CLONING DNA

Biotechnology

• biotechnology will be shown to cover a multitude

of different applications ranging from the very
simple and traditional, such as the production of
beers, wines and cheeses, to highly complex
molecular processes, such as the use of
recombinant DNA technologies to yield new drugs or
to introduce new traits into commercial crops and
animals.
• The European Federation of Biotechnology
(EFB) considers biotechnology as ‘the integration of
natural sciences and organisms, cells, parts thereof,
and molecular analogues for products and services’.
 pengertian

• Rekayasa genetika: Mengganti DNA dalam organisme hidup

untuk menciptakan sesuatu yang baru.

• Organisme ini disebut Genetically Modified Organism (GMO)

• Contoh:
• Bakteri yang menghasilkan insulin manusia

• Organisme yang dimodifikasi secara genetik disebut organisme

transgenic ; karena gen dipindahkan dari satu organisme ke
organisme lainnya.
 Teknik rekayasa

Beberapa teknik rekayasa genetika adalah sebagai berikut:

1. Seleksi buatan
A. pemuliaan selektif (selective breeding)
B. hibridisasi
C. perkawinan sedarah (inbreeding)

2. Kloning
3. Penyambungan gen (gen splicing)
4. Gel elektroforesis: menganalisis DNA
 Seleksi buatan

Seleksi buatan : peternak memilih organisme

mana yang akan dikawinkan untuk menghasilkan
keturunan dengan sifat yang diinginkan.
• Mereka tidak bisa mengendalikan gen apa
dikendalikan
• Saat mereka mendapatkan keturunan dengan
sifat yang diinginkan, maka dipertahankan
• Tiga jenis seleksi buatan:
A. pemuliaan selektif
B. Hibridisasi
• Pemuliaan selektif : bila hewan dengan
karakteristik yang diinginkan dikawinkan
untuk menghasilkan keturunan dengan
sifat yang diinginkan.
• Contoh: kuda balap, sapi dengan daging
empuk
• Pemuliaan selektif terjadi saat Anda
memilih pria dan wanita terbaik untuk
berkembang biak.
• Hal ini memungkinkan Anda untuk
menyempurnakan dan mengendalikan
sifat-sifatnya Keturunan atau bayi akan
memiliki sifat terbaik
• Sapi jenis Angus dibesarkan untuk
meningkatkan massa otot sehingga kita
mendapatkan lebih banyak daging,
 hibridisasi

• Hibridisasi yaitu dua individu dengan

karakteristik berbeda disilangkan untuk
menghasilkan yang terbaik pada kedua
organisme tersebut.
• Contoh: Luther Burbank menciptakan kentang
tahan penyakit yang disebut kentang Burbank.
• Dia menyilangkan tanaman tahan penyakit
dengan tanaman yang memiliki kapasitas
produksi besar
• Hasilnya: tanaman kentang tahan penyakit
dan produksi banyak.
Other Examples of hybridization:
1. Liger: lion and tiger mix
2. Grape + apple= grapple. The fruit tastes like grapes
and looks like apple.
 inbreeding

• In Breeding yaitu : Perkembangbiakan silang

organisme yang secara genetis mirip dengan
mempertahankan sifat yang diinginkan.
• Anjing berkembang biak murni dengan cara ini yakni :
• Doberman tetap Doberman.
• Bisa mempertahankan keunikan
• Resiko: Karena keduanya memiliki gen yang sama,
kemungkinan bayi akan mengalami kelainan genetik
resesif yang tinggi.
• Resiko: kebutaan, deformitas sendi
 In breeding

• Variasi: perbedaan antara individu suatu

spesies.
• Perbedaannya ada pada gen tapi terlihat
sebagai perbedaan fisik.
• contoh:
– Beberapa manusia memiliki rambut pirang dan
beberapa memiliki warna coklat. Ini adalah
variasi antar manusia.
– Beberapa burung pipit memiliki paruh pendek,
beberapa memiliki paruh panjang.
• Inbreeding decreases variations.
 Rekayasa genetika

REKOMBINASI REKAYASA
• Rekombinasi rekayasa/rekayasa genetika = proses
pengubahan gen dengan tujuan mendapatkan organisme
baru yang memiliki sifat sesuai yang dikehendaki.
Contoh rekayasa genetika:
1. rekombinasi DNA
2. fusi sel
3. transfer inti.  
Rekombinasi DNA

