

Fraksi dalam fasa gerak 
ΣMol total

CM .VM 1
R 2 R
CM VM  C S VS 1  k.VS / VM

faktor kapasitas yang setara

3 k'  k.VS / VM 
dengan CS.VS / CM.VM
 C M .VM C M .VM 1
R 
C M .VM  C S .VS  C .V 
C M .VM 1  S S 
1 1  C M .VM 
  R
C S VS VS
1 . 1  k.
C M VM VM
k

ƒkapasitas VS
 k.  k'
VM
1
R harus selalu ≤ 1
1  k'
 DIFUSI EDDY
A  Perbedaan aliran F gerak
Lebar
Awal
dalam kolom  molekul
1 2 3 4 cuplikan melewati jalan
5 6 7 berbeda, tergantung aliran
10 yang diikuti.
8 9

B  Dalam waktu tertentu

3 - Lorong alir , kecep. alir  

1 2 4 Lebar
Akhir jarak yang ditempuh molekul
5 6 7
panjang.
8 9 10
- Lorong alir , kecep. alir  
jarak yang ditempuh mol
pendek.
 1 1
R 4
1 k'
1  k'

Harus selalu ≤ 1, karena k’≥0, maka

kecepatan solut tidak pernah lebih besar
dari kecepatan ƒM

Ciri khas kedua pemisahan kromatografi 

penyebaran Mol yang menyebabkan
perbedaan puncak kromatogram.

 Molekul-molekul membentuk garis

sempit ~ luas puncak awal.
 C
 Perpindahan massa ƒG
berhubungan dg perbedaan
1 kecepatan alir setiap bagian
2
dari suatu lorong.
5  ƒG berdekatan dg partikel,
akan bergerak lambat / ≠
Perpindahan bergerak.
Massa ƒG  ƒG ditengah aliran bergerak
lebih cepat  dlm rentang
waktu tertentu
~ molekul cuplikan dekat
partikel menempuh jarak
lebih pendek.
~ molekul cuplikan di tengah
aliran menempuh jarak
lebih panjang.
 D  Partikel fasa diam yang
5
berpori ƒG yang masuk dalam
pori ≠ bergerak.

 Molekul cuplikan bergerak

keluar masuk pori secara
Perpindahan Massa ƒG difusi
yang berhenti
 Setelah molekul berdifusi
dalam pori dan terikat
dengan berbagai cara dalam
E fasa tetap / diam 
- Bila molekul cuplikan
Perpindahan
Massa ƒTETAP terikat lama dalam ƒT
karena difusi terlalu dlm
 menempuh jarak ke
bawah lebih pendek.
TEORI KELAJUAN / KECEPATAN
Dikembangkan oleh “Van Deemter” orang
Belanda 

Pers Van Deemter

B 5 B
HETP  A   C.μ H A  C.μ
μ μ

Pers ini berguna untuk meningkat kan

peranan kolom kromatografi  efisiensi
kolom.
 diukur dengan :
 μ
Panjang Kolom
.
cm
Waktu Penahanan dtk 

A = Difusi Eddy / Dif. Olakan

B = Difusi Longitudinal
C = Transfer. Massa
 = Kecepatan aliran ƒG dlm kolom (cm/dtk)
 Difusi Longitudinal
9 B Kur ve V.DT
A  Cμ
μ

6 Transfer
HETP
Massa
Hm in

Teori B
3
μ
B Cm
C Dif. Eddy

A A
0 60
Opt 140 180
cm/dtk
 Hmin dan Opt diperoleh dari
turunan 1 Pers Van Deemter 

B
H  A   C.μ
dH B
μ
  2 C
d 

dH B  C. 2 6
Opt  0
d
B
B B
B Hmin A . C C
Opt  B B C
C C C
B B B
A .C.  C.
B C C
 B HETP  A  C.μ
Hmin  A  2.C. 7 8 LL.C
C
B
t RA
A

t RB B
tRC
C

t tR
Signal

tm
W
o t
Ciri Khas Kurve / Peak.
Kromatogram
• Setiap senyawa meninggalkan kolom
dalam bentuk simetri, sebagai kurve gaus
• Setiap puncak keluar dlm waktu tertentu,
yang dapat dipakai sebagai identifikasi
senyawa
tR = waktu retensi diukur mulai waktu
injeksi cuplikan  waktu puncak
maksimum meninggalkan kolom
• Perbedaan waktu retensi tR berdekatan.
Semakin besar ∆tR dari campuran semakin
mudah dipisahkan
RETENSI
Jika kecpt aliran ƒG dlm kolom μ cm/dtk
 kecepatan rata-rata cuplikan x = μx

