PRAKTEK KULTUR

JARINGAN TANAMAN

By :
Fitria Dewi Sulistiyono, S. Si., M. Si

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Aplikasi rekayasa genetik pada tanaman
Pengembangan teknologi DNA rekombinan utk
tan.transgenik  implikasi sangat besar pd bidang
pertanian  pemuliaan tanaman sesuai yg diinginkan.
Aspek yg dikembangkan meliputi
1. perbaikan sifat fisiologis tan. Mis. Pengubahan
kandungan as.lemak, tingkatkan kandungan provit.A.,
ubah warna bunga, penundaan pemasakan
2. pengembangan resistensi tan.thd hama dan penyakit
tanaman
3. pengembangan resistensi tan.thd herbisida
4. hasilkan protein terapeutik, antibodi monoklonal
maupun vaksin rekombinan yg diekspresikan di dlm bag.
tanaman tertentu misalnya buah
Bioteknologi
buah Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan
 KULTUR JARINGAN PADA TANAMAN

MANFAAT KULTUR JARINGAN

1. Untuk memperbanyak tanaman secara
vegetatif dan secara cepat, terutama bagi
tanaman yang sulit dibiakkan secara vegetatif
(anggrek, pisang) yang mempunyai nilai tinggi

2. Untuk pemuliaan tanaman, yaitu untuk

menghasilkan jenis- jenis tanaman baru. Tehnik ini
dikenal pula sebagai genetic engineering yaitu
menyatukan dua sel yang berbeda sifatnya.
3. Untuk mempelajari fisiologi tanaman, terutama
hubungannnya dengan penyakit tanaman.

4. Untuk mempelajari biokimia tanaman, yaitu

untuk memperoleh senyawa metabolit sekunder
(nikotin,gosipol, steroid dll).

5. farmasis dapat memperoleh senyawa aktif yang

banyak dan baik, yang dapat dijadikan senyawa
obat.
Keunggulan pemanfaatan Kultur Jaringan, yaitu:
 Pengadaan bibit tidak tergantung pada musim,

 Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak

dengan waktu yang relatif lebih cepat (dari satu
mata tunas yang sudah respon dalam 1 tahun
dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit),
 Bibit yang dihasilkan seragam,

 Bibit yang dihasilkan bebas penyakit

(menggunakan organ tertentu),
 Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan
mudah, dan
 Dalam proses pembibitan bebas dari gangguan
hama, penyakit, dan deraan lingkungan lainnya.
 LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

Mempunyai peranan penting dan diharapkan terdiri

dari 4 ruangan yaitu :

1. Ruang bahan kimia (ruang kering) untuk

menyimpan dan penimbangan, dilengkapi
dengan :
-Timbangan dengan ketelitian 5 desimal atau
0,0001 sampai 0,1 g.
- Kulkas / freezer (untuk menyimpan)
- eksikator

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

2. Ruang pembuatan Media (Ruang Basah) dilengkapi

dengan air, yaitu:
- Aqua destilator, yang lebih bagus lagi adalah
aquabidest.
-Deionizer
-Stirer, shaker
-Autoclave
- Bak pencuci

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

3. Ruang Inokulasi (penanaman), dilengkapi dengan :

- LAF (Lamina Air Flow Cabinet) yaitu aliran udara steril mengandung
lampu UV
Desinfektan (Alkohol, spiritus)
Directing het
- Lampu spiritus
- AC suhu 25 0C

4. Ruang Kultur (menumbuhkan), dilengkapi dengan :

AC (suhu antara 21- 250C ± 20C)
- Rak penyimpan botol yang sudah terisi inokulum.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

-Explant = bahan tanaman ( sel/ jaringan)
-Plantet = tanaman hasil. Setelah dihasilkan kemudian
dilakukan aklimitasi dari botol lalu dipindah ke tanah.
- Kalus adalah sekumpulan sel amorphous (tidak berbentuk
atau belum terdiferensiasi) yang terbentuk dari sel-sel yang
membelah terus menerus secara in vitro atau di dalam
tabung. Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman seperti
akar, batang dan daun.