• Setiap jenis makhluk hidup memiliki DNA

• DNA dari satu spesies dapat disambungkan dengan DNA dari
spesies yang lain, dengan tujuan agar mendapatkan sifat yang baru.
• Proses penyambungan ini dikenal dengan nama rekombinasi DNA
• Contoh rekombinasi DNA
a. pembuatan insulin
b. pembuatan vaksin

Fusi Sel / Teknologi Hibridoma

 Fusi sel/teknologi hibridoma = peleburan/fusi dua sel yang berbeda
menjadi kesatuan tunggal yang mengandung gen-gen dari kedua sel
asli. 
 Sel yang dihasilkan dari fusi ini dinamakan hibridoma (hibrid = sel
asli yang dicampur, oma = kanker)
 Contoh…
Fusi sel manusia dengan tikus
• Sel limfosit manusia mampu menghasilkan antibodi, tetapi
jika dikultur dan dipelihara proses pembelahannya sangat
lambat.
• Sel manusia tersebut difusikan dengan sel kanker tikus
dengan tujuan dapat membelah dengan cepat karena sel tikus
mengandung mieloma yang mempunyai kemampuan untuk
membelah dengan cepat.
•  Hibridoma yang terbentuk akan mendapatkan antibodi (sifat
sel manusia) dan mampu untuk membelah dengan cepat (sifat
sel kanker tikus).
Fusi sel tomat dengan kentang
• Fusi sel tumbuhan sering disebut dengan fusi protoplasma.
• karena dalam fusi sel antar tumbuhan ini dinding sel tumbuhan
yang tersusun atas selulosa harus dihancurkan oleh enzim
Transfer Inti (Kloning)
• Transfer inti = proses pemindahan inti sel tubuh ke dalam
sel telur tanpa inti, sehingga sel telur tersebut akan
membelah diri dan menjadi embrio. Transfer inti disebit
juga kloning inti.
•  Contoh kloning = domba ‘Dolly’.

Transgenik
• Transgenik = tanaman yang telah direkayasa bentuk
maupun kualitasnya melalui penyisipan gen atau DNA
binatang, bakteri, mikroba, atau virus untuk tujuan
tertentu.
• Organisme transgenik adalah organisme yang
mendapatkan pindahan gen dari organisme lain.
 DNA dan RNA
• Dalam rekayasa genetika  DNA
dan RNA
• DNA (deoxyribonucleic Acid) :
DNA penyimpan informasi genetika
RNA • DNA : molekul yang sangat
Purin : Adenin (A) panjang terdiri dari ribuan
Adenin (A) deoksinukleotida (4 jenis) yang
Guanin (G) bergabung dalam suatu urutan
Guanin (G) yg bersifat khas bagi setiap
organisme
Pirimidin: Sitosin (C) • Sel eukariotik memiliki DNA
Sitosin (C) yang lebih besar dibandingkan
Timin (T) Urasil dgn prokariotik, DNA ini
(U) membentuk kromosom dalam
nukleus yang dikelilingi
Ikatan fosfodiester
membran
menggabungkan • Virus terdapat RNA atau DNA
nukleotida berikutnya • RNA dalam sel : RNA ribosom (r
RNA), RNA pemindah (t RNA)
dan RNA data (m RNA)
 kloning

• Kloning: menciptakan organisme yang

merupakan tiruan genetik individu lain.
• kembar identik adalah klon yang dibuat secara
alami.
• Clone : kelompok sel atau organisme yang
secara genetis identik sebagai hasil reproduksi
aseksual
• Mereka akan memiliki DNA persis sama dengan
induknya.
 How is cloning done?

• Sel tunggal dipisahkan dari organisme induknya.

• organisme tersebut bisa tumbuh dari sel tersebut.
• satu sel memiliki semua DNA yang dibutuhkan untuk
membuat seluruh organisme.
• Setiap sel dalam tubuh memiliki DNA yang sama,
namun sel dapat berbeda karena gen yang berbeda
di setiap sel.
 Dolly:
• Dolly was the first mammal cloned.
• She had the same exact DNA as her
mother and had no father.
• Cloning is a form of asexual
reproduction.
• Only one genetic parent.

