Kromatografi

• DEFINISI
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut
diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase.
 Kromatografi

Padat Pertukaran Ion Fasa Diam Gel

Gas Cair Cair Fasa Gerak Cair

Anion Kation GPC

Plat Kolom
 Contoh Chromatography
Liquid Chromatography
digunakan untuk identifikasi pigmen tumbuhan atau
komponen lain

Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau gelas kaca untuk
memisahkan komponen kimia dan bahan lainnya

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia zat-zat yang tidak
diketahui, seperti senyawa berbeda dalam bensin yang ditunjukkan
oleh tiap-tiap puncak dalam grafik di bawah ini.
Paper Chromatography
Dapat digunakan untuk memisahkan komponen-
komponen tinta, pewarna, senyawa tumbuhan
(klorofil), make-up, dan banyak zat lain
Kromatografi Cair-Cair
 Kromatografi Cair-Cair
 Ada dua macam sistem penggunaan dalam kromatografi cair-cair :

1. kromatografi fasa normal

fase gerak → non polar ( ex: heksana, isopropil-eter)
fase diam → sangat polar (ex: air)

digunakan untuk memisahkan senyawa polar, sebab senyawa polar

akan tertahan lebih lama didalam kolom yang polar, sedangkan
senyawa yang non-polar akan keluar lebih awal dari dalam kolom.
• 2. Kromatografi fasa terbalik
fase gerak → polar ( ex: air, metanol)
fase diam → non polar (ex: hidrokarbon oktadekana)

digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa non polar.

 Analisa Kualitatif

• Dasarnya adalah waktu retensi atau volume retensi suatu senyawa.

• Membandingkan t atau V senyawa dalam sampel yang dianalisis dengan t atau V
suatu senyawa standar (yang telah diketahui)
 Analisis Kuantitatif

• Metode pengukuran tinggi puncak

Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang
membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada
rumus pengukuran tinggi suatu segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik
tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram
tersebut.
 Kromatografi Kertas

fase diam → kertas serap

Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku
rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Kromatografi Kertas (lanjutan)
 Kromatografi Kertas Dua Arah

• Digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan substansi yang memiliki

nilai Rf yang sangat serupa.

• Menggunakan dua pelarut yang berbeda

 Kromatografi Lapis Tipis

• Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah
lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.

• Fase diam → Jel silika (atau alumina) atau substansi yang dapat berpendarflour
dalam sinar ultra violet.
• Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Kromatografi Lapis Tipis
(lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian
bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran
pewarna ditempatkan pada garis itu.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan

ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi
pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu
diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis
dimana posisi bercak berada.

Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah kondisi

dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut.
Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia
dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Kromatografi Lapis Tipis
(lanjutan)
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan
rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen berwarna

merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal,
sementara pelarut berjarak 5.0 cm,
sehingga nilai Rf untuk komponen
berwarna merah menjadi:
Analisis Sampel yang Tidak
Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali

memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya,
supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan
sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada

kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak
tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Ketika sinar
UV diberikan pada lempengan, akan timbul pendaran
dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Analisis Sampel yang Tidak
Berwarna
2. Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-
bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat
kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah
contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari
campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan

ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan
senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan
kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia
dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada

kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak
daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
(kromatografi kolom terbuka)
Pada kromatografi lapisan tipis, terdapat lapisan tipis (
tebal 0.1-2 mm ) yang terdiri atas bahan padat yang
dilapiskan kepada permukaan penyangga datar ( plat ),
yang biasanya terbuat dari kaca, tetapi dapat pula
terbuat dari plat polimer (PLASTIK) atau logam

dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber

 PRINSIP
• Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi
yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya
• Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran
fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.
 Apa bedanya dengan kromatografi kertas?
• Pada dasarnya kromatografi lapis tipis (KLT atau TLC = Thin layer Chromatography)
sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya.
Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahannya, yakni digunakan lapisan tipis
adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium atau plastic sebagai
pengganti kertas. Lapisan tipis adsorben ini pada proses pemisahan berlaku sebagai
fasa diam.
Apa kelebihan dan kekurangannya dibanding
kromatografi kertas?

