INSTRUMEN

LABORATORIUM
SEROLOGI
Martina Kurnia Rohmah, S.Si., M.Biomed
 OUTLINE
1) PCR (Polymerase Chain Reaction)
& Electrophoresis

2) ELISA (Enzyme
Linkage Immuno-
Sorbance Assay)
 PCR
(Polymerase Chain
Reaction)
 Amplifikasi DNA

Amplifikasi DNA merupakan penggandaan sekuens DNA

yang identik (replikasi)

Amplifikasi DNA

In Vivo In Vitro
(Cloning) (PCR)
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR (Polymerase Chain Reaction) atau Reaksi Polimerase Berantai
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu
sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama
kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985.

Fungsi PCR : membentuk cetakan

DNA berulang kali untuk berbagai
tujuan, misalnya isolasi dan
mengetahui ekspresi gen, diagnosis
penyakit, menguji kekerabatan
spesies secara genetis, untuk
kepentingan forensik dll
 Prinsip Dasar PCR
Prinsip Dasar PCR : pelipatgandaan segmen DNA target (target) dalam tabung
reaksi dengan bantuan enzim DNA polymerase.

 Pelipatgandaan DNA in vitro

dilakukan dengan menambahkan
primer (sepotong DNA pendek yang
berpasangan dengan DNA target
pada kedua ujung target)
 Primer tersebut akan mengalami
pemanjangan dengan bantuan DNA
polymerase yang diikuti oleh
amplifikasi (perbanyakan DNA)
Eksponensial Amplifikasi DNA

Amplifikasi DNA melalui beberapa siklus

 Pre PCR, PCR, dan Post PCR
(PCR Konvensional)
Pre PCR PCR Post PCR
- Preparasi reagen
- Preparasi spesimen
(Hasil Isolasi DNA
atau RNA)
1. Denaturasi
2. Annealing
3. Extension
Deteksi Hasil PCR
dengan Elektroforesis
 Tahap Pre PCR
Preparasi Bahan atau Komponen yang
digunakan dalam metode PCR:
1) DNA Cetakan merupakan fragmen DNA (gen)
yang akan diperbanyak
2) Primer merupakan sekuens oligonukleotida
pendek (15-25 basa nukleotida)
yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai
DNA
3) dNTPs (Deoksiribonukleotida trifosfat) terdiri
atas dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP,
merupakan bahan-bahan untuk mensintesis
moklekul nukleotida DNA baru
4) Enzim DNA Polymerase (Taq Polymerase)
merupakan enzim yang melakukan katalis
reaksi sintesis rantai DNA.
 Tahapan PCR
Merupakan proses pemisahan dua untai DNA
1) DENATURASI menjadi untai tunggal melalui pemanasan pada
(Pemanasan dan Pemisahan) suhu ± 940C. Untai tunggal DNA ini yang akan
menjadi cetakan bagi DNA baru.

Merupakan penempelan primer pada ujung DNA

2) ANNEALING target diikuti dengan pemotongan DNA target.
(Penempelan) Anneling terjadi pada suhu 540C.

Merupakan pemanjangan primer melalui

3. EXTENSION pembentukan komplemen DNA target (untai

(Pemanjangan) tunggal) dengan bantuan DNA polymerase.
Proses ini diikuti oleh proses amplifikasi DNA.
Extension terjadi pada suhu 720C.
Tahapan PCR
Siklus PCR

Satu Siklus PCR meliputi:

1. Denaturasi (1 menit)
2. Annealing (45 detik)
3. Extension (2 menit)

Metode PCR umumnya

Menggunakan 30-40 siklus.
Prosedur Kerja dengan PCR
 Post PCR - Elektroforesis
Post PCR merupakan tahapan setelah tahapan PCR yaitu berupa deteksi
hasil PCR. Ada bermacam-macam cara untuk mendeteksi hasil PCR,
salah satunya adalah dengan Elektroforesis.

Elektroforesis merupakan suatu teknik

yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan
dalam suatu medan listrik.
 Prinsip Kerja Elektroforesis
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju
kutub positif (anode) melalui media gel agarose dan dialiri arus listrik. Media
agarose diletakkan pada buffer dan kita dapat meletakkan sampel pada well.
 Cetakan wadah gel

Sumber arus listrik

searah (DC)

Comb
Platform

Well
 Gel Agarose
Gel agarosa adalah suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis ganggang

merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan kisaran ukuran

yang luas. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran

dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).

Elekroforesis gel agarosa digunakan untuk

memisahkan fragmen DNA yang antara

100bp-50 kb tergantung dari konsentrasi

gel agarose yang digunakan, medan gerak

biasanya horizontal dan mempunyai laju

pemisahan lebih cepat.

Langkah-Langkah Membuat Gel Agarose
Running Elektroforesis
 Pembacaan Hasil Elektroforesis
UV Transluminator

Print out hasil Elektroforesis

 Hasil Elektroforesis
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari
DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang
merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-
potongan jumlah pasangan basanya. Ladder sebagai acuan.

band
 Macam PCR Selain PCR Konvensional

1. Real Time PCR

2. RT PCR (Reverse Transcriptase PCR)
3. Nested RT PCR

 Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel

DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang
menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen.
Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah
diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk
kedua kalinya oleh primer yang kedua.
 Nested PCR dan PCR biasa berguna untuk memperbanyak
fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Dimana pada nested
PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa
hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu hasil fragmen
DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan
dengan PCR biasa.
Kelebihan Nested PCR :

 Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama dari
pada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi
PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR.

 Meminimalkan kesalahan amplifikasi gendengan menggunakan

2 pasang primer.
MACAM-MACAM Nested PCR
 Kelebihan dan Kelemahan PCR
+ Kelebihan
 Memiliki spesifisitas tinggi
 Sangat cepat, dapat
memberikan hasil yang sama
pada hari yang sama
 Dapat membedakan varian
mikroorganisme
 Mikroorganisme yang dideteksi
tidak harus hidup
 Mudah di set up
- Kekurangan
 Sangat mudah terkontaminasi
 Biaya peralatan dan reagen
mahal
 Interpretasi hasil PCR yang positif
belum tervalidasi untuk semua
penyakit infeksi (misalnya infeksi
pasif atau laten)
 Teknik prosedur yang kompleks
dan bertahap membutuhkan
keahlian khusus untuk
melakukannya