• Karena Dolly, kucing dan organisme

lainnya telah dikloning.
• Kucing yang dikloning itu memiliki DNA
yang sama namun bulu warna berbeda
dibanding sang ibu.

• Bagaimana ini bisa terjadi?

• Lingkungan memainkan peran besar
dalam cara organisme berkembang
 Somatic or body
cells has 54
Chromosomes

Egg or ovum has

cells has 27
Chromosomes

Fused cells has 54 tricking

the cell into thinking it got
fertilized by a sperm
 Cloning manusia…???
• Langkah 1: Telur dikeluarkan dari manusia betina
– Telur bersifat haploid: 23 kromosom.
– Inti telur dikeluarkan dan dibuang.

• Langkah 2: Sel tubuh dikeluarkan dari orang lain.

– Inti sel tubuh diangkat
– Sel tubuh diploid: 46 kromosom.

• Langkah 3:
– Inti sel tubuh diploid dimasukkan ke dalam telur.
– Telur ini tidak lagi perlu dibuahi karena memiliki semua 46
kromosom.
• Langkah 4: Telur kemudian dialiri dengan listrik untuk
memulai mitosis.
• Langkah 5: Ini kemudian dimasukkan ke dalam ibu
23
46

EGG CELL Body Cell

 Keuntungan
cloning
• Anda bisa membuat salinan
pasti organisme dengan
sifat-sifat yang kuat.
• meningkatkan persediaan
makanan (tanaman dan
hewan)
• Tujuan medis : organ
kloning untuk transplantasi.
• Mengembalikan atau
menghentikan kepunahan
spesies
KELEMAHAN
CLONING
• Mengurangi keragaman
genetik
• Jika salah satu klon
terkena penyakit, mereka
semua bisa
mendapatkannya: sistem
kekebalan tubuh yang
sama.
• Tidak efisien: tingkat
kegagalan tinggi: 90% +
• Mahal
 Gen splicing

• Penyambungan gen : DNA dipotong dari

satu organisme dan dimasukkan ke
dalam organisme lain

• Sifat akan dipindahkan dari satu

organisme ke organisme lainnya.

• Misalnya: gen insulin manusia bisa

dikeluarkan dari sel manusia.
• Bisa dimasukkan ke dalam sel bakteri.
• Bakteri akan membuat insulin manusia.
The red piece the woman
is holding is an insulin
gene from a human
being. It is being
combined with DNA from
a bacteria.
Creates recombinant
DNA, something that has
never existed before.

KEUNTUNGAN :
 insulin lebih murah
 Tidak ada efek samping karena insulin
manusia.
 pernah menggunakan insulin babi tapi ada
efek samping dan harganya lebih mahal
MAKING RECOMBINANT DNA
 Cloning perlu…1) Restriction
Enzymes

Restriction Enzymes (also called Restriction

Endonucleases) are proteins that cleave
DNA molecules at specific sites, producing
discrete fragments of DNA.
Restriction Enzymes (RE) were first isolated
by Nathans and Smith in 1970.
• Restriction Enzymes are named for the
bacterial species and strain from which
they are derived.
• For instance EcoRI is isolated from E. coli R
strain and it is the first RE named from that
strain.
 Why Restriction Enzymes?

• Why would bacterial cells contain proteins

that cleave DNA at specific sequences?
– Generally restriction enzymes are thought
to protect bacterial cells from phage
(bacterial virus) infection. Bacterial cells
that contain restriction enzymes can “cut
up” invasive viral DNA without damaging
their own DNA.
 Plasmid Vectors
• Plasmids are circular pieces of DNA found naturally in
bacteria, found outside of the genome of the bacterial cell;
sometimes referred to as “extra chromosomal DNA
• Plasmids can carry antibiotic resistance genes, genes for
receptors, toxins or other proteins.
• Plasmids replicate separately from the genome of the
organism.
• Plasmids can be high- or low-copy number. High-copy
number plasmids are replicated frequently by the bacterial
host, creating many copies
• Low-copy number plasmids are replicated more slowly, so
the bacterial host cells do not contain very many copies of
the plasmid
• Plasmids can be engineered to be useful cloning vectors.
• Plasmid vectors can be designed with a variety of features:
– Antibiotic resistance
 An Overview of Recombinant DNA Technologies
1. Gene of interest (DNA) is isolated
(DNA fragment)