μx tgt dari μ dan R (Fraksi Mol X dalam ƒG )

1
μx  μ.R R
1  k'
μ  1 
μx  μx  μ.  ......(9)
1  k' 1  K. Vs Vm 
Hub : μ , tR dan panjang kolom L.(cm)

L L L
tM  tR   μx 
μ μx tR
μ.tM L L  1 
tR    . 
μx tR tM  1  k' 

L cm
tR    dtk  tR
μx cm dtk
tR = waktu retensi  waktu yang diperlukan
fraksi solut bermigrasi sepanjang lintasan
kolom
 tR  tM tR'
(10).. tR  tM 1 k'  k'   .....(11)
tM tM

 Dapat terlihat dalam chromatografi

k’ = Faktor Kapasitas

tR
k'  
tM
Konsep teori plat dari persamaan
binomial
Retensi kadang-kadang diukur dengan
satuan Volume
VR  Vol total ƒG yang diperlukan untuk
mengelusi puncak senyawa x.
VR = tR x kecepatan alir ƒG melalui kolom
F = ml/dtk
VR = tR.F
Vol Total ƒG dalam kolom VM = tM.F

VR lebih disenangi dari tR karena tR

berubah dengan berubahnya kecep. alir
(F, μ), sedang VR tidak tergantung pada (F,
μ). μ = cm/dtk
tR
VR  VM
tM
VR  VM 1  k' ......(12)
 Konsep Teori Lempeng / Plat
Teori lempeng plat, perlu
untukmenerangkan proses terjadinya suatu
pemisahan secara kromatografi. Karena
proses yang terjadi pada kromatografi anlog
dengan proses ekstraksi bertingkat yang
dilakukan oleh Craig.
Dimana fasa diam dalam kromatografi
dianggap terdiri dari sejumlah ruang yang
mempunyai ukuran sama dan tiap ruang
mengandung sejumlah fasa mobil dan fasa
diam.
Dengan teori ekspansi binomial, distribusi
sampel dalam ruang dinyatakan dalam
rumus.
 n
 K.VS Vm 
p  q  
n
  
 K.VS  Vm K.VS  Vm 

Distribusi sampel dlm ruang tersebut

merupakan fungsi dari koef distribusi (KD).
Perbandingan volume pelarut yang digunakan
(Vs / Vm) dan jumlah pemindahan atau transfer
(n).
Teori plat dapat menggambarkan kecepatan
migrasi secara kuantitatif tetapi tidak dapat
menerangkan bagaimana terjadinya
pelebaran pik. Sehingga teori tersebut
dilengkapi dengan teori kinetik / teori
kecepatan.
sampel.
Fraksi waktu tinggal dalam fasa gerak, sbg
dasar RETENSI dinyatakan dlm pers 2, 3, 4
Fraksi waktu tinggal dalam fasa mobil sama
dengan jumlah molekul dalam fasa mobil
dibagi dengan jumlah total molekul dalam
sampel
Fraksi dlm fasa gerak (R)
Cm .Vm
(R) = .....(2) *
Cm .Vm  C s .Vs
1
k’ = K.Vs/Vm ….. (3)* 
1  K.Vs Vm
 faktor kapasitas setara
Cs.Vs/Cm.Vm 1
R ....(4) *
1 k '
Besaran-besaran dlm kromatografi
 WAKTU RETENSI

Apabila kecepatan alir fm (u, cm/dtk)

diatur tetap, t tetap, perbandingan fasa
diam dan fasa mobil tetap,  setiap
komponen dalam suatu sampel akan
mempunyai waktu tinggal yang tetap,
yaitu waktu yang diperlukan oleh suatu
komponen untuk melintasi suatu fasa
diam dengan panjang L.(cm)  waktu
retensi (tR)
Bila kecepatan rata-rata cuplikan x
= ux, maka ux akan tergantung dari
u dan R (fraksi mol x dalam fm)