Kalus manggis Eksplan bunga manggis Plantet

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Langkah-langkah kultur jaringan tanaman:
•Penyiapan media
•Pertumbuhan explan (bagian tanaman yang diisolasi tuk ditumbuhkan
di KJT)
•Pemberian nutrien (setiap tnmn membutuhkan tnmn yang berbeda-
beda)
• kultur sel suspensi (media cair) dengan tujuan memproduksi sel
sebanyak-banyaknya, sel suspensi langsung di ekstraksi diambil
metabolitnya
•Anherent/ melekatkan eksplan pada media tanam (media padat, sel
melekat satu sm lain) menghasilkan tanaman baru
•Sub kultur kalus (sel yg sudah membelah, dipotong lagi)
•Penyimpanan
•Pengawetan
•Pembekuan dan pencairan
•Viable cell count (perhitungan sel yg dapat tumbuh/penyortiran sel)
•Pertumbuhan dan morfologi

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Prinsip pembelahan sel

Pembelahan sel, meliputi:

1.Prophase
2.Metaphase
3.Anafase
4.Telofase
5.sitokinesis

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

OPERASIONAL KULTUR JARINGAN TANAMAN
•Jenis media yang digunakan berupa media buatan yang sudah
disesuaikan dengan kebutuhan hara, antara lain : Murashige-
Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Nitsch & Nitsch,
N6, A2, B5, dan Vancin-Went (VW).

• Masing-masing media mempunyai spesifikasi berbeda-beda

dan digunakan untuk pengerjaan jenis kultur yang berbeda-beda
pula. Sebagai contoh,
1.media VW biasanya untuk jenis kultur anggrek,
2.WPM untuk jenis tanaman keras,
3.A2 untuk kultur mikrospora dan kultur protoplas,
4.N6 untuk jenis serealia, meskipun demikian ada jenis media
yang umum untuk jenis-jenis Angiospermae yaitu media
Murashige-Skoog.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Alat dan Bahan yang digunakan dalam Kultur Jaringan Tanaman

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Unsur Hara Tanaman

Dalam kultur invitro, unsur hara diberikan

dalam bentuk persenyawaan :
 nitrogen : KNO3 atau NH4NO3
 magnesium dan belerang : MgSO4.7H2O
 fosfor : NaH2PO4.H2O atau KH2PO4
 kalium : KCl, KNO3 atau KH2PO4
 kalsium : CaCl2.2H2O

14

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Lanjutan …

•Selain unsur hara makro, tanaman juga memerlukan unsur

hara mikro seperti : besi, mangan, seng, boron, tembaga,
molibdat, dan klor.
•Stok besi disiapkan secara terpisah karena ada masalah
kelarutan untuk unsur ini, biasanya unsur besi disiapkan dalam
bentuk kelat sebagai natrium ferric ethylenediamine tetra-acetic
(NaFeEDTA)

15

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Unsur Hara Tanaman

16

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Vitamin :

 berfungsi katalitik pada sistem enzim. Satu-satunya yang

diangap esensial adalah vitamin B1 (tiamin). Niasin dan
piridoksin perlu ditambahkan karena dapat meningkatkan
pertumbuhan kultur (Gamborg dkk, 1976)
 Asam askorbat (vitamin C) sering ditambahkan sebagai
antioksidan, untuk mencegah pencoklatan kultur

17

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Asam amino
 Paling sering diapakai adalah glisin pada media kultur.
 Beberapa asam amino yang memberikan hasil positif pada
kultur adalah asam L-aspartat, L-asparagin, asam L-
glutamat, L-glutamin, dan L-arginin.