2. A desired gene is inserted into a

DNA molecule - vector
(plasmid, bacteriophage or a viral genome)

3. The vector inserts the DNA into a

new cell, which is grown to form a
clone.
(bacteria, yeast, plant or animal cell)

4. Large quantities of the gene product

can be harvested from the clone.
Figure 9.1.2
 Tools for Genetic engineering
1. Restriction Enzymes
• Naturally produced by bacteria – restriction endonucleases
– Natural function - destroy bacteriophage DNA in bacterial cells
– Cannot digest host DNA with methylated C (cytosine)

• A restriction enzyme
– Substrate –DNA -recognizes one particular nucleotide sequence in DNA
and cuts the DNA molecule (breaks down the bond between two
nucleotides)
sticky ends blunt ends
 2. Ligation-ligase

• Ligation is the process of joining two pieces

of DNA from different sources together
through the formation of a covalent bond.
• DNA ligase is the enzyme used to catalyze
this reaction.
• DNA ligation requires ATP.
• DNA ligase has extensive use in molecular biology
laboratories for genetic recombination experiments

ATP
 Tools for Genetic engineering
3. Vectors
• Vectors - small pieces of DNA used for cloning (the gene to be
inserted into the genetically modified organism must be combined
with other genetic elements in order for it to work properly)
• Requirements of the Vector
1. Self-replication - able to replicate in the host (origin of
repliction)
2. Cloning site (site for recognition of restriction nucleases)

3. Promoter (and operator) - to support the gene (new DNA) expression in the
host

4. Selectable marker – antibiotic resistance

5. Proper size
 Vectors

1. Plasmid vectors
– Plasmids are self-replicating circular molecules of DNA
– Encode antibiotic resistance ( selection marker)

2. Viral vectors - retroviruses, adenoviruses and herpes viruses

– Accept much larger pieces of DNA
– Mammalian hosts

Retrovirus : gol virus yang terdiri 1 benang

tunggal RNA, setelah menginfeksi sel, virus
akan membentuk replica DNA dari RNA dengan
enzim reverse transkriptase
 Antibiotic Resistance Markers

Antibiotic
Resistance
Gene
 Hosts for DNA recombinant technology
1. Bacteria
- E. coli - used because is easily grown and its
genomics are well understood.
– Gene product is purified from host cells

2. Yeasts - Saccharomyces cerevisiae

– Used because it is easily grown and its genomics are known
– May express eukaryotic genes easily
– Continuously secrete the gene product.
– Easily collected and purified

3. Plant cells and whole plants

– May express eukaryotic genes easily
– Plants are easily grown - produce plants with new properties.

4. Mammalian cells
– May express eukaryotic genes easily
 Recombinant DNA technology - Cloning
A process of producing genetically modified organisms

1. Isolating and copying the genetic material of interest (DNA

fragment ).

2. Building a construct (recombinant DNA - vector and desired gene)

containing all the genetic elements for correct expression.

3. Inserting the vector into the host organism, directly through

injection or transformation.

4. Selecting the cells expressing that gene by growing under positive

selection (of an antibiotic or chemical) – clone .

5. Growing successfully the clone (transformed organisms).

 Teknik umum DNA rekombinan
1. Kloning
• Teknik inti dalam DNA rekombinan adalah
kloning molekuler yaitu isolasi dan
pengembangbiakan fragmen DNA sejenis
• Kloning terdiri 2 tahap yaitu
1. DNA yg diinginkan atau DNA yg dimasukan,
digabungkan dgn molekul DNA yg disebut
vektor kloning utk membentuk DNA rekombinan
atau klon
2. Molekul DNA rekombinan dimasukan ke dlm sel
melalui proses transformasi. Sel inang yg
menangkap molekul DNA disebut transforman
atau sel yg ditransformasi.
 Lanjutan..DNA rekombinan
• Suatu transforman mengalami banyak
siklus pembelahan sel utk mendapatkan
koloni sel yg berasal dari sel inang pemula
(asli)
• Pada setiap siklus pembelahan, DNA
rekombinan di dalam sel juga ikut
membelah.
• Pada saat koloni sudah terbentuk
sempurna, molekul DNA rekombinan
tunggal telah membelah secara sempurna
bahkan sampai beberapa kali.
Lanjutan..DNA rekombinan
• Endonuklease
restriksi memotong
DNA pada sisi
spesifik.
• Dasar rekayasa
genetika adalah
memotong DNA
target dan vektor
pembawa/plasmid
dengan endonuklease
restriksi pada sisi
spesifik,
menyambung dengan
DNA ligase dan
transformasi ke
 Blue-white screening system