1
ux  u.R R
1  k'
u
ux 
1 k'
1
 u. ......(5) *
1 K. Vs Vm
Hubungan u dg tR dan panjang lintasan
L(cm) 
tm = waktu yang diperlukan oleh fasa mobil
itu sendiri (tanpa sampel) untuk keluar dari
fasa diam

L panjg L
tm  ..tR   1 k'  tm 1 k'....(6) *
u kecpt u
t R  t m tR '
k'   ....(7) *
tm tm

Konsep teori lempeng / plat

FAKTOR SELEKTIFITAS = 
Untuk pemisahan 2 zat terlarut A, B  melalui kolom
kromatografi  perlu diketahui faktor selektivitas A, B
KB
(13)..... α  KB, KA adalah Koef Partisi A dan B
KA
k’ = Faktor Kapasitas
K'B
(14)..... α 
K' A
tR )B  tM
α .....(15)
Dalam eksperimen  tR )A  tM

t'R )B
α .....(16)
t'R )A t’R t terkoreksi
RESOLUSI KOLOM = Rs

A B
Rs = 0,75

A B
 Rs = 1,0
Detektor
Signal
0
tRB
tRA ∆Z= ∆tR
A B Rs = 1,5
tm WA1/2 WB1/2
0 WA/2 WB/2
0 WA WB
t
METODA LUAS PEAK ∆
Resolusi = perubahan nyata antara dua
spesies B, A dalam kolom

Dari grafik resolusi terbaca 3 bentuk

resolving power yang ≠ sama.
Rs = 1,5 Memisahkan A dan B secara
komplit, meskipun masih ada over lap 0,3%. ~
Resolusi Base Line

Rs = 1,0 Daerah peak B masih mengandung

A 4% - 2,5% dan sebaliknya

Rs = 0,75 A dan B belum sama sekali

terpisahkan
 tR 2tR
Rs   ......(17)
1 1 WA  WB
WA .  WB .
2 2
2tR B  tR A 
Rs  ......(18) 1
WA  WB

Utk pemisahan yg baik R ≥ 1,5  ≥ 99,7%

Pemisahan spesies dlm kromatografi erat
hubungannya dengan faktor-faktor :
1. Efisiensi kolom 2. Efisiensi pelarut
Eff kolom diukur sbg ∑ plat teoritis = N,
Ketinggian ekivalen terhadap plat teoritis
= HETP
 L = Panjang Kolom
L
 HETP  ......(19)
N
(20)...... N  L L  N.H .......(21 )
H

σ2
H .....(22)
L
dari pers. Gauss 
L2
N  2 ....(23)
σ

 stand deviasi pengamatan  Pers. Gauss

 = standard deviasi Peak Kromatografi
 L
 μ
tR

σ σ σ.tR
(24).....      .....(25) 
μ L L
tR

Daerah kurve Gauss maks, termasuk

diperhitungkan ± 2 standard deviasi ± 2 

Sehingga dalam perhitungan intersep kurve

maks diperhitungkan pula kira-kira ± 2 .
W = Lebar puncak yg diukur pada
perpotongan tangen dan garis dasar

 W  4.τ
L.W
σ
4.t
g
2
L.W 2 t
 R
(27)..... H  N  16  ....(28)
16.t 2 W
 
R
Catatan tR, W diukur dg satuan yang sama.
Cara lain untuk menghitung /
memperkirakan N  dg membandingkan
terhadap W ½ = Lebar ½ H.

2
 
 t 
N  5,54 R  29
W½ W 
H  i/2 
 

W
dasar ∆
Hubungan Antara Rs dan Kolom

Hub matematis antara RS, kB, kA,  dan N.

Dengan asumsi WA ≈ W∆ ≈ W

Maka Pers
2t R B  t R A  tRB  tR A 
(18) RS    R S ....(30)
WA  WB  W 

 tR 
2
tRB  tRA  N
Pers (28) N = 16   RS  . .....(31)
W tRB 4
 k'B k'A N
RS  . .....(32)
1  k'B 4
k'B N α  1  k'B 
α  RS  . .  ......(33)
k'A 4 α  1  k'B 
2
 α   1  k'B 
2

N  16.R S 
2
   .....(34)
 α  1   k'B 
kA  kB k'A  k'B  k' α  1
 k' 
.α  1
N
RS   ......(35)
4  1  k' 
Eliminasi k’A dg
substitusi  = k’B/k’A
 2t R B  t R A 
Rs  ......(18)
WA  WB
Bila diasumsikan WA = WB = W