18

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Suplemen organik kompleks

 Dalam kultur invitro, seminimal mungkin dihindari bahan

dari ekstrak alami mentah, tetapi ditinjau dari sudut pandang
ilmiah, penggunaan ekstrak masih dianjurkan dan tidak dapat
diabaikan begitu saja jika senyawa murni tidak dapat
menghasilkan produk yang sesuai.
 Contoh : jus jeruk, buah pisang, jus tomat, air kelapa

19

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Sumber karbon
 Semua media invitro dilengkapi sumber karbon
sebagai sumber energi
 Sumber karbon : sukrosa atau D-glukosa
 Sukrosa yang disterilisasi dengan otoklaf
menghasilkan hasil yang berbeda jika disterilisasi
dengan filtrasi

20

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Air
• Air yang digunakan dalam media in vitro hendaknya disuling
atau didemineralisasi

Keasaman (pH) Media

 Spektrum umum 5,6-5,8 (5,9)
 Kurang dari 4,5 atau lebih 7,0 akan menghambat pertumbuhan
dan perkembangan eksplan (Pierik, 1997)
 Jika media padat : pH terlalu asam media sulit untuk padat
dan jika terlalu basa media menjadi keras

21

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Inokulasi
1. KULTUR KALUS
•Hampir semua jaringan dan organ yang mengang sel- sel hidup
dapat dirangsang untuk membentuk kalus. Walaupun hasil dan
waktunya berbeda sebelum terjadi pertumbuhan yang aktif.

•Sebelum diinokulasi kedalam media, bahan disterilkan dengan

sodium hipoklorit, dimasukkan ke dalam tabung yang berisi
media. Pekerjaan ini dilakukan dalam laminar Flow Cabinet, atau
Tranfer BOX yang sudah disterilkan dengan alkohol, formalin
atau lampu UV.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Inokulasi
1. KULTUR KALUS

Kalus adalah sekumpulan sel amorphous (tidak berbentuk atau

belum terdiferensiasi) yang terbentuk dari sel-sel yang
membelah terus menerus secara in vitro atau di dalam
tabung. [1] Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman
seperti akar, batang dan daun. [2] Secara histologi, kalus berasal
dari pembelahan berkali-kali sel-sel parenkim di sekitar berkas
pengangkut dan beberapa elemen penyusun berkas pengangkut
kecuali xilem

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor
 Inokulasi
2. KULTUR TUNAS
Bahan yang digunakan adalah mata tunas atau pucuk batang
dengan panjang ± 1 cm. Setelah disterilkan, permukaan bahan
tersebut diletakkan dibawah mikroskop stereo atau bonokuler
untuk diambil titik tumbuhnya atau titik tumbuh bersama
beberapa daun primordia atau pucuk sepanjang 0,5 cm.

3. KULTUR KANTONG TEPUNGSARI DAN

TEPUNGSARI
Bahan yang baik didapat dari tanaman yang sehat dan dari bunga
yang sedang kuncup.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 Inokulasi
Sebelum dikultur, bahan disimpan dalam suhu 7- 80 C selama 12
hari, kemudian dicuci dalam hipoklorit dan teepol selama 10
menit. Paling tepat apabila tepungsari dalam stadia pembelahan
mitosis lengkap yang pertama dan harus diuji dibawah mikroskop
sebelum dikulturkan.
4. KULTUR SEL DAN PROTOPLASMA
Kultur sel adalah dari kultur kalus yang masih muda ± 500
mg dimasukkan dalam tabung erlenmeyer yang berisi medi MS ±
1 mg1mg/ liter,1D dan sukrose yang dikocok dengan kecepatan
100 rpm pada suhu 250 C.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Kultur protoplasma bahannya diambil dari daun sehat dan
masak. Setelah disterilkan, lapisan epidermis bawah daun
dilepas dengan pinset. Pelepasan dimulai dari tengah dan
bergerak ke tepi daun. Pelepasan protoplasma dilakukan
dengan merendam bahan di dalam larutan enzim makarosim
dan kemudian diinkubasi selama 12- 18 hari pada suhu 250 C.
Setelah disaring dan dicuci dengan media MS dan monitol,
protoplasma dimasukkan dalam media MS padat.

