KROMATOGRAFI KOLOM

DAN
KROMATOGRAFI CAIR VAKUM
Oleh:
Laili Khairani
Dian M
Sri A
Jopin Beatrice
Alvin
Sandra Monica 161501104
Sarah H
Apni
Taufiq
Lasromauli
 KROMATOGRAFI KOLOM
• Kromatografi kolom merupakan teknik
kromatografi yang paling awal yang pertama
kali dilakukan oleh D. T. Davy untuk
membedakan komposisi minyak bumi.
• Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom
merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi.
• Kromatografi kolom digolongkan kedalam
kromatografi cair – padat (KCP) kolom terbuka.
 PRINSIP KROMATOGRAFI KOLOM
• Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi
didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen
campuran dengan afinitas berbeda-beda
terhadap permukaan fase diam.
• Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara
pemisahan cair-padat. Substrat padat (adsorben)
bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak
larut dalam fase cair.Fase bergeraknya adalah
cairan (pelarut) yang mengalir membawa
komponen campuran sepanjang kolom.
• Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi
ialah bahwa komponen – komponen dalam zat
contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas
yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom.
• Apabila dialirkan cairan ( eluen ) secara kontinyu
melalui kolom yang berisi sampel yang telah
diadsorpsikan oleh fase diam, maka yang pertama –
tama dielusi oleh eluen ialah komponen yang paling
lemah terikat kepada adsorben.
• Komponen – komponen lainnya akan dielusikan
menurut urutan afinitasnya terhadap adsorben,
sehingga terjadi pemisahan daripada komponen –
komponen tersebut.
• Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi
kolom didasarkan pada afinitas kepolaran analit
dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu
memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase
diam.

• Pada sebagian besar kromatografi kolom

menggunakan fase diam yang bersifat polar
dengan fase gerak yang non-polar dengan
begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat.
• Semakin cepat pergerakan fase gerak akan
meminimalkan waktu yang diperlukan untuk
bergerak di sepanjang kolom.
• Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan
memperluas aliran eluen di dalam kolom dengan
mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi
dengan mengontrol keran.
• Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan
menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas
dengan kompresi (misalnya udara, nitrogen, dan
argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom.
 CARA KERJA KROMATOGRAFI KOLOM
1. Pembuatan Kolom (Packing)
• Kolom biasanya berbentuk seperti buret untuk
titrasi, ukurannya beragam. Perbandingan
panjang kolom sekurang-kurangnya 10 kalinya
diameternya.
• Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan
cara basah atau cara kering. Cara basah lebih
mudah untuk memperoleh packing yang
memberikan pemisahan yang baik.
• Cara Basah:
– Kedalam ujung kolom kromatografi diletakkan
gelas wool, tidak perlu ditekan kuat.
– Diatasnya ditaburkan pasir sehingga membentuk
lapisan tebal + 1 cm.
– Di dalam beker gelas dibuat bubur fase diam
dengan fase gerak. Dengan bantuan batang
pengaduk bubur dimasukkan kedalam kolom.
Sambil diketuk-ketuk butir-butir fase diam akan
turun dan tersusun rapi didalam kolom.
– Bila kolom penuh dengan fase gerak, keran dibuka
untuk menurunkan permukaannya dan fase gerak
yang keluar dapat digunakan lagi untuk membuat
bubur fase diam.
– Packing dihentikan sampai panjang kolom yang
dikehendaki. Selapis pasir diletakkan pada packing
kolom untuk melindungi kolom.
– Kolom dijaga untuk tidak kering, maka diatas lapisan
pasir harus selalu ada selapis fase gerak.
– Pada proses packing ini dinding luar kolom gelas
disemprot dengan aseton. Penyemprotan
dimaksudkan untuk mendinginkan kolom sehingga
menghambat terbentuknya gelembung udara.
– Kolom ini digunakan setelah disimpan semalam.
• Cara Kering:
– Selapis pasir diletakkan didasar kolom, kemudian
fase gerak dimasukkan lapis demi lapis sampil
ditekan dengan karet atau alat penekan lain.
– Diatas fase diam diletakkan kertas saring dan
diatasnya lagi selapis pasir.
– Pada posisi keran terbuka fase gerak dituangkan
dan dibiarkan mengalir keluar.
– Packing kolom disimpan dengan mempertahankan
selapis fase gerak berada diatas lapisan pasir.
2. Penyiapan Sampel
– Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang
sesuai, kemudian dituangkan hati-hati diatas packing
kolom.
– Fase gerak dikeluarkan tetes demi tetes, diatur kecepatan
menetesnya (tergantung besar-kecilnya kolom) dan dijaga
kolom tetap terendam, untuk itu ditambah fase gerak
perlahan-lahan dan dijaga tidak merusak packing kolom.
– Fase gerak yang keluar ditampung sebagai fraksi.
– Volume fraksi tergantung berat sampel dan pemisahan
yang nampak pada kolom saat proses awal elusi ini. Makin
kecil volume fraksi, akan diperoleh pemisahan yang lebih
baik, namun akan dikumpulkan banyak fraksi.
– Cara meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik
adalah dengan mencampur dengan fase diam.
– Satu bagian sampel dilarutkan dalam pelarut yang
sesuai, biasanya pelarut yang digunakan adalah
pelarut yang digunakan untuk pembuatan ekstrak.
– Larutan ekstrak ini kemudian dicampur dengan 2,0-
3.0 bagian fase diam, dengan hati-hati campuran ini
dikeringkan didalam rotary evaporator hingga
diperoleh serbuk ekstrak kering.
– Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom dan
ditutup dengan selapis pasir. Selanjutnya sampel siap
dielusi.
3. Elusi (Pengembangan)
– Fase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan
cara dituangkan sedikit demi sedikit atau dialirkan
dari bejana yang diletakkan diatas kolom sehingga
fase gerak mengalir dengan sendirinya.
– Cara yang praktis adalah dengan memasukkan ke
dalam corong pisah, ujung corong pisah
dimasukkan ke dalam kolom dan ujung lain
ditutup, sedangkan keran terbuka.
• Elusi dibagi menjadi 2 bagian:
– Elusi gradien
– Elusi isokratik
• Elusi dihentikan jika sudah tidak ada lagi
sampel yang dapat dibawa keluar oleh fase
gerak.
• Bila digunakan elusi gradien, elusi dihentikan
jika penggunaan fase gerak sudah sampai yang
paling polar.
4. Mendeteksi Komponen yang Dipisahkan
• Yang umum digunakan dan mudah dikerjakan
adalah dengan memonitor fraksi dengan KLT.
• Fraksi yang mempunyai profil bercak KLT yang
mirip digabungkan. Selanjutnya gabungan ini
dapat dianalisis lebih lanjut.
 KELEBIHAN DAN KEKURANGAN
KROMATOGRAFI KOLOM
• Kelebihan:
– Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi
preparative
– Digunakan untuk menentukan jumlah komponen
campuran
– Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
• Kekurangan:
– Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan
teknik dan manual
– Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama
(time consuming)
 KROMATOGRAFI CAIR VAKUM (KCV)
• Kromatografi Suction Column atau vacuum liquid
chromatography (VLC) atau kromatografi cair vakum
(KCV) adalah bentuk kromatografi kolom khususnya
berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap
suatu ekstrak.
• Kondisi vakum adalah alternatif untuk mempercepat
aliran fase gerak dari atas ke bawah. Metode ini
sering digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu
ekstrak non polar atau ekstrak semipolar.
• Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan
atmosfer atau pada tekanan lebih besar dari atmosfer
dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya
gas nitrogen.

• Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan

golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar
dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan
berbagai perbandingan pelarut, seperti: n-heksana :
etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan
pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen
 PRINSIP KCV
• Prinsipnya yaitu adsorpsi dan partisi yang dipercepat
dengan bantuan pompa vakum, dimana pemisahannya
didasarkan pada distribusi senyawa-senyawa yang akan
dipisahkan diantara fasa diam dan fasa gerak dengan
perbandingan yang berbeda-beda.
• Pemisahan fraksi berdasarkan pelarutnya.
Agar fraksi tertentu turun, maka harus ditingkatkan
kepolarannya dari non polar, sedikit polar, semi polar, agak
polar sampai polar. Hal ini dikarenakan didalam sampel itu
terdapat senyawa yang berbeda kepolarannya.
 CARA KERJA KCV
• Adapun cara kerja kromatografi cair vakum
yaitu kolom kromatografi dikemas kering)
dalam keadaan vakum agar diperoleh
kerapatan kemasan maksimum.
• Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya
rendah dituangkan ke permukaan penjerap
lalu divakumkan lagi.
• Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang
digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam
kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu cara basah dan
cara kering.
• Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan
denganmelarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan
digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam
kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir
hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata,
kemudian aliran dihentikan.
• Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan
cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam
kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya
dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan.
• Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga
memiliki berbagai metode seperti preparasi fasa
diam.
• Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan:
– Melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan
sebagai fasa gerak dalam KCV.
– Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang
telah terisi fasa diam.
– Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa
diam yang sama.
• Sedangkan cara kering dilakukan dengan:
– Mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam
yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk.
– Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah
terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase
diam yang sama
 KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KCV
• KELEBIHAN
1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-
100μl/menit)
2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer
massa
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut
lebih pekat karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat
jika jumlah sampel terbatas
• KEKURANGAN
1. Membutuhkan waktu yang cukup lama
2. Sampel yang dapat digunakan terbatas.