2t R B  t R A  t R B  t R A
Rs  
2W W

 1  k' 
2 2
2 α 
N  16.R S   k'  .....(36)
 α  1 
L  1 
μB  μ  μ. 
tRB  1  k' 
NH.1  k'B 
N   t R B  
L
H μ
3
 1  k'B 
2
16R S .H  α 
2
(37)..... t R B  .   
μ α 1  k'B 2 
 1/1 1/4 1/16

Rs = 0,6

Rs = 0,8

Rs = 1,25

Rs = 1,0

Gambar Pemisahan Sebagai Fungsi RS dan Kadar Relatif

Dari penjabaran rumus, diketahui bahwa untuk mengatur resolusi k’
k 2 kB
dan N berpengaruh, sedang     untuk mengatur RS
k1 k A
dapat merubah : , N, k’
 awal

k’
diubah

Plat N
Teori 

Faktor 

Selektivit
as
T

Gambar Perubahan k’, N,  terhadap Resolusi

 1  k' 
Dari rumus RS =   1. N. 
4  1  k ' 
i ii iii
 N K’

Dari pers. RS terhadap , N, k’, ternyata faktor

(i), (ii), dan (iii) ≠ saling bergantung, dengan
demikian dapat dioptimalkan dulu faktor (i)
baru yang lain.
Selektivitas pemisahan ditunjukkan faktor 
yang berubah dengan mengatur susunan
ƒgerak dan ƒtetap.
 Me    pergeseran satu puncak relatif
terhadap lainnya.
 Waktu pemisahan dan tinggi dua puncak ≠
begitu berubah untuk perub  yang wajar.
Efisiensi pemisahan ditunjukkan faktor (ii) =
N, dengan mengubah L dan μ,
N suatu kolom di ,  menghasilkan
penyempitan dua puncak dan menaikkan
tinggi puncak. Waktu pemisahan ≠ langsung
dipengaruhi.

Faktor (iii), k’ berubah dengan mengubah

kekuatan fasa gerak. Perubahan k’ dapat
berpengaruh besar pada pemisahan.
k’   perubahan jelek, tR pendek.
k’   terjadi kenaikan nyata resolusi,
meskipun tinggi puncak turun cepat dan
waktu pemisahan naik.
Pengaruh ∑ Cuplikan


Kadar b
Cuplikan

 Vol. Eluat
Dari gambar cuplikan kromatogram terlihat /
terbaca
a. Cuplikan sedikit,  Tinggi puncak naik
dg bertambahnya cuplikan
 tR ≠ dipengaruhi  RS tetap

b. Jumlah Cuplikan Kritik, - waktu retensi

menurun

c. d. Pe (+) cuplikan berlanjut,  Terjadi

penurunan nyata pada pemisahan dan tR.
Untuk pemisahan analitik, lebih baik bekerja
pada daerah dimana k’ tetap, yaitu ∑ cuplikan
harus kurang dari kapasitas linear kolom.
PUNCAK BEREKOR
Pada sistem Kromatografi yang baik,
setiap puncak merupakan kurve GAUSS
SIMETRI.
Puncak berekor kadang-kadang muncul
dalam kromatogram, dengan 4 bentuk
kemungkinan :

B C D
A
Bentuk A A Terjadi karena ketidak
Berekor Kimia cocokan antara cuplikan
dengan ƒG atau ƒT.
Ditandai dengan lambat
kembali ekor puncak
pada garis dasar

 Pemisahan terhadap
puncak berikutnya jadi
jelek

 Jika terjadi puncak

berekor tipe ini, perlu
dicoba ƒG, ƒT yang lain
atau dicoba metoda lain
Bentuk B B Akibat dari puncak
Berekor Pelarut pelarut cuplikan
 Penggunaan cuplikan
sedikit mungkin, atau
menaikkan RS
Bentuk C C Terjadi karena kolom
Poisson kurang efisien, efisiensi
kolom .
 Jarang terjadi pada
kromatografi cairan

Bentuk D D Puncak sedikit kurang

Eksponansial simetri dan ini biasa
terjadi pada semua
Normal
kromatografi
KROMATOGRAFI PLANAR
Thin Layer Chrom “TLC”
Dua tipe
Kromatografi Planar Paper Chromatography

Thin Layer Chromatography ≈ TLC ≈ KLT.