Protoplas

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 STERILISASI
Sterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk
menghilangkan mikroorganisme.
Problema yang sering mengganggu dalam pekerjaan in vitro
adalah membuat dan menjaga kondisi aseptik.
Keadaan aseptik diperlukan dalam kultur jaringan tanaman
untuk menghindari adanya mikroorganisme yang nantinya
akan ikut tumbuh dalam media.
Apabila spora atau mikroorganisme kontak dengan media
kultur, maka mikroba tersebut dapat tumbuh dengan sangat
cepat melebihi pertumbuhan dari eksplan.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 STERILISASI
•Koloni mikroba yang terbentuk kemudian dapat
mematikan jaringan tanaman. Mikroorganisme umumnya
berupa :
•Mikroba yang ada di udara ( air bone microorganism )
•Mikroba yang ada pada alat dan tempat mengkultur
•Mikroba pada eksplan

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 STERILISASI
 Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur yanga
akan digunakan, media kultur, peralatan yang akan digunakan
dalam kegiatan penanaman eksplan dan eksplan yang akan
dikulturkan itu sendiri.
 Pemeliharaan kebersihan udara di dalam ruang kultur dan lantai
kultur dari debu itu dua hal yang sangat penting dan harus tetap
terjaga kebersihannya.
 Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan
untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering
digunakan adalah autoklaf.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 TEKNIK STERILISASI
1. Pemanasan Kering
•Pemanasan kering adalah teknik sterilisasi dengan mekanisme
membakar dinding sel dan spora mikroba alat alat yang
disterilkan. Alat yang digunakan untuk mensterilisasi adalah
dengan menggunakan oven bersuhu 160°C selama 4 jam. Alat
alat yang biasanya disterilkan dengan teknik ini harus dibungkus
lebih dulu dengan kertas alumunium foil atau kertas yang sesuai.
Bahan atau alat yang disterilkan harus tahan terhadap pemanasan
dengan suhu yang tinggi.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 TEKNIK STERILISASI
2. Pemanasan Basah
 Pemanasan basah adalah teknik sterilisasi dengan pemanasan
pada suhu yang rendah sehingga akan menyebabkan koagulasi
atau penggumpalan protein mikroorganisme. Alat yang
digunakan dalam teknik ini adalah autoclaf.
 Autoklaf adalah sterilisator uap dengan tekanan yang cukup
tinggi, alat tersebut dapat digantikan dengan alat perebus
bertekanan tinggi. Sterilisasi menggunakan autoklaf dilakukan
dengan pemanasan pada shuh 100°C, tekanan 15lb/in kuadrat
( 103,4 kPa ) selama 20-30 menit. Biasanya waktu 20 menit
digunakan untuk sterilisasi media, sedangkan 30 menit untuk
sterilisasi alat. Autoklaf dapat digunakan untuk sterilisasi media
dan alat yang tidak tahan terhadap pemanasan tinggi.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 TEKNIK STERILISASI
3. Ultra filtrasi adalah teknik sterilisasi menggunakan alat
penyaring bakteri berdiameter kurang dari 0,2µm, dengan
mekanisme menyaring komponen komponen yang termolabil.
Bahan yang disterilkan biasanya adalah zat pertumbuhan IAA
( Indol Asetat Acid ).

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

 TEKNIK STERILISASI
4. Sterilisasi Secara Kimiawi
• Sterilisasi secara kimiawi adalah teknik sterilisasi menggunakan larutan
kimia seperti;
• Etanol 70%, Isopropanol, Kalsium Hipoklorit, NaClO, Larutan Sublimat,
antibiotik dan lain sebagainya.
• Etanol 70% adalah larutan yang sering digunakan karena selain lebih murah,
kadar air yang lebih besar memungkinkan pengikatan dinding sel bakteri
lebih banyak, sehingga dinding sel bakteri dapat hancur.
• NaClO adalah suatu pemutih, dapat digunakan dengan cara diencerkan
sampai pada konsentrasi tertentu, yaitu kurang lebih 5%. Tetapi, selama
penyimpanan, Cl- akan mudah menguap, padahal Cl- lah yang berperan
sebagai pensteril.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan - Bogor

Thank You….