2019-DNA Recombinan
2019-DNA Recombinan
(GENETIC ENGINEERING)
Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme
dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)
• Kloning gen untuk menentukan fungsinya
• Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat
yang diinginkan
Ditunjang Oleh
Teknologi
melalui
Bioteknologi
Selective Breeding
Tanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak
digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut
Hybridization (Crossbreeding)
Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan
karakteristik terbaik dari keduanya.
(burung dara + perkutut = sinom)
• Insulin (diabetics)
• Factor VIII (males w/hemophilia A)
• Factor IX (hemophilia B)
• Human growth hormone
• Erythropoietin (anemia)
• Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs)
• leptin
Kesulitan pada Rekayasa Genetika
Manusia
Inserting gene in correct cells
Inserting gene so it is expressed correctly
– Orientation
– Regulation
Controlling virus vector
Ethical issues
Teknik KLONING GEN
Kloning - definisi
Penamaan enzim
EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli)
R = strain
I = # of enzyme
Penyambungan (pasting) DNA
Pembentukan
ikatan-H pada
ujung-ujung yang
komplemen (sticky
ends)
Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA
Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana
(vehicle) untuk
memasukkan suatu
potongan DNA ke dalam sel
agar DNA tersebut dapat
disimpan dan diperbanyak
di dalam sel tersebut
Vektor untuk Mengklon
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
3. Vektor Cosmid
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA berukuran sangat
besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:
Tidak terlalu mudah untuk
mengerjakan plasmid dengan ukuran
sangat besar (~ 50 kbp)
Vektor
Cosmid
4a. Vektor BAC
Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
parA and parB
mengendalikan
agar hanya
terdapat satu
vektor dalam sel
Menggunakan
penanda ketahanan
terhadap
KhloramfenikolR
4b. Vecktor YAC
large
inserts
PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid
dipaparkan kepada ion positif kalsium
klorida (CaCl2). Perlakuan ini
memberikan cekaman kepada bakteri
yang mengakibatkan membran sel dan
dinding sel bakteri tersebut menjadi
permeabel terhadap plasmid donor.
Proses ini mengakibatkan E. coli
menjadi “kompeten" untuk menerima
plasmid .
Transformasi
INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam
suspensi sel E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten
lainnya yang tidak ditambah
plasmid digunakan sebagai
kontrol.
Transformasi
PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) ditumbuhkan dalam
medium kaya nutrisi untuk memberi
kesempatan penyembuhan setelah
mengalami cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung
satu waktu generasi (untuk E. coli
berkisar antara 30 hingga 45 menit)
Transformasi
PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami
penyembuhan ditapis pada medium
padat yang mengandung senyawa
penapis berdasarkan penanda yang
dibawa oleh plasmid.
Koloni E. coli yang membawa
plasmid dengan penanda gen pendar
fluor (pGLO)
E. coli yang Membawa Plasmid pGlo
Penapisan Klon
Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang
digunakan sebagai
penanda, misalnya
Kanamisin
Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid
dengan penanda
ketahanan terhadap
Kanamisin(Kanr), yang
di sebelah kiri tidak
memilikinya
Manfaat
Contoh:
Bidang Kesehatan:
Insulin manusia
telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetis.
Merekdagang: HumulinR
Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk
mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).
Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi
secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri
Urutan sintesis protein dimulai dari DNA menjadi RNA dan
protein. Namun demikian kemajuan bidang rekayasa genetika
dapat membuat DNA dari RNA yaitu complementary DNA
(cDNA) dengan pemberian enzim transkriptase. Berikut
manakah sifat yang benar terkait cDNA ? .