Teknik ini dikembangkan oleh “EGON STAHL”
dengan menghamparkan penyerap pada
lempeng gelas sehingga merupakan lapisan
tipis. Kromatografi Serapan
KLT / TLC merup Kromatografi Partisi
Karena absorben telah dilapisi air
dari udara
KLT cepat populair karena memberikan
banyak keuntungan :
-Peralatan sederhana
-Murah
-Waktu analisis cepat
-Daya pisah cukup baik

Sebagian besar teori kolom dapat diterapkan

pada KLT.
Pemisahan dilakukan oleh keseimbangan
berturutan cuplikan terhadap dua fasa, satu
diantaranya bergerak terhadap yang lain.
 Derajat retensi pada KLT
dinyatakan sebagai :

dR Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

 Rf 
dΜ Jarak yang ditempuhpelarut

Jarak yg telah ditempuh pelarut dapat diukur

dengan mudah dan jarak tempuh cuplikan
diukur pada pusat kerapatan maksimum.

CS
Koef distribusi k  tetap berlaku
CM
Hubungan koefisien distribusi dengan Rƒ 

 mol senyawa terlarut dalam f G

Rf 
 mol tetap senyawa terlarut dua fasa

CM .A M
Rf 
CM . A M  C S . A S

AM, AS = luas penampang melintang dua

fasa (tegak lurus lempeng)

AM AM
Rf  
C .A
AM  S S AM  k . A S
CM
Luas penampang melintang sukar diukur 
persamaan di atas kurang praktis,

Rƒ merupakan bentuk modifikasi dari

tetapan keseimbangan.

Rƒ terbentuk dari:
*macam adsorben, *ketebalan,
*metoda arah pengembangan,
*kadar dan jumlah cuplikan, serta
*jarak yang ditempuh / noda.
Dengan melihat ketergantungan harga Rƒ
 akan lebih mudah dan tepat
menggunakan harga Rƒ relataif atau R
standard.
Dimana suatu senyawa standard di (+) ke
cuplikan.

Harga RSTD adalah angka banding jarak

tempuh dua bercak tersebut dalam
waktu pengembangan yang sama.
 dM

dg Batas akhir pelarut

2
W

1
WA WB

Batas awal

Ditektor
  Gambar rekaman kromatografi
A B dengan densitometri scan
Sinyal

 Jarak migrasi
 FAKTOR KAPASITAS
Persamaan-2 yang telah dijabarkan dapat
diadaptasi pada TLC.
tR, tM waktu yang dibutuhkan senyawa
bergerak dalam fasa ―~ dR
Bila μ kecepatan linier
dR dM
tM  tR 
 
dM  dR
k' 
dR
d
1 R
dM 1 Rf
k'  
dR Rf
dM
Re solusi  R S
2Z 2dR A  dR B 
RS  
WA  WB WA  WB
N    1  k ' 
RS     ....Pers(35)
4    1  k ' 
k 'B dM  dR B dR A
  
k ' A dM  dR A dR B
faktor selektivitas
Semua prosedur kromatografi, kondisi
optimum untuk suatu pemisahan merupakan
kecocokan antara f tetap dan f gerak.

