1

1. Sebutkan komponen replikasi

2. Apa tujuan replikasi
3. Apa fungsi enzim primase pada proses
replikasi
4. Apa fungsi DNA polymerase pada proses
replikasi

2
 Teknologi DNA rekombinan (TDR) adalah
teknologi yang menggabungkan molekul
DNA dari organisme berbeda yang
diinsersikan ke dalam organisme lain yang
berperan sebagai sel inang untuk
memproduksi kombinasi genetik baru yang
bernilai bagi ilmu pengetahuan, pengobatan,
agrikultur dan industri
 Rekayasa genetika dari proses bioteknologi
natural
3
 Bagaimana membuat bakteri menghasilkan
insulin manusia
 Bagaimana menghasilkan angiopoietin dari
tikus transgenik

4
 Tahapan TDR
 Kloning gen
TDR I
▪ Isolasi gen
▪ Ligasi
TDR II
▪ Transformasi
▪ Karakterisasi
 Overekspresi gen

5
 Klon
 Sekelompok organisme yang memiliki sifat yang
identik secara genetik
 Klon dapat dibuat dengan cara
menginsersikan suatu gen berupa fragmen
DNA ke dalam molekul DNA lain (vektor)
yang mampu membuat molekul DNA
tersebut bereplikasi di dalam suatu sel hidup
sederhana, seperti bakteri
6
 Isolasi gen bertujuan untuk memperoleh fragmen
DNA yang membawa kode genetik yang dapat
menghasilkan protein tertentu
 Isolasi gen dapat dilakukan dengan metode PCR dan
menggunakan enzim restriksi
 PCR = Polymerase Chain Reaction
 Enzim restriksi
 Enzim endonuklease yang dapat memotong ikatan untai
DNA secara spesifik pada urutan basa tertentu (biasanya
4-6pb)
 Urutan pasangan basa yang dapat dipotong memiliki
urutan yang sama jika dibaca dari depan maupun
sebaliknya (palindrom)
 Contoh: urutan pasangan basa yang dikenali oleh enzim
ecoRI adalah GAATTC
7
8
 Polymerase Chain Reaction
 Ditemukan oleh Kary Banks Mullis (1985)
 Nobel prize in 1993
 Proses replikasi/amplifikasi DNA secara in vitro
 Komponen PCR
 Templat DNA
 DNA polymerase
▪ Taq  Thermus aquaticus
▪ Tma  Thermotoga maritama
▪ Pfu  Pyrococcus furiosus
 Primer
 dNTP
 MgCl2
 Buffer
9
 Proses PCR menggunakan alat yang disebut
‘thermocycler’
 Alat PCR pada prinsipnya hanya mengatur
suhu agar proses replikasi dapat terjadi di
tabung reaksi sama dengan proses yang
terjadi di dalam sel tubuh
11
 Tahapan PCR
 Denaturing
▪ Proses terpisahnya untai ganda DNA menjadi untai tunggal
▪ Proses denaturasi ini dilakukan dengan mengkondisikan DNA
pada suhu tinggi yaitu 94-100 C (suhu tinggi dapat
memisahkan untai DNA)
 Annealing
▪ Proses menempelnya primer pada DNA target (30-65 C)
 Extension
▪ Proses pembuatan DNA baru oleh DNA polymerase (72 C)
 Produk PCR = Amplikon
 dinyatakan dengan satuan pb (pasangan basa) atau
bp (base pair)
12
13
www.openwetware.org

15
 Primer
 Untai nukleotida sintetik yang mengenali fragmen
DNA target sekaligus menyediakan 3’OH bebas
agar DNA polymerase dapat melakukan fungsinya
membuat untai DNA baru
 Berpasangan, namun tidak identik dan tidak
komplemen
 Selalu dituliskan dari 5’  3’
 Sehingga dapat dinyatakan bahwa Amplikon
adalah daerah yang dibatasi oleh primer
16
17
18
 Primer dapat menempel pada DNA target
yang komplemen dengan urutannya pada
suhu tertentu berdasarkan
 Urutan (sequence) primer
 Konsentrasi primer
 Panjang primer
 Pengaruh lingkungan ionik
 Suhu annealing  TM (Melting Temperature)