KLT KKT
Lebih serbaguna
dibanding kromatografi Hanya untuk senyawa
kertas, pemisahan senyawa terbatas
komponen senyawa
lebih sempurna

Pembuatan lempengnya
memerlukan waktu
Pembuatan fase diam
kecuali bila telah
lebih sederhana
tersedia secara
komersial
 Faktor faktor yang memengaruhi gerakan media
dalam KLT
• Struktur kimia dan senyawa yang dipisahkan
• Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya
• Suhu dan kesetimbangan
• Pelarut dan derajat kemurnian fase bergerak
• Derajat kejenuhan
 BAGAIMANA MEMBUAT FASE DIAM?
Penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi
bentuknya baik, biasanya digunakan plat kaca / aluminium.
Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis dari pemisahan
yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi.
Seringkali bentuk plat kaca / aluminium dijual dengan ukuran
20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai
“standard”.
Hal yang penting penting yaitu bahwa permukaan dari plat
harus rata.
Plat -plat kaca / aluminium sebelum dipakai dicuci terlebih
DO YOU KNOW HOW TO MAKE AN ADSORBER?

 bahan penyerap dicampur dengan air sampai menjadi bubur, biasanya dengan
perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air.
 Bubur diaduk sampai rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara.
 Tebal lapisan merupakan faktor yang paling penting dalam kromatografi lapisan
tipis. Tebal standard adalah 250 micron (250 X 10-6 meter)
 Lapisan-lapisan yang lebih tebal ( 0.5 - 2.0 mm ) digunakan untuk pemisahan-
pemisahan yang sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg
untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm.
 Kalau lebih tebal dapat mengelupas.
Gambar plat pendukung
 Di bawah ini sudah ada yang siap pakai

Penyerap Medium bubur penyerap Perbandingan, gram dalam ml

Silika gel Metilena klorida : methanol (2:2, v/v) 35 gr dalam 100 ml

Serbuk selulosa Metilena klorida : methanol (50:50, 50 gr dalam 100 ml

v/v)

Alumina Metilena klorida : methanol (70:30, 60 gr dalam 100 ml

v/v)
SIFAT DASAR BEBERAPA ADSORBEN
 Berikut ini daftar daftar senyawa beserta fase
diam yang suitable untuk pemisahan
Zat padat Digunakan untuk memisahkan
Silika Asam- asam amino, alkaloid, gula,

asam-asam lemak, lipida, minyak

esensial, anion, dan kation organic,

sterol, terpenoid.
Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,

vitamin-vitamin, karoten, asam-asam

amino
Kieselguhr Gula, oligosakarida, asam- asam

lemak, trigliserida, asam -asam

amino, steroid.
Bubuk selulosa Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida
Pati Asam-asam amino
Sephadex Asam-asam amino, protein
 mekanisme pemisahan
Potong plat sesuai ukuran. Biasanya untuk satu spot
menggunakan plat selebar 1 cm.
Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm
dari ujung bawah plat, dan garis akhir di bagian atas.
Bubuhkan zat yang akan dipisahkan tepat di atas base line.
(jika zat itu padat, larutkan dulu ya!)
Siapkan fase bergerak dalam wadah (gunakan chamber!)
Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line
jangan sampai tercelup oleh eluen.
Chamber jangan lupa ditutup ya!
 Pewarna tertentu?
• Kalium kromat, asam sulfat pekat dalam alcohol 96% atau ninhidrin.
 BAGAIMANA MENDAPATKAN KOMPOSISI FASE
GERAK YANG BAIK?
• CARI DI LITERATUR
• LAKUKAN PERCOBAAN
• LAKUKAN ELUSI DENGAAN FASE GERAK PALING NON POLAR
• LAKUKAN KENAIKAN SECARA GRADIEN
• EVALUASI HASIL, DAN TENTUKAN KOMPOSISI YANG PALING BAIK
 PENAMPAK BERCAK KIMIA
BERDASARKAN SIFATNYA
• PERMANEN : ASAM SULFAT PEKAT DAN NINHIDRIN
• SEMENTARA : UAP IODIUM
BERDASARKAN SPESIFIKASINYA
SPESIFIK : NINHIDRIN UNTUK ZAT DENGAN ATOM N
(PROTEIN, ALKALOID, DLL)
UMUM : UAP IODIUM, ASAM SULFAT PEKAT (HAMPIR SEMUA
ZAT)
Gambaran singkat mekanisme pemisahan
Ini salah satu contoh kromatogram
kromatografi