1. Plasmid vector contains the genes for:

ampR (ampicillin resistance)
Lac Z (β-galactosidase) gene

P O LacZ
cloning site
Cloning restriction site

– The cloning site (restriction enzymes site) is inserted into the β-galactosidase
gene.
P O Desired gene ~ Lac Z
– Cloning the desired gene at that site destroys β-galactosidase gene.
 Blue-white screening system
2. The vector is then transformed into host competent cell
(bacteria).
• Host is sensitive to ampicillin
• Host is β-galactosidase negative (do not carry LacZ gene)

3. The transformed cells are grown in the presence of:

• ampicillin.
• X-gal – substrate for β-galactosidase
– a colourless modified galactose sugar
– When metabolized by β-galactosidase form an insoluble
product (5-bromo-4 chloroindole) which is bright blue, and
thus functions as an indicator

4. Results
– Clones lacking the vector will not grow.
– Clones containing the vector without the new gene will be resistant to
ampicillin, able to metabolized X-gal and will be blue.
– Clones containing the recombinant vector will be resistant to ampicillin
and unable to hydrolyze X-gal (white colonies).
 Screening for the desired Gene
• Identify the particular cell that contains the specific gene of interest
(Presence of the vector with correct gene of interest)

• A short piece of labeled

DNA called a DNA probe
can be used to identify clones
carrying the desired gene.
• Radioactive labeled
• Fluorescent labeled
Labeled DNA probe ( 32P or fluorescence)

5’ *AGGCTTGTACTTTGGCGG 3’
2.  Mutagenesis
Memodifikasi gen pada organisme tersebut dengan
mengganti sekuen basa nitrogen pada DNA yang ada
untuk diganti dengan basa nitrogen lain sehingga terjadi
perubahan sifat pada organisme tersebut, contoh: semula
sifatnya tidak tahan hama menjadi tahan hama.
 Applications of recombinant DNA technology 

1. Scientific applications
– Many copies of DNA can be produced
– Increase understanding of DNA
– Identify mutations in DNA
– Alter the phenotype of an organism
– Bioinformatics is the use of computer applications to study
genetic data;
– Proteomics – proteomics is the study of a cell’s proteins.
• determination of all the proteins expressing in the cell
 Applications of recombinant DNA technology 
• Shotgun sequencing - Recombinant DNA techniques were used
to map the human genome through the Human Genome Project
- has 24 distinct chromosomes (22 autosomal + X + Y)
- with a total of approximately 3 billion DNA base pairs
– containing an estimated 20,000–25,000 genes
– with only about 1.5-2% coding for proteins
– the rest comprised by RNA genes, regulatory
sequences, introns and controversially so-called
junk DNA

– This provides tools for diagnosis and

possibly the repair of genetic diseases
 Applications of recombinant DNA technology 

2. Diagnose genetic disease

– RFLP analysis (Restriction fragment
length polymorphism)
• DNA profiling involved restriction
enzyme digestion, followed by
Southern blot analysis
– Southern blotting is used for
detection of a specific DNA sequence
in DNA sample
• DNA probes can be used to quickly
identify a pathogen in body tissue or
food.
– PCR analysis with specific primers
Applications of recombinant DNA technology  
3. Recombinant DNA techniques can be used to for genetic
fingerprinting identification
• Forensic microbiology - use
DNA fingerprinting to identify
the source of bacterial or viral
pathogens.
– bioterrorism attacks (Anthrax in U.S. Mail)
– medical negligence (Tracing HIV to
a physician who injected it)
– outbreaks of foodborne diseases

Figure 9.16