19
 TM dapat dihitung secara manual dengan
rumus
TM = 4 (G+C) + 2 (A+T)
 Suhu annealing yang dapat digunakan pada
optimasi proses PCR adalah TM + 5-10°C

http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g
20
 Untuk melakukan proses PCR kita tidak perlu mengetahui
seluruh urutan nukleotida gen. kita hanya perlu mengetahui
ujung-ujungnya untuk pembuatan primer

(Primer Reverse) 3’TTGGCCAA5’

5’TTAACGGCCTTAA . . …………. TTTAAACCGGTT3’
3’AATTGCCGGAATT……………..AAATTTGGCCAA5’
5’TTAACGGCC3’ (Primer Forward)
a. Buat pasangan untai DNA tersebut!
b. Tentukan sepasang primer yang dapat
digunakan untuk PCR dengan menggunakan
DNA templat di atas (@ 10-mer)!
c. Berapa suhu annealing primer yang digunakan?
d. Bagaimana rancangan proses PCR yang dapat
dibuat?
e. Berapa panjang amplikon?
22
23
 Elektroforesis DNA
 Penentuan UKURAN nukleotida
 Sekuensing
 Penentuan URUTAN nukleotida

24
 Elektroforesis adalah proses pemisahan karena adanya perbedaan
muatan listrik (kutub +/-)
 DNA memiliki gugus fosfat yang bermuatan negatif sehingga DNA akan
bergerak dari kutub (-) ke kutub (+)
 Untuk mengkarakterisasi DNA maka digunakan gel untuk media
pergerakan DNA yang terbuat dari agarosa, akrilamid, atau campuran
keduanya
 DNA akan bergerak melalui pori-pori gel
 Semakin besar ukuran DNA maka pergerakan DNA melalui pori-pori gel
akan semakin lambat
 Karena itu proses elektroforesis gel dapat memisahkan DNA
berdasarkan ukurannya
 Untuk dapat menggunakan metode deteksi ini, kita harus
mengetahui ukuran produk PCR yang akan dihasilkan
 Sebagai pembanding ukuran digunakan marka DNA berisi
fragmen-fragmen DNA yang telah diketahui ukurannya
 Elektroforegram (hasil elektroforesis) membentuk pita-pita
DNA yang untuk bisa melihatnya Gel harus ditambahkan
Etidium Bromida (EtBr) dan gel di lihat dibawah sinar UV
 EtBr bisa berikatan dengan DNA dan bisa terlihat di bawah
sinar UV
27
 www.phschool.com

http://www.youtube.com/watch?v=96Gss_YVo84
28
 Pada proses elektroforesis hanya bisa
mengkonfirmasi ukuran dari fargmen produk
PCR tetapi untuk lebih meyakinkan dilakukan
sequensing untuk mengetahui urutan
nukleotida
 Sequensing dapat dilakukan dengan:
 Metode Sanger
 Metode Maxam-Gilbert
http://www.youtube.com/watch?v=bEFLBf5WEtc 30
Proses Diagnosis Klinis di Laboratorium
 PCR mempunyai kecepatan, spesifisitas dan sensitifitas yang tinggi sehingga
dapat digunakan untuk diagnosis penyakit
 Deteksi Mycobacterium tubercolosis
 Deteksi virus Hepatitis B
 Deteksi Mycoplasma pneumonia

 Pada prinsipnya proses deteksi ini menggunakan sepasang primer yang bisa
mengenali secara spesifik mikroba yang bersangkutan. Hasil PCR positif
menunjukan adanya infeksi mikroba tersebutdalam sampel yang diuji
 Penggunaan metode PCR untuk diagnosa memiliki banyak kelebihan
diantaranya; butuh waktu yang lebih cepat, serta spesifisitas dan sensitifitasnya
lebih tinggi
Sintesis Gen/Fragmen DNA tertentu yang diinginkan
untuk proses rekayasa genetika
Contohnya
 Isolasi gen pengkode insulin dan kromosom sel beta di
pankreas
 Isolasi gen pengkode HbsAg untuk pembuatan vaksin
rekombinan pencegah infeksi Hepatitis B
Analisis DNA bagi keperluan deteksi atau
penentuan garis keturunan
 Aplikasi PCR untuk keperluan forensik banyak
digunakan karena spesifisitas dan sensitifitas (bisa
mendeteksi sampel sedikit) PCR yang tinggi
 Identitas seseorang dapat terdeteksi hanya dari
puntung rokok dari TKP (sel epitel bibir)
34