PENDUKUNG

Chromatography
Billing, Cole and Lathe
Unconjugated
Bilirubin

Open Coloumn
reversed phase
chromatography Bilirubin monoglucoronide

Bilirubine diglucoronide
Tietz 2012
 Chromatography
Kuenzel dkk Unconjugated
bilirubin (α)
Open coloumn Monoconjugated bilirubin (β)
Chromatography
without Diconjugated
deproteinization bilirubin(γ)
Bilirubin fraction bound
strongly to protein (δ)
tietz 2012
 Chromatography
Proses dimana mixture dipisahkan oleh
perbedaan distribusi antara mobile phase dan
stationary phase

• Reversed phase chromatography menggunakan

hydrophobic stationary phase
 Chromatography
Normal phase Reversed phase
 Electrophoresis

free bilirubin
Capillary
electrophoresis
Albumin bound
bilirubin

Electrophoresis 2010
 Electrophoresis
• Penggunaan medan elektrik untuk memisahkan
komponen dalam mixture.
• Capillary electrophoresis dilakukan pada tabung
yang kecil.

Clinical and forensic aplication of capillary

electrophoresis 2001
Electrophoresis
 Direct Spectrophotometry
• Metode untuk neonatus < 2-3 minggu
• Sampel dapat tanpa dilusi dan didilusi
(tergantung alat)
• Pembacaan pada dua gelombang tertentu
• Interferensi oleh komponen serum yang
mengabsorbsi pada gelombang sama.

Ann Clin Biochem 1991

 Spectrophotometry
Photometry = pengukuran cahaya
 Spectrophotometry
• Pengukuran intensitas cahaya pada gelombang
tertentu.
Cahaya
Cahaya
 Beer Lambert Law
• Absorbansi cahaya proporsional dengan
konsentrasi dari solusi dan ketebalan
media/cuvet
Photometry Cobas
Photometry ABX Pentra 400
 Bilirubin
• Pigmen kuning
• Hasil metabolisme
heme.

Tietz 2012
Katabolisme Heme → bilirubin IXα
Bilirubin
Bilirubin

omlc.org
 Preanalitik Bilirubin
• Sampel harus dijaga dari cahaya langsung
• Dianalisis segera karena tidak stabil dalam
suhu kamar (stabil pada suhu kamar > 2jam)

Pedoman Pemeriksaan Kimia Klinik

Kemenkes 2011
Efek Cahaya terhadap Bilirubin

Bilirubin in Clinical Practice : A Review,

Liver international 2008
 Diazotized Sulfanilic Acid
Sulfanilic acid + sodium nitrite DSA

Bilirubin + SDA Direct Azobilirubin

Bilirubin + SDA + accelerator

Total Azobilirubin
 Metode Direct Bilirubin Diazo Modified
Jendrassic Grof
Masukkan ke dalam kuvet Sampel Blank Sampel

Sulphanilic acid 14 mmol/L 1000 µl 1000 µl

Hydrochloric acid 300 mmol/L
Sodium nitrite 25 mmol/L ------ 40 µl
Campurkan merata, tambahkan sampel dalam 2 menit
sampel 100 µl 100 µl
Campurkan, inkubasi dalam suhu ruangan selama tepat 5 menit.
Ukur absorbansi sampel dibandingkan blank.
Metode Direct Bilirubin Diazo Modified
Jendrassic Grof
Konsentrasi bilirubin (mg/dl)= ∆A546 x 13,0
linearitas : hingga 25 mg/dl
jika konsentrasi melebihi 25 mg/dl encerkan 1
bagian sampel dengan 4 bagian NaCl 0,9%.
Hasil dikalikan dengan 5.
 Bilirubin Direk Diazo
Bilirubin terkonjugasi + Diazotized
Sulfanilic Acid

Azuropigmen

Perubahan warna diukur secara

fotometri ~ konsentrasi bilirubin
direk
 Bilirubin Total
Bilirubin + Diazotized Sulfanilic Acid + Akseleran

Azopigmen

Perubahan warna diukur

secara fotometri ~
bilirubin total
Metode Bilirubin Direk Diazo Roche
Acidified sodium nitrite + sulfanilic
acid → diazonium salt

diazotized sulfanilic acid +

conjugated bilirubin → isomer of
azurobilirubin
Intensitas warna merah azobilirubin
diukur secara fotometri λ570/660 nm
~ konsentrasi bilirubin bilirubin direk
 Reagen Diazo Roche
• R1: hydrochloric acid 0,05 mol/L
• R2 :
sulfanilic acid 25,7mmol/L
hydrochloric acid 0,7 mol/L
sodium nitrite 2,7 mmol/L
sodium bicarbonate 13,9 mmol/L
 Metode Diazo Integra 400
• Bilirubin gen 2
bilirubin direk + garam diazonium 3,5
diclorofenil dalam buffer → asam azobilirubin
berwarna merah.
 Metode Vanadate Oksidase
Sampel + reagen vanadate pada PH 3

Bilirubin direct → biliverdin

Penurunan densitas optikal kuning

spesifik bilirubin ~ konsentrasi
bilirubin pada λ 450/546
Biliverdin absorption

omlc.org
Metode Vanadate Oksidase

Wako Chemical GmbH

 Vanadate Oksidase
• Reagen D Bil R1 • Reagen D Bil R 2
Tatrate buffer pH Phospate buffer ph
2,90 mmol/L 7,0 10 mmol/L
Detergen Sodium metavandate
Antimikrobial 4 mmol/L
Preservatif
inhibitor

fda k152343
Cobas Serum indices
 Metode 2,4 Dichloroaniline
ABX Pentra 400 Direk Bilirubin : Photometric

