KROMATOGRAFI

High Performance Liquid Chromatography

Gas Chromatography
 HPLC  Improvement from Column Liquid Chromatography
 Pumps technology
 Injection valves
 Detectors
 Mampu memisahkan senyawa-senyawa yang sangat
serupa dengan baik (resolusi tinggi)
 Tingkat kepekaan analisis deteksi yang tinggi

 Presisi yang tinggi

 Waktu pemisahan (deteksi) yang singkat

SKEMA HPLC
 Menghantarkan
FASE
BERGERAK
masuk ke
dalam system
dengan laju
yang terkontrol,
akurat, dan
tepat (biasanya
0.4–1 ml/min)
 Memasukkan sampel ke dalam FASE BERGERAK
sehingga terbawa ke dalam kolom.
 Valve injectors  mengatur pemasukan sampel ke
dalam High Pressure eluent
Kolom HPLC (dg pelindung logam
stainless)
 -inert surface -resin gel yang berpori
-resin gel yang berpori
-mengikat silika,
-untuk
polyBM
(stirena
<<< divinil
lebih benzena)
besar
-untuk BM >>>

silica organoklorosilan
 A detector translates sample concentration
changes in the HPLC column effluent into electrical
signals
 The most widely used HPLC detectors are based
on ultraviolet-visible (UV-Vis) and fluorescence
spectrophotometry.

VIDEO
 A detector provides an electronic signal related to
the composition of the HPLC column effluent. It is
the job of the last element in the chain of HPLC
instrumentation to display the chromatogram, and
integrate the peak areas.
 Berdasarkan fase stationer (kolom) dan fase mobile (eluen)
yang digunakan, dikenal 2 tipe proses kromatografi :
Kromatografi FASE NORMAL
Fase stationer : POLAR
Fase mobile : NON POLAR
Kromatografi FASE TERBALIK (Reverse phase)
Fase stationer : NON POLAR (kolom C18 dll)
Fase mobile : POLAR
 Normal Phase Reversed Phase
Fasa diam Fasa gerak Fasa diam Fasa gerak
(polar) (non polar) (non polar) ( polar)
silika heksana, Oktadesil water
(modifikasi metilen (ODS) (C18), mixed with
permukaan klorida. oktil (C8), metanol,
dengan butil (C4). asetonitril,
amino, tetrahidrofu
hidroksil) ran.
aplikasi : polifenol dalam aplikasi : protein, lemak,
bahan alam, vit. A, D, E, K. vit. B6
 Solvent (Eluent) harus bebas dari gelembung udara,
untuk menghindari aliran fase mobile
-
 Solvent harus difiltrasi dan bebas dari elektolit Cl karena
akan membentuk ENDAPAN pada pompa
Analisis Catechins dalam Sampel Teh
Catechins
 Rumus dasar :

luas area sampel Q

Kdr Q = ---------------------------- x kdr std Q
luas area standar Q
RESPON
Kromatogram IDEAL

Kromatogram NON
IDEAL

RETENSION
TIME
Kromatogram NON IDEAL :
 Komponen yang dipisahkan memiliki karakteristik
(polaritas dan berat molekul) yang hampir sama
 Sebagai akibatnya, kadar masing-masing komponen
tidak dapat ditentukan secara pasti
Faktor penyebab kromatogram NON IDEAL:
 Kolom (fase stationer) kurang panjang
 Bahan pengisi kolom ukuran partikelnya terlalu besar
 Fase mobil yang digunakan kurang tepat
 Kecepatan aliran fase mobil terlalu cepat
 Resolusi :
kemampuan kolom kromatografi untuk memisahkan zat
berdasarkan senyawa – senyawa penyusunnya
 Resolusi dikategorikan BAIK, apabila nilai R > 1.5
 Resolusi yang baik sangat mendukung ketepatan (presisi)
hasil analisa kuantitatif

t2
2 (t 2 – t 1)
t1
R= --------------------
W1 + W2

W1 W2 Base Line
KROMATOGRAFI GAS-CAIRAN
 Syringe

K OLOM DETEKTOR AMPLI

MANO
METER

OVEN
GAS PEMANAS RECORDER
PEMBAWA
 Inert
 Umumnya adalah HELIUM, NITROGEN, HIDROGEN
atau ARGON
 Harus memiliki tingkat kemurnian yang tinggi
 Aliran perlu diatur, kompresi akan menyebabkan aliran
gas di dalam kolom tidak stabil

 Injeksi sampel antara 1-3 mikro liter.

 Berupa pipa, berukuran kecil :
1. Packed Column
2. Open Tubular Column
 Suhu kolom menentukan profil pemisahan senyawa-
senyawa penyusun sampel
 Kolom umumnya bersifat lebih efisien pada suhu yang
tinggi
 Suhu yang terlalu tinggi akan menyebabkan resolusi
yang buruk

di dalam oven, GC akan diprogram lajunya hingga mencapai maksimum

temperatur boiling point. biasanya 2-10 derajat celcius/min.
 Capillary Column
Packed Column - dinding lebih tipis
- panjang : 0,5-5 meter -diameter : 0,1-0,7 mm
-diamater : 2-4 mm -panjang : 13-100m.
- cairan yang yang terlapis pada material -umumnya diameter lebih kecil
inert. Umunya terbuat dr logam (Al, Cu) => fast analysis
 WCOT : fasa diam berupa cairan kental
dilapiskan pada dinding kolom.
SCOT : silika atau alumina ditempatkan pada
dinding kolom, lalu dilapisi cairan kental
sebagai fasa diam untuk meningkatkan luas
permukaan
PLOT : partikel zat padat berpori yang
diletakkan pada dinding kolom sebagai fasa
diam

Kolom kapiler lebih kecil dan panjang

daripada kolom pak. Umumnya terbuat dari
gelas berbahan dasar silika yang mempunyai
sedikit gugus silanol (Si-O-H). Diameter
kolom terbuka berkisaran antara 0,1-0,7 mm
dan panjangnya berkisar 13-100m.
 Peak Nama Senyawa Titik Didih
1 n Propan - 42 oC
2 n Butan - 0.5 oC
3 n Pentan 36 oC
4 n Hexan 69 oC
5 n Heptan 98 oC
6 n Oktan 126 oC
7 Bromoform 150 oC
8 Chloro Toluene 162 oC
9 Bromo Toluene 184 oC
 2
4 Kondisi Operasi :
1 3
5 Suhu Stabil, 45oC

Waktu

5
Kondisi Operasi :
6 7 8
Suhu Stabil, 120oC

Waktu
 4
2 6
7 8
1 3 5 9

Waktu
Kondisi Operasi :
Gradien Suhu
30oC tiap 5 menit
Rs = kemampuan kolom untuk memisahkan
komponen-komponen cuplikan
Rs yang baik lebih dari 1,5
Rs besar, pemisahan baik
W = lebar dasar puncak
Bagaimana kesimpulan terhadap hasil Rs berikut?