KLT / TLC fasa tetap berupa lapis tipis, pada

umumnya digunakan silika gel.
Untuk penggunaan dalam suatu tipe
pemisahan perbedaan fasa tetap terletak
pada :
 Struktur
 Pori-pori
 Struktur lubang
Silika gel perdagangan :
Ukuran 10 - 40μ  berpengaruh pada μ
dan pemisahan
 Ukuran 20 – 1500A Berpengaruh pd
80 – 150 = pori besar proses serapan
 Luas permukaan 300 – 1000m2/g
 Kelembaban relatif 45 – 75% mengikat air
7 – 20%
 Sangat higroskopis
 Deaktivasi ditentukan kelembaban relatif
kamar dan penyimpanan lempeng silika gel
 perlu diperhatikan
Macam-macam gel di perdagangan :
1. Silika gel dg pengikat
silika gel G dg pengikat - CaSO4 [5-15%]
silika gel S dg pengikat - pati
2. Silika gel dg pengikat dan indikator
flourisense
 Silika gel GF atau GF 24
Berflourisens kehijauan jika dilihat dg UV
 pendek.
Indikator yg digunakan timah-kadmium
sulfida atau mangan-timah silikat aktif.
3. Silika gel tanpa pengikat
Silika gel H atau silika gel N.
Lebih stabil dibanding bentuk I.
4. Silika gel tanpa pengikat dengan
indikator flourisense.
5. Silika gel untuk pemisahan preparatif.
Silika gel PF254 + 366
6. Alumina dengan pH 9, 7, 4
Dengan pengikat CuSO4
7. Selulosa, sebagai fasa diam KLT 
diperoleh mekanisme sama pada krom.
kertas
Selulosa untuk KLT ada 2 bentuk :
- serat asli - Monokristal
Pemilihan fasa gerak pada KLT dengan
silika gel / alumina sebagai ft, mengikuti
aturan kromatografi serapan.
PELARUT SEMI MIKROSTOP (Menurut
kenaikan sifat Hidrofob) banyak digunakan.
 Kloroform biasanya distabilkan dengan Etanol
) Air n. Anil Alkohol
Formanida Etil Asetat
Metanol Eter
Asam Asetat n. Butil Asetat
Etanol Kloroform
Isopropanol )) Benzena

Aseton Siklo Heksan

n. Propanol Eter Petroleum
Tert-butanol Petroleum
Fenol m. Parafin
n. Butanol
) Untuk pemisahan senyawa Hidrofil
)) Untuk pemisahan senyawa Lipofil
METODOLOGI
1. Pembuata Lempeng Lapis Tipis
 Ukuran lempeng gelas yang biasa digunakan 20 x 20,
20 x 10, 20 x 5 cm
 Pencucian : - Air (+) deterjen Keringkan
- Aseton  keringkan
 Pelapisan : - 30 g bahan pelapis dibuat bubur
dengan air atau pelarut lain
- Pindahkan dengan segera dalam alat
perata.
- Ratakan bubur pada lempeng dengan
ketebalan 0,25mm
Untuk pemisahan preparatif tebal lapisan 0,5 – 2,0 mm.
 Pindahkan lempeng pada rak dengan hati-hati,
diamkan ± 30 menit
 ------- t 100 – 1200C ± 1 jam

 Simpan dalam Desikator

 Perbandingan Bahan dan Pelarut untuk Lempeng
Bahan B : Air
Silika Gel 1 : 1,5
Silika Gel G / GF 1:2
Alumina 1:1
Alumina Oksida G 1:2
Selulosa MN 300 1:5
Selulosa MN 300 G 1:6
Poliamida 1:9
(kloroform – metanol 2 : 3)
PENOTOLAN CUPLIKAN
 Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20, 20 x 10, 20 x 5)
dengan tebal 0,2 mm.
Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat dengan diameter 3 – 6
mm, atau berupa garis; 1,5 – 2 cm dari tepi bawah.
Tepi bawah

Lempeng
KLT
Berupa
garis
 3 – 6 mm

1,5 – 2 cm
 PENOTOLAN CUPLIKAN
 Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20,
20 x 10, 20 x 5) ,dengan tebal 0,2 mm.
. Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat
dg diameter 3 – 6 mm, atau berupa garis
1,5 – 2 cm dari tepi bawah.
Tepi bawah

Lempeng
KLT
Berupa
 3 – 6 mm
garis
1,5 – 2 cm
• Penotolan dengan mikro pipet atau
microsyringe diperlukan 1 – 20 μL.
Kelebihan bahan totolan
menyebabkan bercak asimetri
danperubahan harga Rƒ.

• HETP pada KLT biasanya 10 x 10, 10

x 20 cm. diperlukan cuplikan dalam
nano  pikogram setiap bercak.
Diameter bercak harus tidak lebih
1,0 – 1,5 mm dan vol cuplikan ± 0,2
μL.
 PENGEMBANGAN KROMATOGRAM

Teknik naik linier (ascending)

Teknik turun / horisontal (descending)

Kromatogram biasanya dikembangkan

dlm bejana pengembang gelas atau
logam yg tertutup dan jenuh dengan
uap pelarut.
 Teknik Perbaikan Pemisahan

• Pengembangan Berkelanjutan
ƒ gerak dialirkan pada bagian atas
lempeng pengembang. Teknik ini
digunakan untuk senyawa dengan Rƒ
0,05 – 0,2 setelah pengembangan
pertama.
Pengembangan Dua Dimensi
Cuplikan ditotolkan di salah satu
pojok kemudian dikembangkan
seperti biasa.