Bilirubin direk + diazotized 2,4 dichloroaniline

komponen azuro warna merah dalam solusi asam

Pentra Horiba
 Reagen ABX Pentra
• Reagen 1
– Edta Na 2 0,1 mmol/L
– NaCl 150 mmol/L
– Sulfamic acid 100 mmol/L
• Reagen 2
– 2,4 Dichlorophenyl-diazonium salt 0,5 mmol
– HCL 900 mmol/L
– EDTA-Na2 0,13 mmol/L
 Pemeriksaan Bilirubin
Integra 400 Pentra ABX 400
• Bil Direct gen 2 (diazo) • Direct CP (DCA)
λ800/546 AMR = 0,04-6,79 mg/dL
Normal :6,7 µl Automatic post dilution
AMR = 0,09-17 mg/dl 33,9mg/dL
Pengenceran otomatis Sampel hemolisis tidak
HI =25 dapat digunakan
LI=750 Tg : intralipid 612,5 mg/dl
Sampel 25 µl/test
 Interferensi Pemeriksaan Bilirubin
• Pemeriksaan pada λ 500-600 nm
• Hemolisis
• Lipemik
Interferensi Pemeriksaan Bilirubin
Hemolisis pada metode Jendrassic dan Grof

Inhibiting
Pseudo
Free hemoglobin diazonium colour
peroxidase
formation

Serum indices cobas roche 2007

 Indeks Serum
• pengukuran berdasarkan nilai absorbans
• merepresentasikan level ikterus, hemolisis atau
lipemia
• semi kuantitatif

Serum indices cobas roche 2007

 Indeks Serum
• Aplikasi Serum Index Gen 2
• Sampel (cobas c501: 6 µl) diencerkan dengan
0,9% NaCl
• Pengukuran absorbansi pada tiga pasang panjang
gelombang
• Hasil Indeks Serum akan dibandingkan dengan
batas interferensi pemeriksaan yang diminta.
Serum Indices Cobas roche 2007
 Indeks Serum

• Lipemia : 660/700 nm,

bebas interferensi lain
• Hemolisis : 570/600nm,
koreksi absorbsi lipemia
• Ikterus : 480/505 nm,
koreksi absorbsi lipemia
dan hemolisis
Serum Indices Cobas Roche 2007
 Indeks Hemolisis
• Dilaporkan dalam Indeks H
yang linear hingga 1000 mg/dl

Serum Indices Cobas Roche 2007

 Interferensi Hemolisis
• Peningkatan konsentrasi analit intraselular
(kalium, LDH, SGOT)
• Spectral interference karena hemoglobin
mengabsorbsi cahaya sangat kuat pada λ
415nm.
• Secara kimia mengganggu pengukuran analit
secara langsung atau tidak langsung.
Indeks Hemolisis
 Indeks Ikterik
• Dilaporkan dalam Indeks I yang
linear hingga 60 mg/dl

Seum Indices Cobas Roche 2007

 Interferensi Ikterik
• Spectral interference
Bilirubin mengabsorbsi λ 340 nm dan 500 nm
• Chemical interference
dapat mengganggu reaksi yang menggunakan H202
karena bilirubin ikut bereaksi (pemeriksaan glucosa,
cholesterol,trigliserida dan asam urat)
Interferensi ikterik
Indeks Ikterik
 Indeks Lipemik
• Pengukuran berdasarkan turbiditas bukan
jumlah trigliserida.
• Dilaporkan dalam indeks L linear hingga
2000 mg/dl solusi Intralipid®
 Interferensi Lipemik
• Spectral Interference oleh karena pembauran
cahaya dan gangguan terhadap transmisi cahaya
melalui sampel dan reagen yang bereaksi.
Terutama oleh VLDL dan kilomikron.
• Volume depletion effect
• Physico chemical effect
Indeks Lipemik
 Interferensi Paraprotein
• Reagen dan paraprotein membentuk presipitat
putih yang tidak larut yang memiliki absorbansi
pada gelombang tertentu

Clinical chemistry 2004,2005, Clin Biochem 2008

 Interferensi Paraprotein
• Cek serum secara visualisasi
• Cek ikterik indeks
• Ulangi pemeriksaan dan lakukan pengenceran
• Ulangi pemeriksaan dengan serum ultrafiltrat
• Ulangi pemeriksaan dengan metode yang
berbeda
• Lihat riwayat sebelumnya dan klinis pasien
Archieves of pathology and Laboratory Medicine 2003,
Clinical Chemistry 2004,2005, 2015
 δ Bilirubin
Bilirubin yang berikatan kovalen
dengan protein

Bereaksi secara direct dengan

reagen diazo

Akumulasi lama bil terkonjugasi

Analytical Measurement Range
• Rentang hasil analit yang dihasilkan suatu
metode secara langsung tanpa perlakuan
spesial pada sampel sebelumnya seperti
pengenceran, yang bukan merupakan proses
analitik yang biasa dilakukan.
Phlebotomy
Phlebotomy
Phlebotomy
Terima Kasih