Kemudian diputar 900 sehingga pita

pemisahan I terletak pada bagian
bawah lempeng  dilakukan
pengembangan II sehingga terjadi
pemisahan berbeda pada arah
kedua.

Teknik ini berguna untuk cuplikan

yg mengandung banyak penyusun.
Pengembangan Serkuler
Fasa gerak dialirkan dengan sumbu
atau pompa melalui pipa kapiler
ditengah lapisan / tetap. Senyawa
terlarut bergerak dari tengah
penotolan menghasilkan lingkaran-
lingkaran sempit.

Pengembangan Beberapa Kali

Fasa gerak biasanya mudah
menguap, diuapkan setelah terjadi
pengembangan. Lempeng
dikembangkan lagi dengan ƒG yang
sama atau berbeda.
METODA IDENTIFIKASI
Untuk melihat senyawa ≠ berwarna
pada lempeng pengembang, biasanya
dilakukan metoda sebagai berikut :
1. Dengan UV (254 – 366 mm)
a. Pada lap berfluorisensi (S GF254)
bercak muncul sebagai bercak
hitam.

b. Senyawa berfluorisensi, pd lapisan

biasa bercak akan terlihat
berfluorisensi.
2. Disemprot pereaksi yg menghasilkan
warna atau berfluorisensi.
Digunakan utk deteksi asam sulfat,
(H2SO4 p., 50% H2SO4, 50% H2SO4 dlm
Metanol).

Reaksi ini terbentuk dlm keadaan dingin

atau dg --------100 -1200C

- ≠ dapat digunakan pada ft organik

atau sbg bahan pendukung “pati”

- Pereaksi lain yg banyak igunakan

uap iodium
 Uap Pelarut

Cuplikan

A B

Permukaan
Pelarut

C D
Pelarut 2
Faktor yg mempengaruhi gerakan noda dlm KLT yang
juga berpengaruh terhadap Rƒ
1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan.
2. Sifat adsorben dan derajat aktivitasnya.
Aktivitas di  kan dg pemanasan dlm oven.
3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap.

4. Pelarut & [o kemurnian] f gerak.

- Kemurnian pelarut sangat penting
- Perbandingan campuran pelarut perlu
diperhatikan.

5. Derajat kejenuhan uap dalam bejana

pengembangan.

6. ∑ cuplikan yang digunakan

Tetesan cuplikan   Tendensi penyebaran noda
Kesalahan harga Rƒ  Terbentuknya ekor
 Efek kesetimbangan lain
7. Suhu, pemisahan sebaiknya pada suhu
tetap
Hal ini terutama untuk mencegah
perubahan-perubahan dalam komposisi
pelarut karena penguapan,( perubahan
fasa).
8. Kesetimbangan
Kesetimbangan dalam KLT lebih penting
dalam krom. kertas  perlu diupayakan
atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap
pelarut.
Gejala atm. bejana ≠ jenuh 
pengembangan dengan permukaan
pelarut cekung, fasa gerak bergerak
lebih berat di bagian tepi  .. harus
dihindarkan.
KROMATOGRAFI KERTAS
 Prinsip sama KLT, hanya fasa tetap digunakan kertas
bukan lempengan.
Pelarut bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya
kapiler, dan menggerakkan komponen cuplikan. Pada
perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut.

d pelarut

B
dC
A dB
dA
Awal
Bila permukaan pelarut mulai bergerak
sampai waktu tetentu/ditetapkan, kertas
Diambil dan dikeringkan.

Kedudukan dari permukaan pelarut dibe

ri tanda.

Jika senyawa campuran berwarna akan

terlihat noda yang terpisah
Bila tdk berwarna perlu diteksi dg UV,di
Metoda identifikasi yg plg mudah dengan
Berdasar kedudukan noda relatif terhadap
Permukaan pelarut dg harga Rf
 Jarak perpindahan n noda komponen
Rf 
Jarak gerak permukaan pelarut
dP dA
Rf  
dA dR
Karakteristik Kertas Kromatografi WHATMANN
Cepat Sedang Lambat
K. Tipis No. 4 7 2
54 1 20
540 - -
K. Tebal No. 31 3 -
17 3 mm -
Pelarut untuk kromatografi kertas
Pemisahan Pelarut Perbandingan
Asam Amino Fenol / air Larutan jenuh
n. butanol / a. cuka / air 4:1:5
n. butanol / a. cuka / air 12 : 3 : 5
n. butanol / piridin / air 1:1:1
F, Cl, Br, I Piridin / air 90 : 10
Sebagai garam Na
Hg, Pb, Cd, Cu, Bi n. butanol / 3M HCl Larutan jenuh
Garam Clorida
BEBERAPA FAKTOR PENENTU Rƒ
1. Pelarut  pentingnya koefisien partisi
2. Suhu  perubahan suhu merubah koefisien
partisi dan kecepatan alir
3. Ukuran bejana  vol. bejana
mempengaruhi homogenitas atmosfer jadi
mempengaruhi kecepatan penguapan
komponen pelarut.

4. Kertas  sesuai jenis berpengaruh thd

keseimbangan partisi.
5. Sifat campuran.
 APLIKASI DATA ANALISIS
1. Substan A dan B mempunyai waktu
retensi tRA = 16,40 tRB = 17,63 menit pada
kolom 30 cm. Lebar dasar puncak A = 1,11
dan B = 1,21 menit. Hitung :
a. RS resolusi kolom
b. N = ∑ rata-rata plate dalam kolom
c. H = tinggi plate orisinil
d. Panjang kolom untuk mencapai RS = 1,5
e. Berapa waktu yang dibutuhkan untuk
mengelusi B dari kolom (d)
f. Berapa tinggi plate dibutuhkan untuk RS =
1,5 pada kolom orisinil 30 cm dan waktu
orisinil
Penyelesaian :
a. Menggunakan rumus R S  2.
t
RB tR A 
WA  WB

R S  2.
17,63  16,40  1,06
1,11  1,21
2
 tR 
b. Persamaan N  16  
W 
2
16,40 
NA  16    3,493
 1,11 
2
17,63 
NB  16    3,397
 1,21 
 3,493  3,397 
NAB     3,445
 2 
 c. HETP  H  L N
30
H  8,7 cm
3,445
d. k’ dan  ≠ berubah dengan kenaikan N
ataupun L  substitusikan N1 dan N2
pada persamaan :
N  k' 
RS    1 
4  1  k ' 
R S1 N1 3,493
   1,06
R S2 N2 3,397
R s  1,06 N  3,445 R S harapan  1,5
2
1,06 3,445  1,5 
  N2  3,445   6,9
1,5 N 1,06 
L  NH  6,9  8,7  60 cm
Elusi B dalam kolom () dengan RS =
1,5 membutuhkan waktu 35 menit.

e. Dengan persamaan
tR1  R S 12

tR 2  R S 22
16.R 2S .H    1  k '3
2
tR   
   1  k '
2

17,63 1,06 2

tR 2  1,5 2
tR 2  35 menit
f. Dari persamaan (e) H1 dan H2
disubstitusikan
tR1 R S12 H1
 . tR1  tR 2
tR 2 R S 2 H2
2

R S12 .H1  R S 2 2 .H2

1,062 .8,7  1,5 2 .H2
2
 1,06 
H2    .8,7 H = H orisinil
 1,5  1

H  4,3 cm H2 = H baru untuk

mencapai RS = 1,5
dg L.tR.orisinil
2. KLT dipakai untuk memisahkan
campuran 3 carbamate insektisida
1) Carbofuran
2) Carbaryl
3
3) Metalkamate
2
Sampel 5 μL larutan mengandung 1
mg/mL setiap komponen dalam 1
CHCl3
Fasa gerak toluen / isoprophyl ether
70% / 30%. KLT 20 x 20 cm
 Cuplikan ditotolkan sebelah kanan
KLT
 Standard dari 3 komponen sebelah
kiri KLT
Dari pengamatan dengan ukuran cm
diperoleh data :
dM = 9,8
dR)1 = 1,7 W1 = 0,57
dR)2 = 2,5 W2 = 0,54 Hitung :
dR)3 = 3,9 W3 = 0,75 a. Rƒ untuk ketiga carbamate
b. Tinggi plate untuk setiap spot (noda)